CN104694531A

CN104694531A - 一种从茶组织中提取总rna的方法

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Publication number: CN104694531A
Application number: CN201510125810.4A
Authority: CN
Inventors: 王学文; 仲米财; 李萌
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2015-03-20
Filing date: 2015-03-20
Publication date: 2015-06-10

Abstract

一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，该方法包括试剂盒设备提取前处理，提取步骤，质量检测。由于茶树富含多糖、多酚、油脂等次生代谢物，从中提取高质量RNA一直较为困难。本发明基于TIANGEN多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的试剂和离心柱为工具，开发了一种针对茶树总RNA的提取方法。该方法耗时短<1小时，操作易，成本低，稳定性好；解决以往茶树中RNA提取难，质量低，产量低等问题。该方法提取的茶总RNA产量高：浓度在300-2000ng/ul；质量高：28S和18S条带清晰；A260/A280值大于1.8,A260/A230值大于1.5；通过对100多个茶树的样本进行提取和后续实验证明所提RNA适合于定量PCR和转录组测序。

Description

一种从茶组织中提取总RNA的方法

技术领域

本发明属于核糖核酸(RNA)技术领域，具体涉及一种专门针对茶树总RNA的提取方法，适于于茶树高质量总RNA的提取应用。

背景技术

茶是中国重要的饮食文化的组成部分。关于茶的分子研究有助于对茶的品质改良，可以促进和提高人民的生活质量。然而相对于其他作物例如水稻，关于茶的分子研究就相当落后。这种滞后，主要原因之一是茶的DNA和RNA提取困难，尤其是茶总RNA的提取特别困难。由于茶树的种子和茶叶富含多糖、多酚、油脂等许多次生代谢物，严重影响了从茶叶和茶种子中提取高质量总RNA。现有技术中所有对茶总RNA提取方法的报道均发现茶总RNA很难提取。虽然有个别关于茶RNA的提取方法报道，但是未见任何对于所报道方法后续的大量应用。据报道改良的CTAB法可以提取茶树的总RNA，需要的时间2-3小时(Muoki,Paul et al.2012)。有报道用trizol提取茶种子中的总RNA，但是产量很低(林萍,曹永庆et al.2011；李娜娜,陆建良et al.2012；Zhou,Lin et al.2013)。与此类似，国外的报道显示trizol提取茶树中的RNA不行(Muoki,Paul et al.2012)。由于使用中需要反复更换离心管，并且往往需要大体积离心管，所以不管是CTAB还是trizol提取中都容易导致污染和RNA的降解。相比之下，柱式提取茶总RNA的技术快速，无污染。但是目前还没有利用柱式提取茶总RNA的技术。以前的报道中尝试过用柱式法提取茶总RNA，却未能成功(Muoki,Paul et al.2012)。

发明内容：

本发明的目的在于针对现有技术存在的上述不足之处，提供一种快速稳定的茶树高质量总RNA的提取方法。本发明采用多种商业柱式RNA提取试剂盒对中国的六个茶品种的组织进行了总RNA提取方法的系统研究。通过悉心钻研和反复调整，研发了一种用商业柱式RNA提取试剂盒快速从茶组织中提取高质量总RNA的方法。本发明的方法可以短时间内成功地提取了茶树的嫩叶，老叶和种子的高质量总RNA并且成功地应用于下一代的高通量的转录组测序。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，该方法包括试剂盒设备提取前处理，提取步骤，质量检测。

如所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其中所述的试剂盒设备提取前处理包括：

提取前将用到的所有离心管，药勺和研钵用0.1％DEPC纯净水浸泡12小时，铝泊纸包裹灭菌和干燥；

提取前用RNAaseZAP喷雾离心机、试验台、试管架、移液器，1分钟后用无菌纸巾拭干。

如所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其中所述的试剂盒设备提取前处理过程中的操作人员需带口罩和一次性无粉手套，用RNAaseZAP喷雾手套并拭干，使用中适时更换新手套。

如所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其中所述的提取步骤如下：

将茶树新鲜或者液氮冷冻的叶子、种子在完全预冷并装有液氮的研钵中迅速研成粉末，将1.5ml或2ml经液氮预冷过的自备离心管置于已预冷过的试管架上，将粉末迅速转移至该离心管中，转移的量为0.2-0.3ml/管,加入700μl SL，立即剧烈漩涡混匀，增加振荡时间2-5min；

将上一步的离心管至于离心机，12000rpm(～13,400×g)离心2min后，取出置于试管架；

将离心以后的上清液倒入至过滤柱CS上，12000rpm(～13,400×g)离心2min，用200μl移液器小心吸取收集管中的上清至新的1.5ml自备离心管中；

用200μl移液器缓缓加入0.4倍上清体积的无水乙醇，立即盖紧管盖，上下颠倒离心管，充分混匀，用1000μl移液器迅速将得到的溶液和沉淀一起转移到吸附柱CR3中，将吸附柱CR3放回收集管中；12000rpm(～13,400×g)离心15sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

向吸附柱中加入150-280μl去蛋白液RW1，,放置2min，12000rpm(～13,400×g)离心15sec,倒掉收集管中废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

重复上一步骤1次；

DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μl RDD溶液，轻轻混匀，向吸附柱CR3中央加入80μl DNase I工作液，室温放置15min；

向吸附柱CR3中加入250-350μl去蛋白液RW1，12000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前检查是否已加入乙醇)，12000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

重复上一步骤1次；

12000rpm(～13,400×g)离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的1.5ml自备离心管中，向吸附膜中央部位悬空滴加50μl RNase-Free ddH₂O，室温放置2min，12000rpm(～13,400×g)离心1min，得到RNA溶液，置于冰上待测或储藏于-20°冰箱暂存，长时间保存需置于-80°冰箱。

根据所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其中所述的研磨过程要保证材料不能解冻，研磨后在转移前加入更多的液氮至粉末中使粉末保持冷冻，若茶树种子在液氮中冷冻过后较为坚硬，此种情况可用研钵棒先将其砸碎为细小颗粒再行研磨。

根据所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其中所述的试剂SL使用前务必加入β-巯基乙醇至终浓度5％-10％；如不能及时加入SL，要将装有粉末的离心管置于液氮中保存；若有多管材料，离心管要置于试管架。

根据所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其中所述的过滤柱CS要放在收集管中，收集上清至新的离心管时要尽量避免吸取上层油类及下层细胞碎片沉淀，并记下转移的上清总体积的数值ul。

按照所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其中所述的试剂RW1的体积范围为150-280μl。

按照所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其中所述的加ddH2O的体积和温度范围为：50μl RNase-Free ddH2O，预先加热至40-50℃。

附图说明：

图1.为碧香早茶芽叶Nanodrop检测RNA质量峰图；

图2.为碧香早茶芽叶和种子RNA的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明实施例来进一步说明本发明的实施方式，但并不以此来限定本发明。

实施例1

提取碧香早芽叶和种子总RNA方法概述：

发明的内容包括所需试剂盒设备，提取前专有处理过程，提取操作步骤和所提的RNA质量检测四部分。具体实施方案如下:

所需试剂和设备

RNAaseZAP，DEPC，无水乙醇，β-巯基乙醇，液氮，

离心管，试管架，药勺，研钵，灭菌锅，铝泊纸，无菌纸巾，200ul移液器,1000ul移液器，200ul带过滤器的枪头，1000ul带过滤器的枪头

1.提取前专有处理过程

1.1提取前将用到的所有离心管，药勺和研钵用0.1％DEPC纯净水浸泡12小时，铝泊纸包裹灭菌和干燥。

1.2提取前用RNAaseZAP喷雾所用到设备离心机、试验台、试管架和移液器，等待1分钟后用无菌纸巾拭干。提取中操作人员带口罩和一次性无粉手套，用RNAaseZAP喷雾手套并拭干。

2.提取步骤

2.1.将80-120mg茶树新鲜或者液氮冷冻的叶子、种子等组织材料在完全预冷并装有液氮的研钵中迅速研成粉末，研磨过程保证材料不能解冻。研磨以后在转移前可以再加入更多的液氮至粉末中使粉末保持冷冻(新加到研钵中的液氮一般可以坚持3-5分钟)。茶树种子在液氮中冷冻过后较为坚硬，此种情况可用研钵棒先将其砸碎为细小颗粒再行研磨。将1.5ml或2ml经液氮预冷过的自备离心管置于已预冷过的试管架上。用液氮冷冻的药勺将粉末迅速转移至该1.5ml或2ml离心管中，转移的量为0.2-0.3ml/管,加入700μl SL(使用前务必加入β-巯基乙醇至终浓度5％-10％)，立即剧烈漩涡混匀，可适当增加振荡时间2-5min。如不能及时加入SL，将装有粉末的离心管置于液氮中保存。若有多管材料，离心管可以暂时至于试管架。粉末转移的量为0.2-0.3ml/管，适用解决了用量无法在液氮情况下称量的问题和保证了RNA产量。

2.2.将上一步的离心管至于离心机，12000rpm(～13,400×g)离心2min。离心以后，将离心管取出至于试管架。

2.3.小心地将离心以后的上清液倒入至过滤柱CS上(过滤柱放在收集管中)，12000rpm(～13,400×g)离心2min，用200μl移液器小心吸取收集管中的上清至新的1.5ml自备离心管中，尽量避免吸取上层油类及下层细胞碎片沉淀。记下转移的上清总体积的数值(ul)。

2.4.用200μl移液器缓缓加入0.4倍上清体积的无水乙醇，立即盖紧管盖，上下颠倒离心管，充分混匀，用1000μl移液器迅速将得到的溶液和沉淀一起转移到吸附柱CR3中，将吸附柱CR3放回收集管中。12000rpm(～13,400×g)离心15sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。若有多管材料，将收集管至于试管架。

2.5.向吸附柱中加入150-280μl去蛋白液RW1，,放置2min，12000rpm(～13,400×g)离心15sec,倒掉收集管中废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

2.6.重复步骤2.5一次。

2.7.DNase I工作液的配制：取10μlDNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μlRDD溶液，轻轻混匀。向吸附柱CR3中央加入80μlDNase I工作液，室温放置15min。

2.8.向吸附柱CR3中加入250-350μl去蛋白液RW1，12000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

2.9.向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前检查是否已加入乙醇)，12000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

2.10.重复步骤2.9。

2.11.2000rpm(～13,400×g)空离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的1.5ml自备离心管中，向吸附膜中央部位悬空滴加50μl RNase-Free ddH2O(预先加热至40-50℃)，室温放置2min，12000rpm(～13,400×g)离心1min，得到RNA溶液，置于冰上待测或储藏于-20°冰箱暂存，长时间保存需置于-80°冰箱。

注意：TIANGEN DP441(目录号)多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱形)，使用前注意事项及样品储存条件参考该产品说明书，操作中并注意经常更换新手套和用RNAaseZAP喷雾去除外源RNase污染。洗脱液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率，建议用50ul。如果预期RNA得率大于30μg，可将步骤12得到的RNA溶液加入吸附柱CR3中再回收一次。

3.所提的RNA质量检测

3.1.Nanodrop检测RNA质量

取1ul上述方法提取的茶叶或者茶种子的RNA在NanoDrop 1000仪器上检测，检测设定为RNA，检测峰在260nm具有完美的RNA峰型(图1)，RNA浓度在300-2000ng/ul，产量在15ug/管左右；260/230的值大于1.5，多数在1.7以上，说明RNA中的多糖杂质含量很低；260/280的值大于1.8，位于1.8-2.2之间，说明RNA中的蛋白质杂质含量很低。

3.2.琼脂糖检测RNA质量

取500ng上述方法提取的茶叶或者茶种子的RNA在1％的琼脂糖胶电泳分离，电泳电压为105V/cm，电泳时间为15min。用GELstain染色，凝胶专用紫外成像仪检测和照相。检测结果说明本方法提取的RNA琼脂糖胶电泳检测具有28S和18S两个条带，条带清晰可见，分离明显，证明RNA提取的质量高，无降解。

综合Nanodrop和琼脂糖检测RNA的质量结果说明：本方法提取茶叶或者茶果的RNA方法确实可行，所提取的的RNA质量高，无蛋白质和多糖的污染，产量高。

下面是一个利用本方法提取碧香早芽叶和种子总RNA的实例，具体说明本发明方法的使用。

实施例2

提取碧香早芽叶和种子总RNA：

1)将100mg碧香早新鲜或者液氮冷冻的芽叶、种子的组织材料在完全预冷并装有液氮的研钵中迅速研成粉末，迅速转移0.2-0.3ml粉末至2ml经液氮预冷过的离心管(本实验涉及所有离心管均需确保已完全去除RNase)，加入700μl SL(使用前务必加入β-巯基乙醇至终浓度5％-10％)，立即剧烈漩涡混匀。

2)将上一步的离心管置于离心机，12000rpm(～13,400×g)室温离心2min。

3)小心地将上清液倒入至过滤柱CS上(CS放在收集管中)，12000rpm(～13,400×g)室温离心2min。将上一步离心所得的上清吸至新的1.5ml自备离心管中，尽量避免吸取上层油类及下层细胞碎片沉淀，并记下转移的上清总体积(μl)的数值。

4)向该1.5ml离心管中加入0.4倍上清总体积的无水乙醇，缓慢混匀，迅速将得到的溶液和可能的沉淀一起转移到吸附柱CR3中(CR3放在收集管中)。12000rpm(～13,400×g)室温离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

5)向吸附柱中加入280μl去蛋白液RW1，室温静置2min，12000rpm(～13,400×g)离心15sec，倒掉收集管中废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

6)重复步骤5一次。

7)向吸附柱CR3正中加入80μl DNase I工作液，室温放置15min。附:DNase I工作液的配制：取70μl RDD溶液放入新的RNase-Free离心管中，加入10μl DNase I储存液，轻柔混匀。

8)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm(～13,400×g)室温离心15sec，倒掉收集管中废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

9)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(确保已加入无水乙醇)，12000rpm(～13,400×g)室温离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

10)重复步骤9。

11)12000rpm(～13,400×g)室温空离心2min。

12)将吸附柱CR3放入一个新的1.5ml自备离心管中，向吸附膜中央部位悬空滴加50μlRNase-Free ddH2O(已预热至40-50℃)，室温放置2min，12000rpm(～13,400×g)离心1min，即得到碧香早芽叶和种子的RNA溶液。该RNA溶液可暂时置于冰上待测或暂存于-20°冰箱，长时间保存需置于-80°冰箱。

该方法提取的碧香早芽或种子的总RNA经NanoDrop 1000仪器检测,发现RNA曲线平滑,具有单一峰(图1)，260/230的值大于1.5，多数在1.7以上(表1)，说明RNA中的多糖杂质含量很低；260/280的值大于1.8，位于1.8-2.2之间(表1)，说明RNA中的蛋白质杂质含量很低。

取500ng上述方法提取的RNA在1％的琼脂糖胶电泳，发现本方法提取的碧香早芽叶或种子RNA都具有28S和18S两个条带，且清晰可见，分离明显(图2)，证明RNA提取的质量高，无降解。

表1.碧香早茶芽叶和种子Nanodrop检测RNA质量结果

本发明的方法可以短时间内成功地提取了茶树的嫩叶，老叶和种子的高质量总RNA并且成功地应用于下一代的高通量的转录组测序。综合Nanodrop和琼脂糖检测RNA的质量结果说明：本方法提取茶叶或者茶果的RNA方法确实可行，所提取的的RNA质量高，无蛋白质和多糖的污染，产量高。

Claims

1.一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其特征在于该方法包括试剂盒设备提取前处理，提取步骤，质量检测。

2.根据权利要求1所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其特征在于所述的试剂盒设备提取前处理包括：

3.根据权利要求1所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其特征在于所述的试剂盒设备提取前处理过程中的操作人员需带口罩和一次性无粉手套，用RNAaseZAP喷雾手套并拭干，使用中适时更换新手套。

4.根据权利要求1所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其特征在于所述的提取步骤如下：

重复上一步骤1次；

12000rpm(～13,400×g)离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的1.5ml自备离心管中，向吸附膜中央部位悬空滴加50μl RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12000rpm(～13,400×g)离心1min，得到RNA溶液，置于冰上待测或储藏于-20°冰箱暂存，长时间保存需置于-80°冰箱。

5.根据权利要求4所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其特征在于所述的研磨过程要保证材料不能解冻，研磨后在转移前加入更多的液氮至粉末中使粉末保持冷冻，若茶树种子在液氮中冷冻过后较为坚硬，此种情况可用研钵棒先将其砸碎为细小颗粒再行研磨。

6.根据权利要求4所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其特征在于所述的试剂SL使用前务必加入β-巯基乙醇至终浓度5％-10％；如不能及时加入SL，要将装有粉末的离心管置于液氮中保存；若有多管材料，离心管要置于试管架。

7.根据权利要求4所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其特征在于所述的过滤柱CS要放在收集管中，收集上清至新的离心管时要尽量避免吸取上层油类及下层细胞碎片沉淀，并记下转移的上清总体积的数值ul。

8.根据权利要求4的所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其特征在于所述的试剂RW1的体积范围为150-280μl。

9.根据权利要求4的所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其特征在于所述的加ddH2O的体积和温度范围为：50μl RNase-Free ddH2O，预先加热至40-50℃。