CN104164423B

CN104164423B - 利用rna吸附柱快速提取植物rna的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN104164423B
Application number: CN201410449503.7A
Authority: CN
Inventors: 王清水; 余彦
Original assignee: Fujian Normal University
Current assignee: Fujian Normal University
Priority date: 2014-09-05
Filing date: 2014-09-05
Publication date: 2017-01-18
Anticipated expiration: 2034-09-05
Also published as: CN104164423A

Abstract

本发明提供一种利用RNA吸附柱快速提取植物RNA的试剂盒及方法，属于生物技术领域。利用该试剂盒能够快速获得纯度高、完整性好的RNA。所述试剂盒的组成包括：裂解液、Buffer A、Buffer B、去蛋白液、漂洗液、RNA吸附柱。利用该试剂盒通过植物组织细胞的破碎、RNA的吸附，快速提取植物DNA。本发明通过采用RNA吸附柱吸附RNA，同时使用去蛋白溶液和漂洗溶液去除蛋白等杂质，可以在较短时间内获得较高纯度的植物RNA。本发明能快速获得质量较高的植物RNA。

Description

利用RNA吸附柱快速提取植物RNA的试剂盒及方法

技术领域

本发明提供一种利用RNA吸附柱快速提取植物RNA的试剂盒及方法，属于生物技术领域。

背景技术

核酸是生物遗传的物质基础，决定生物体的遗传、变异、生长和发育。在基因工程中，核酸分子是主要的研究对象，因此核酸的分离、提取是分子生物学研究中很重要的技术。从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提，要克隆基因，或是简历cDNA文库，RT-PCR以及Northern杂交等都需要有高质量的RNA。因此，从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是上述研究的关键所在。

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂硫氰酸胍，可以溶解蛋白质、破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNAase，所以RNA从细胞中释放出来时不会被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过苯酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

在提取植物RNA的过程中，常由于提取时间过长，RNA酶污染等原因造成RNA降解，使得后续试验无法进行。因此，采用一种快速植物RNA的方法对于进行RNA的相关实验至关重要。

发明内容

本发明提供一种利用RNA吸附柱快速提取植物RNA的试剂盒及方法，利用该试剂盒能够快速获得纯度高、完整性好的RNA。

本发明首先提供了一种利用RNA吸附柱快速提取植物RNA的试剂盒，所述试剂盒的组成包括：

1)裂解液：Trizol提取液；

2)Buffer A：氯仿；

3)Buffer B：70%重量比乙醇；

4)去蛋白液：5M盐酸胍，20mM Tris-HCI pH6.6，38％重量比乙醇；

5)漂洗液：20mM NaCL，2mM Tris-HCI pH7.5，80％重量比乙醇；

6)RNA吸附柱。

所述Trizol提取液配制如下： 174ml solutionD、17.4 ml 0.2M Nacl（ph4.2-4.5）、174 ml 水饱和酚、34.8 ml 氯仿、1.2 ml 2-Mercaptoethaol（b-硫基乙醇），其中solutionD的配方如下：283.5g异硫氰酸胍、2.5g月桂酸、50ml 250mM柠檬酸钠（ph7.0），加DEPC处理水至500ml。

本发明还提供了一种利用所述试剂盒快速提取植物DNA的方法，依次包括以下步骤：

（1）植物组织细胞的破碎：称取0.5g植物样品加入液氮研磨成粉状，将其迅速转入1.5ml离心管，加入1ml裂解液，振荡器震荡30秒后，加入200ul的Buffer A，振荡器震荡30秒；

（2）RNA的吸附：将细胞破碎后的样品12000rpm/min离心10min，离心后将上清吸到1.5ml离心管，加入等体积的Buffer B，混匀后将样品加到RNA吸附柱上，12000rpm/min离心1min，倒掉液体，加入500ul去蛋白液，12000rpm/min离心1min，倒掉液体，加入500ul 漂洗液，12000rpm/min离心1min，倒掉液体，再加入500ul 漂洗液，12000rpm/min离心1min，倒掉液体，吹干后加入50ul DEPC水，12000 rpm/min离心2min，收集液体。

其中所述RNA吸附柱为硅胶膜RNA吸附柱，购自北京天恩泽公司。

常规的植物RNA提取方法步骤繁琐、费时长，容易造成RNA降解。本发明通过采用RNA吸附柱吸附RNA，同时使用去蛋白溶液和漂洗溶液去除蛋白等杂质，可以在较短时间内获得较高纯度的植物RNA。本发明能快速获得质量较高的植物RNA。

采用本发明所提供的方法具有突出的特点：

1.降低了植物组织RNA的提取时间。

2.提高了植物组织RNA的提取纯度和完整性。

附图说明

图1为植物组织RNA的提取检测结果图。泳道1，2，3，4,5分别代表利用本方法提取的水稻、玉米、甘蔗、花生、小麦组织RNA电泳结果图。

具体实施方式

本发明的一种利用RNA吸附柱快速提取植物RNA的试剂盒及方法，具体步骤如下

（1）原料：称取0.5g水稻、玉米、甘蔗、花生、小麦样品。

（2）植物组织细胞的破碎：分别将样品加入液氮研磨成粉状，将其迅速转入1.5ml离心管，加入1ml Trizol提取液。振荡器震荡30秒后，加入200ul的Buffer A，振荡器震荡30秒。

（3）RNA的吸附：将样品12000rpm/min离心10min，离心后将上清吸到1.5ml离心管。加入等体积的Buffer B，混匀后将样品加到RNA吸附柱上，12000rpm/min离心1min，倒掉液体，加入500ul去蛋白液，12000rpm/min离心1min，倒掉液体，加入500ul 漂洗液，12000rpm/min离心1min，倒掉液体，加入500ul 漂洗液，12000rpm/min离心1min，倒掉液体，吹干后加入50ul DEPC水，12000 rpm/min离心2min，收集液体。通过琼脂糖凝胶电泳电测RNA。

（4）利用紫外分光光度计对提取到的植物根部RNA进行溶度以及纯度的检测。

Buffer A溶液：氯仿。

Buffer B溶液：70%乙醇。

去蛋白液溶液：5M盐酸胍，20mM Tris-HCI，pH6.6，38％乙醇。

漂洗液溶液：20mM NaCL，2mM Tris-HCI，pH7.5，80％乙醇。

植物组织RNA的提取检测结果见图1，泳道1，2，3，4,5分别代表利用本方法提取的水稻、玉米、甘蔗、花生、小麦组织RNA电泳结果图。图中的28sr RNA亮度约为18sr RNA亮度的2倍，说明本方法能够快速提取到具有较高完整性的RNA。植物根部RNA浓度以及纯度的检测结果见表1，RNA样品的OD（260:280）比值均在1.9-2.0之间，说明本方法提取的RNA具有较高的纯度，RNA样品的浓度范围在0.49μg/μl-0.62μg/μl。说明本方法能快速提取到浓度高、纯度好的植物RNA。

表1：不同植物RNA的溶度以及OD（260:280）

。

Claims

1.一种利用 RNA吸附柱快速提取植物RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组成包括：裂解液：Trizol 提取液；Buffer A：氯仿；Buffer B：70% 重量比乙醇；去蛋白液：5M 盐酸胍，20mM Tris-HCl pH6.6，38％重量比乙醇；漂洗液：20mM NaCL，2mM Tris-HCl pH7.5，80％重量比乙醇；RNA 吸附柱；

所述Trizol提取液配制如下：174ml solutionD、17.4ml 0.2M NaCl pH4.2-4.5、174ml 水饱和酚、34.8 ml 氯仿、1.2 ml β-巯基乙醇，其中solutionD的配方如下：283.5g异硫氰酸胍、2.5g月桂酸、50ml 250mM柠檬酸钠pH7.0，加DEPC处理水至500ml。

2.一种利用权利要求1所述试剂盒快速提取植物RNA 的方法，其特征在于：依次包括以下步骤：

（1）植物组织细胞的破碎：称取0.5g 植物样品加入液氮研磨成粉状，将其迅速转入1.5ml 离心管，加入1ml 裂解液，振荡器震荡30 秒后，加入200μl的Buffer A，振荡器震荡30 秒；

（2） RNA 的吸附：将细胞破碎后的样品12000r/min 离心10min，离心后将上清吸到1.5ml 离心管，加入等体积的 Buffer B，混匀后将样品加到 RNA 吸附柱上，12000r/min离心1min，倒掉液体，加入500μl 去蛋白液，12000r/min 离心1min，倒掉液体，加入500μl漂洗液，12000r/min 离心1min，倒掉液体，再加入500μl 漂洗液，12000r/min 离心1min，倒掉液体，吹干后加入50μl DEPC水，12000 r/min 离心2min，收集液体。