CN106434637A - 油用牡丹种子总rna及其提取方法 - Google Patents

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崔波
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许申平
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Abstract

本发明提供了一种油用牡丹种子总RNA及其提取方法，涉及RNA提取技术领域，所述油用牡丹种子总RNA提取方法以多糖多酚植物总RNA提取试剂盒为基础，通过多次添加液氮对油用牡丹种子进行充分研磨，有利于细胞更好的破碎，防止RNA的降解；通过将定量的油用牡丹种子粉末进行分装裂解，使得分装后的每组油用牡丹种子粉末在裂解液中裂解更充分，有利于RNA的释放；采用分装过滤，使得上层的油脂和下层多糖、多酚沉淀物可以被有效去除；在吸附过程中将各组乙醇沉淀的RNA混合液合并到同一吸附柱进行处理，保证了总RNA的富集和产量；采用该法对油用牡丹种子总RNA进行提取，操作简单，用时少，所提取的RNA质量好、得率高。

Description

油用牡丹种子总RNA及其提取方法
技术领域
本发明涉及RNA提取技术领域，具体而言，涉及一种油用牡丹种子总RNA及其提取方法。
背景技术
牡丹是芍药科、芍药属牡丹组的多年生落叶小灌木，为中国的传统名花。牡丹除具有观赏和药用价值外，近年来还发现牡丹可作为粮油资源进行开发利用。牡丹籽油中富含大量不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸含量高达87.60％，其中亚油酸的含量占22.19％，亚麻酸占35.70％，油酸占27.14％，2011年国家卫生部批准牡丹籽油作为新资源食品。随着牡丹籽油产业化的发展，油用牡丹凭借其种子中含油率高的特点，已成为油用植物研究与开发的新热点。
使用分子生物学技术研究油用牡丹油脂合成代谢途径及调控的机理，可为提高油用牡丹种子的油脂含量提出可行的路径，为利用基因工程手段改良牡丹籽油油脂品质提供理论依据。从油用牡丹种子中提取高质量的RNA是进行油脂合成途径基因克隆及表达分析、种子cDNA文库构建、转录组分析(RNA-Seq)等分子生物学研究的前提和关键。但是由于油用牡丹种子中富含油脂，同时含有大量的蛋白质、多糖、多酚及成分复杂的次生代谢物，增加了RNA提取的难度，采用现有的RNA提取方法难以提取高质量、高得率的RNA。目前还未见针对油用牡丹种子总RNA提取方法的报道。
有鉴于此，特提出本发明以解决上述技术问题。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种油用牡丹种子总RNA提取方法，所述总RNA提取方法是以RNA prep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒为基础，对样品的分装、裂解、过滤以及吸附等步骤进行了改进，改进后的试剂盒法操作简单，用时少，所提取的RNA质量好、得率高，解决了采用现有技术从油用牡丹种子中提取总RNA质量差、效率低等问题。
本发明的第二个目的在于提供一种采用上述油用牡丹种子总RNA提取方法提取的总RNA，该总RNA提取质量好、得率高，能够满足后续的分子生物学试验，为开展油料植物油脂代谢分子机理的研究打下技术基础。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供一种油用牡丹种子总RNA提取方法，主要包括以下步骤：
(1)多次添加液氮对油用牡丹种子进行研磨，得到油用牡丹种子粉末；
(2)将100-150mg油用牡丹种子粉末均分2-6组，将每组油用牡丹种子粉末分别快速加入到相应的含有β-巯基乙醇的700μL裂解液SL中，分别混匀，离心，得到各组上清液a；
(3)将各组上清液a分别转移至相应的过滤柱CS，离心，得到各组上清液b；
(4)将各组上清液b分别与无水乙醇混匀得到各组混合液，将各组混合液全部转移至同一吸附柱CR3中，离心；
(5)采用去蛋白液RW1、DNase I工作液和漂洗液RW对吸附柱CR3分别进行处理后，离心，用RNase-Free ddH2O洗脱，得到总RNA溶液。
本发明的有益效果为：本发明提供的一种油用牡丹种子总RNA提取方法，所述总RNA提取方法以RNA prep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒为基础，通过多次添加液氮对油用牡丹种子进行充分研磨，有利于细胞更好的破碎，防止RNA的降解；通过将定量的油用牡丹种子粉末进行分装裂解，使得分装后的每组油用牡丹种子粉末在裂解液中裂解更为充分，有利于RNA的释放；采用分装过滤，使得上层的油脂和下层多糖、多酚沉淀物可以被有效去除；在吸附步骤中，将各组乙醇沉淀的RNA混合液合并到同一吸附柱进行处理，保证了总RNA的富集和产量；采用上述方法对传统的试剂盒法进行改进，改进后总RNA提取方法操作简单，用时少，所提取的RNA质量好、得率高，解决了采用现有技术从油用牡丹种子中提取总RNA质量差、效率低等技术问题。
进一步的，步骤(1)中，所述β-巯基乙醇在裂解液SL中的终浓度为2-10％。
进一步的，步骤(2)中，将150mg油用牡丹种子粉末均分6组，每组油用牡丹种子粉末的质量为25mg。
进一步的，步骤(4)中，所述上清液b与无水乙醇的体积比为1:0.3-0.5。
进一步的，步骤(5)具体包括如下步骤：
S1.向吸附柱CR3中加入去蛋白液RW1，离心；
S2.向吸附柱CR3中加入DNase I工作液后，室温放置；
S3.重复步骤S1；
S4.向吸附柱CR3中加入含乙醇的漂洗液RW，离心，重复一次该操作；
S5.将吸附柱CR3离心，向吸附柱CR3的吸附膜中滴加RNase-Free ddH2O，室温放置，离心，得到总RNA溶液。
进一步的，步骤(5)S5中的所述总RNA溶液于-80℃下保存。
进一步的，所述总RNA提取方法主要包括以下步骤：
(1)多次添加液氮对-80℃保存的油用牡丹种子进行研磨，得到油用牡丹种子粉末；
(2)将100-150mg油用牡丹种子粉末均分2-6组，将每组油用牡丹种子粉末分别快速加入到相应的含有β-巯基乙醇的700μL裂解液SL中，分别立即涡旋剧烈震荡混匀，于室温下12000rpm离心1-5min，得到各组上清液a；
其中，β-巯基乙醇在裂解液SL中的终浓度为2-10％；
(3)将各组上清液a分别转移至相应的过滤柱CS后，分别于室温下12000rpm离心1-5min，得到各组上清液b；
(4)将各组上清液b分别与0.3-0.5倍上清液II体积的无水乙醇混匀得到各组混合液，将各组混合液全部转入同一吸附柱CR3中，将吸附柱CR3于室温下12000rpm离心10-20s；
(5)采用去蛋白液RW1、DNase I工作液和漂洗液RW对吸附柱CR3分别进行处理，具体包括如下步骤：
S1.向吸附柱CR3中加入300-450μL去蛋白液RW1，于室温下12000rpm离心10-20s；
S2.向吸附柱CR3中加入60-100μL DNase I工作液，室温放置10-20min；
S3.重复步骤S1；
S4.向吸附柱CR3中加入400-600μL含75％乙醇的漂洗液RW，于室温下12000rpm离心10-20s，并重复一次该操作；
S5.于室温下12000rpm离心1-5min，将吸附柱CR3放入RNase-Free离心管中，向吸附柱CR3的吸附膜滴加30-50μL RNase-Free ddH2O，室温放置1-5min，并于室温下12000rpm离心1-5min，得到RNA溶液；
将所述RNA溶液于-80℃下保存。
优选的，所述总RNA提取方法具体包括以下步骤：
(1)多次添加液氮对-80℃保存的油用牡丹种子进行研磨，得到油用牡丹种子粉末；
(2)将150mg油用牡丹种子粉末均分6组，将每组油用牡丹种子粉末分别快速加入到6份含有β-巯基乙醇的700μL裂解液SL中，立即涡旋剧烈震荡混匀，分别于室温下12000rpm离心2min，得到6组上清液a；
其中，β-巯基乙醇在裂解液SL中的终浓度为5％；
(3)将6组上清液a分别转移至6个过滤柱CS后，分别于室温下12000rpm离心2min，得到6组上清液b；
(4)将6组上清液b分别与0.4倍上清液b体积的无水乙醇混匀得到6组混合液，将6组混合液全部转入同一吸附柱CR3中，将吸附柱CR3于室温下12000rpm离心15s；
(5)采用去蛋白液RW1、DNase I工作液和漂洗液RW对吸附柱CR3分别进行处理，具体包括如下步骤：
S1.向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，于室温下12000rpm离心15s；
S2.向吸附柱CR3中加入80μL DNase I工作液，室温放置15min；
S3.重复步骤S1；
S4.向吸附柱CR3中加入500μL含75％乙醇的漂洗液RW，于室温下12000rpm离心15s，并重复一次该操作；
S5.于室温下12000rpm离心2min，将吸附柱CR3放入RNase-Free离心管中，向吸附柱CR3的吸附膜滴加40μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，并于室温下12000rpm离心1min，得到RNA溶液；
将所述RNA溶液于-80℃超低温条件下保存。
更进一步的，所述总RNA提取方法包括以下步骤：
(1)多次添加液氮对-80℃保存的油用牡丹种子进行研磨，得到油用牡丹种子粉末；
(2)将150mg油用牡丹种子粉末均分6组，将每组油用牡丹种子粉末分别快速加入到6份含有β-巯基乙醇的700μL裂解液SL中，立即涡旋剧烈震荡混匀，分别于室温下12000rpm离心2min，得到6组上清液a；
其中，β-巯基乙醇在裂解液SL中的终浓度为5％；
(3)将6组上清液a分别转移至6个过滤柱CS后，分别于室温下12000rpm离心2min，得到6组上清液b；
(4)将6组上清液b分别与0.4倍上清液b体积的无水乙醇混匀得到6组混合液，将6组混合液全部转入同一吸附柱CR3中，将吸附柱CR3于室温下12000rpm离心15s；
(5)采用去蛋白液RW1、DNase I工作液和漂洗液RW对吸附柱CR3分别进行处理，主要步骤包括：
S1.向吸附柱CR3中加入去蛋白液RW1，离心；
S2.向吸附柱CR3中加入DNase I工作液后，室温放置；
S3.重复步骤S1；
S4.向吸附柱CR3中加入含乙醇的漂洗液RW，离心，重复一次该操作；
S5.将吸附柱CR3离心，向吸附柱CR3的吸附膜中滴加RNase-Free ddH2O，室温放置，离心，得到总RNA溶液。
本发明还提供一种油用牡丹种子总RNA，所述总RNA是通过上述油用牡丹种子总RNA提取方法进行提取的。
采用上述油用牡丹种子总RNA提取方法提取的RNA质量好、得率高，能够满足后续的分子生物学试验，为开展油料植物油脂代谢分子机理的研究打下技术基础。
附图说明
图1为实施例1、2、3和对比例1、2提取得到的油用牡丹种子总RNA电泳图，其中，M为DL 2000Marker；
图2为Actin基因扩增曲线图；
图3为Actin基因溶解曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
根据本发明的一个方面，提供了一种油用牡丹种子总RNA提取方法，主要包括以下步骤：
(1)多次添加液氮对油用牡丹种子进行研磨，得到油用牡丹种子粉末；
(2)将100-150mg油用牡丹种子粉末均分2-6组，将每组油用牡丹种子粉末分别快速加入到相应的含有β-巯基乙醇的700μL裂解液SL中，分别混匀，离心，得到各组上清液a；
(3)将各组上清液a分别转移至相应的过滤柱CS，离心，得到各组上清液b；
(4)将各组上清液b分别与无水乙醇混匀得到各组混合液，将各组混合液全部转移至同一吸附柱CR3中，离心；
(5)采用去蛋白液RW1、DNase I工作液和漂洗液RW对吸附柱CR3分别进行处理后，离心，用RNase-Free ddH2O洗脱，得到总RNA溶液。
本发明的有益效果为：本发明提供的一种油用牡丹种子总RNA提取方法，所述总RNA提取方法以RNA prep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒为基础，通过多次添加液氮对油用牡丹种子进行充分研磨，有利于细胞更好的破碎，防止RNA的降解使其活性降低。需要注意的是，由于超低温存储下的油用牡丹种子比较坚硬，在研磨过程中，可以先将油用牡丹种子置于液氮中，使用研杵将其砸碎，使种皮脱落，将砸碎的牡丹种子转移至新的加有液氮的研钵中并将其充分研磨成粉末。
通过将定量的油用牡丹种子粉末进行分装裂解，使得分装后的每组油用牡丹种子粉末在裂解液中裂解更为充分，有利于RNA的释放。
采用分装过滤，使得上层的油脂和下层多糖、多酚沉淀物可以被有效去除。
在吸附步骤中，将各组乙醇沉淀的RNA混合液合并到同一吸附柱进行处理，保证了RNA的富集和产量。
传统的试剂盒法经上述方法改进后，操作简单，用时少，所提取的RNA质量好、得率高，解决从油用牡丹种子中提取总RNA质量差、得率低的技术问题。
在本发明中，所述“多次”指至少一次，作为本发明的优选实施方式，添加液氮典型但非限制性的次数为1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或者更多次。
在本发明中，采用的是小量提取法，油用牡丹种子粉末的质量为100-150mg。具体的，油用牡丹种子粉末典型但非限制性的质量为100mg、105mg、110mg、116mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、144mg、145mg、148mg或150mg。
在本发明中，100-150mg油用牡丹种子粉末典型但非限制性均分组数为2组、3组、4组、5组或者6组。
在本发明的一种优选实施方式中，步骤(1)中，所述β-巯基乙醇在裂解液SL中的终浓度为2-10％。
在本发明中，所述β-巯基乙醇在裂解液SL中典型但非限制性的终浓度为2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。
在裂解液SL加入的β-巯基乙醇主要作用为抗氧化。
在本发明的一种优选实施方式中，步骤(2)中，将150mg油用牡丹种子粉末均分6组，每组油用牡丹种子粉末分装量为25mg。
油用牡丹种子组织裂解是否充分是决定RNA提取的质量和得率的首要因素，此时采用适宜的分装量可以确保裂解充分，有利于后续的提取。
在本发明的一种优选实施方式中，步骤(4)中，所述上清液b与无水乙醇的体积比为1:0.3-0.5。
在本发明中，所述上清液b与无水乙醇典型但非限制性的体积比为1:0.3、1:0.35、1:0.4、1:0.45、1:0.48或1:0.5。
对上清液b与无水乙醇的体积比进行限定，以确保无水乙醇对上清液b中的RNA进行充分沉淀。
在本发明的一种优选实施方式中，步骤(5)具体包括如下步骤：
S1.向吸附柱CR3中加入去蛋白液RW1，离心；
S2.向吸附柱CR3中加入DNase I工作液后，室温放置；
S3.重复步骤S1；
S4.向吸附柱CR3中加入含乙醇的漂洗液RW，离心，重复一次该操作；
S5.将吸附柱CR3离心，向吸附柱CR3的吸附膜中滴加RNase-Free ddH2O，室温放置，离心，得到总RNA溶液。
在本发明中，所述“室温”是指20-25℃。
在本发明的一种优选实施方式中，步骤(5)S5中的所述总RNA溶液于-80℃下保存。RNA的保存对于其下游应用试验等都非常重要，对提取的RNA溶液超低温保存，主要是防止残存的RNase或其他物质对RNA造成破坏。
步骤(5)是通过一系列快速的漂洗、离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后采用RNase-Free ddH2O将纯净RNA从吸附柱CR3上洗脱。
在本发明的一种优选实施方式中，所述总RNA提取方法主要包括以下步骤：
(1)多次添加液氮对-80℃保存的油用牡丹种子进行研磨，得到油用牡丹种子粉末；
(2)将100-150mg油用牡丹种子粉末均分2-6组，将每组油用牡丹种子粉末分别快速加入到相应的含有β-巯基乙醇的700μL裂解液SL中，立即涡旋剧烈震荡混匀，分别于室温下12000rpm离心1-5min，得到各组上清液a；
其中，β-巯基乙醇在裂解液SL中的终浓度为2-10％；
(3)将各组上清液a分别转移至相应的过滤柱CS后，分别放置在收集管中于室温下12000rpm离心1-5min，得到各组上清液b；
(4)将各组上清液b分别与0.3-0.5倍上清液b体积的无水乙醇混匀得到各组混合液(此时可能会出现沉淀)，将各组混合液全部转入同一吸附柱CR3中，将吸附柱CR3放置在收集管中于室温下12000rpm离心10-20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
(5)采用去蛋白液RW1、DNase I工作液和漂洗液RW对吸附柱CR3分别进行处理，具体包括如下步骤：
S1.向吸附柱CR3中加入300-450μL去蛋白液RW1，于室温下12000rpm离心10-20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
由于种子中蛋白质的存在，在提取总RNA的过程中，若蛋白质去除不干净，会对RNA造成污染，使其纯度浓度下降；
S2.向吸附柱CR3中加入60-100μL DNase I工作液，以除去RNA溶液中的DNA，室温放置10-20min；
其中，所述DNase I工作液由10μL DNase I存储液与70μL RDD溶液配置而成；
S3.重复步骤S1，进一步去除蛋白质；
S4.向吸附柱CR3中加入400-600μL含75％乙醇的漂洗液RW，于室温下12000rpm离心10-20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中，并重复一次该操作；
S5.于室温下12000rpm离心1-5min，将吸附柱CR3放入RNase-Free离心管中，向吸附柱CR3的吸附膜中间部位悬空滴加30-50μL RNase-Free ddH2O，室温放置1-5min，并于室温下12000rpm离心1-5min，得到RNA溶液；
将所述总RNA溶液于-80℃下保存。
需要说明的是，所述裂解液SL、过滤柱CS、吸附柱CR3、去蛋白液RW1、漂洗液RW、DNase I存储液、RDD溶液和RNase-Free ddH2O均购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为DP441。
在本发明的一种优选实施方式中，所述总RNA提取方法具体包括以下步骤：
(1)多次添加液氮对-80℃保存的油用牡丹种子进行研磨，得到油用牡丹种子粉末；
(2)将150mg油用牡丹种子粉末均分6组，将每组油用牡丹种子粉末分别快速加入到6份含有β-巯基乙醇的700μL裂解液SL中，立即涡旋剧烈震荡混匀，分别于室温下12000rpm离心2min，得到6组上清液a；
其中，β-巯基乙醇在裂解液SL中的终浓度为5％；
(3)将6组上清液a分别转移至6个过滤柱CS后，分别于室温下12000rpm离心2min，得到6组上清液b；
(4)将6组上清液b分别与0.4倍上清液b体积的无水乙醇混匀得到6组混合液，将6组混合液全部转入同一吸附柱CR3中，将吸附柱CR3于室温下12000rpm离心15s；
(5)采用去蛋白液RW1、DNase I工作液和漂洗液RW对吸附柱CR3分别进行处理，具体包括如下步骤：
S1.向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，于室温下12000rpm离心15s；
S2.向吸附柱CR3中加入80μL DNase I工作液，室温放置15min；
S3.重复步骤S1；
S4.向吸附柱CR3中加入500μL含75％乙醇的漂洗液RW，于室温下12000rpm离心15s，并重复一次该操作；
S5.于室温下12000rpm离心2min，将吸附柱CR3放入RNase-Free离心管中，向吸附柱CR3的吸附膜滴加40μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，并于室温下12000rpm离心1min，得到总RNA溶液；
将所述总RNA溶液于-80℃超低温条件下保存。
上述步骤对油用牡丹种子总RNA提取方法中的提取条件作了进一步调整，以使得所提取的总RNA提取质量更好、得率更高。
在本发明的一种优选实施方式中，所述总RNA提取方法包括以下步骤：
(1)多次添加液氮对-80℃保存的油用牡丹种子进行研磨，得到油用牡丹种子粉末；
(2)将150mg油用牡丹种子粉末均分6组，将每组油用牡丹种子粉末分别快速加入到6份含有β-巯基乙醇的700μL裂解液SL中，立即涡旋剧烈震荡混匀，分别于室温下12000rpm离心2min，得到6组上清液a；
其中，β-巯基乙醇在裂解液SL中的终浓度为5％；
(3)将6组上清液a分别转移至6个过滤柱CS后，分别于室温下12000rpm离心2min，得到6组上清液b；
(4)将6组上清液b分别与0.4倍上清液b体积的无水乙醇混匀得到6组混合液，将6组混合液全部转入同一吸附柱CR3中，将吸附柱CR3于室温下12000rpm离心15s；
(5)采用去蛋白液RW1、DNase I工作液和漂洗液RW对吸附柱CR3分别进行处理，主要步骤包括：
S1.向吸附柱CR3中加入去蛋白液RW1，离心；
S2.向吸附柱CR3中加入DNase I工作液后，室温放置；
S3.重复步骤S1；
S4.向吸附柱CR3中加入含乙醇的漂洗液RW，离心，重复一次该操作；
S5.将吸附柱CR3离心，向吸附柱CR3的吸附膜中滴加RNase-Free ddH2O，室温放置，离心，得到总RNA溶液。
根据本发明的另一个方面，还提供了一种油用牡丹种子总RNA，所述总RNA是通过上述油用牡丹种子总RNA提取方法进行提取的。
采用上述油用牡丹种子总RNA提取方法提取的RNA质量好、得率高，能够满足后续的分子生物学试验，为开展油料植物油脂代谢分子机理的研究打下技术基础。
下面结合具体实施例和对比例，对本发明作进一步说明。
实施例1、2和3均采用改进的RNA提取试剂盒法，对比例1采用CTAB法，对比例2采用Trizol法。实施例1-3和对比例1-2中所用适应用品及试剂配制说明：
油用牡丹种子于2015年7月下旬采摘自郑州师范学院实习基地，品种为凤丹，采后迅速放入液氮速冻，并于-80℃冰箱中保存；
RNA prep Pure Plant Kit多糖多酚植物总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为DP441；
RNAiso Plus Total RNA提取试剂购自TaKaRa公司(Code No.9109)；
DEPC(焦碳酸二乙酯)、CTAB、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、NaCI、Tris-HCl、EDTA(乙二胺四乙酸)、β-巯基乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、75％乙醇；
CTAB RNA提取缓冲液：2％CTAB，2％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，1.4mol/L NaCl，100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20mmol/L EDTA(pH 8.0)。
V(氯仿):V(异戊醇)＝24:1，将氯仿和异戊醇按体积比为24:1的比例混合均匀匀，并将其置于棕色试剂瓶中，4℃保存。
V(酚):V(氯仿)＝25:24，将饱和酚和氯仿按照体积比为25:24的比例混合均匀，并将其置于棕色试剂瓶中，4℃保存。
普通玻璃制品、研钵、研杵及金属药匙于200℃烘烤8h；用于RNA电泳的电泳槽、梳子、制胶板等先用去污剂洗去除干净，用双蒸水冲洗3～4遍，自然干燥后，用灭菌的0.1％DEPC水浸泡24h。
实施例1
(1)5次添加液氮对-80℃保存的油用牡丹种子进行研磨，得到油用牡丹种子粉末；
(2)将150mg油用牡丹种子粉末均分2组，每组样品的分装量为75mg,将每组油用牡丹种子粉末分别快速加入到相应的含有β-巯基乙醇的700μL裂解液SL中，立即涡旋剧烈震荡混匀，分别于室温下12000rpm离心2min，得到2组上清液a；
其中，β-巯基乙醇在裂解液SL中的终浓度为5％；
(3)将2组上清液a分别转移至2个过滤柱CS后，将2个过滤柱CS分别放置在收集管中，分别于室温下12000rpm离心2min，得到2组上清液b；
(4)将2组上清液b分别与0.4倍上清液II体积的无水乙醇混匀得到2组混合液，将2组混合液全部转入同一吸附柱CR3中，将吸附柱CR3放置在收集管中并于室温下12000rpm离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
(5)采用去蛋白液RW1、DNase I工作液和漂洗液RW对吸附柱CR3分别进行处理，具体包括如下步骤：
S1.向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，于室温下12000rpm离心15s；
S2.向吸附柱CR3中加入80μL DNase I工作液，室温放置15min；
S3.重复步骤S1；
S4.向吸附柱CR3中加入500μL含75％乙醇的漂洗液RW，于室温下12000rpm离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中，并重复一次该操作；
S5.于室温下12000rpm离心2min，将吸附柱CR3放入RNase-Free离心管中，向吸附柱CR3的吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，并于室温下12000rpm离心1min，得到总RNA溶液；
将所述总RNA溶液于-80℃下保存。
实施例2
(1)5次添加液氮对-80℃保存的油用牡丹种子进行研磨，得到油用牡丹种子粉末；
(2)将150mg油用牡丹种子粉末均分3组，每组样品的分装量为50mg,将每组油用牡丹种子粉末分别快速加入到相应的含有β-巯基乙醇的700μL裂解液SL中，立即涡旋剧烈震荡混匀，分别于室温下12000rpm离心2min，得到3组上清液a；
其中，β-巯基乙醇在裂解液SL中的终浓度为5％；
(3)将3组上清液a分别转移至3个过滤柱CS后，将3个过滤柱CS分别放置在收集管中，分别于室温下12000rpm离心2min，得到3组上清液b；
(4)将3组上清液b分别与0.4倍上清液II体积的无水乙醇混匀得到3组混合液，将3组混合液全部转入同一吸附柱CR3中，将吸附柱CR3放置在收集管中并于室温下12000rpm离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
步骤(5)～(9)与实施例1中的步骤(5)～(9)相同，此处不再赘述。
实施例3
(1)5次添加液氮对-80℃保存的油用牡丹种子进行研磨，得到油用牡丹种子粉末；
(2)将150mg油用牡丹种子粉末均分6组，每组样品的分装量为25mg,将每组油用牡丹种子粉末分别快速加入到相应的含有β-巯基乙醇的700μL裂解液SL中，立即涡旋剧烈震荡混匀，分别于室温下12000rpm离心2min，得到6组上清液a；
其中，β-巯基乙醇在裂解液SL中的终浓度为5％；
(3)将6组上清液a分别转移至6个过滤柱CS后，将6个过滤柱CS放置在收集管中，分别于室温下12000rpm离心2min，得到6组上清液b；
(4)将6组上清液b分别与0.4倍上清液II体积的无水乙醇混匀得到6组混合液，将6组混合液全部转入同一吸附柱CR3中，将吸附柱CR3放置在收集管中并于室温下12000rpm离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
步骤(5)～(9)与实施例1中的步骤(5)～(9)相同，此处不再赘述。
对比例1
本对比例提供了一种采用CTAB法对油用牡丹种子总RNA进行提取的方法，主要包括以下步骤：
(1)取-80℃冰箱保存的油用牡丹种子置于液氮中，使用研杵将其砸碎，使种皮脱落，将砸碎的牡丹种子转移至新的加有液氮的研钵中并将其充分研磨成粉末；
将150mg油用牡丹种子粉末均分3组，将每组样品分别迅速转移至65℃预热的600μL CTAB提取缓冲液中，分别涡漩混匀；
其中，β-巯基乙醇在CTAB提取缓冲液中的终浓度为2％。
(2)将混匀的3组样品置于65℃水浴中20min，其间不时涡漩震荡。
(3)分别加入等体积的氯仿/异戊醇，并涡旋混匀，于4℃下12000rpm离心10min。
(4)小心吸取上层水相，分别加入等体积的酚/氯仿，充分混匀，于4℃下12000rpm离心10min。
(5)小心吸取上层水相，分别加入等体积的氯仿/异戊醇，充分混匀，于4℃下12000rpm离心10min，并重复该步骤一次。
(6)小心吸取上层水相，分别加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，-20℃沉淀1h以上，于4℃下12000rpm离心10min。
(7)弃去上清液，分别加入1mL 75％乙醇，将3组混合液合并，洗涤沉淀，于4℃下12000rpm离心5min，并重复一次。小心倒出上清液，再次离心15s，用枪头吸取残余的乙醇，室温干燥后，加入40μL ddH2O，得到总RNA溶液，将所得总RNA溶液置于-80℃下保存。
对比例2
本对比例提供了一种采用Trizol法对油用牡丹种子总RNA进行提取的方法，主要包括以下步骤：
(1)取-80℃冰箱保存的油用牡丹种子置于液氮中，使用研杵将其砸碎，使种皮脱落，将砸碎的牡丹种子转移至新的加有液氮的研钵中并将其充分研磨成粉末；
将150mg油用牡丹种子粉末均分2组，将每组样品分别迅速转移至已1mL RNAisoPlus提取缓冲液中，分别涡漩混匀。
(2)余下步骤按照TaKaRa公司RNAiso Plus Total RNA(Code No.9109)提取试剂的说明书进行，同CTAB法，只是在步骤(7)75％乙醇洗涤步骤，将2组混合液合并，洗涤沉淀。
实验例1
取3μL RNA样品在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳检测总RNA的完整性。由图1可知，不同方法获得的RNA的完整性和条带强度均有显著差异：
采用CTAB法的对比例1提取的RNA弥散严重，没有出现28S及18S rRNA条带，说明RNA已被完全降解。同时在实验过程中也发现使用该法获得的沉淀呈黏稠状，难以溶解，这主要是由于RNA与多糖共沉淀使得RNA的得率低且完整性差；另外，在距离加样孔较近的位置有很亮的DNA条带，说明使用CTAB法提取的油用牡丹种子RNA有严重的DNA污染。虽然有报道使用CTAB-LiCl的方法能够选择性地沉淀RNA，但该方法需要LiCl低温沉淀过夜，后续还需经过沉淀溶解、酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步骤，步骤繁琐，耗时长，增加了RNA降解的风险且降低RNA的得率。
采用Trizol法的对比例2提取的RNA虽然没有DNA污染，但是28S和18S条带亮度很弱，而且弥散和降解较为严重。由于采用Trizol法获得的牡丹种子RNA与多糖共沉淀形成难溶的胶状物，说明该法也不能有效地去除油用牡丹种子中的多糖。
多糖多酚植物总RNA提取试剂盒针对富含多糖多酚的植物组织，与CTAB法和Trizol法相比，该方法更适宜于从油用牡丹种子中提取RNA，主要体现在以下几点：1、操作简便快捷，整个提取过程在1-2小时内完成，降低了RNA降解的风险；2、该方法使用的裂解液SL能够有效地将脂肪从细胞中释放出来，可以看到样品裂解离心后溶液上层漂浮着油脂层；3、在RNA过吸附柱前增加了将离心后的样品裂解液加入过滤柱这一步骤，可去除离心后吸取上清步骤中不慎吸取的上层油脂和下层沉淀，不仅可有效地防止杂质与RNA的结合，提高了RNA的纯度，也解决了吸附柱滤膜的堵塞问题；4、将DNA酶直接加入吸附柱，无需酚-氯仿抽提，操作简单，可有效地去除DNA的污染。
实施例1、2和3所采用的总RNA提取方法是在RNA prep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒基础上进行的改进。采用改进的RNA提取试剂盒法的实施例1、2和3所提取的RNA均出现了28S和18S rRNA条带，对比可知，采用实施例3(裂解时的样品分装量为25mg)时，所提取的RNA完整性最好，条带最清晰，亮度最高，没有弥散和降解。
实验例2
使用Quawell Q5000微量紫外可见分光光度计测定实施例1-3和对比例1、2的总RNA的OD260/OD280和OD260/OD230的比值，同时测定其浓度，具体结果见表1。一般来说，RNA的OD260/OD280应为1.8～2.1，低于1.7表明会有蛋白或酚污染，OD260/OD230应大于2.0，过低则表明样品受到较大的小分子及离子的干扰。
表1实施例1-3和对比例1-2所提取总RNA的纯度及浓度
组别 OD260/OD280 OD260/OD230 Conc.(ug/g)
实施例1 2.07 1.86 13.65
实施例2 2.32 1.91 21.49
实施例3 2.03 2.01 68.29
对比例1 2.12 1.54 18.56
对比例2 2.03 1.75 7.81
由表1可知，采用CTAB法的对比例1及采用Trizol法的对比例2所提取的RNA的OD260/OD230结果偏低，浓度小，说明受小分子和离子的干扰比较大；运用改进试剂盒法的实施例1-3所提取的总RNA，尤其是实施例3中，当样品分装量是25mg时，OD260/OD280比值及OD260/OD230比值符合要求，说明样品未受蛋白及酚类等物质的污染，多糖去除较为干净，纯度符合要求，且较实施例1和2来说，实施例3的得率显著提高，可以进一步满足生物分子学的研究需要。
实验例3
使用TaKaRa的PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒反转录合成cDNA第一条链。以内参基因Actin为引物进行实时荧光定量PCR检测，进一步验证所提RNA的质量。Actin引物序列为：Forward:5’-GTATCCAGCCCCTTGTCT-3’，Reverse:5’-TTGTGCTTCGTCACCTAC-3’。
采用三步法qPCR，PCR反应体系总体积为20μL，成分如下：2X SYBR Premix ExTaqTM II(TaKaRa)(10μL)、10μM PCR Forward Primer(0.8μL)、10μM PCR Reverse Primer(0.8μL)、cDNA2.0μL并补足ddH2O至20μL。q-PCR反应程序为：预变性95℃30s；95℃变性15s；退火15s；72℃延伸30s，40个循环。
为了进一步确定实施例3所提取的总RNA的完整性，对所提取的RNA分别做反转录后，用Actin基因引物对反转录产物进行实时荧光定量PCR，扩增内参基因Actin，具体如图2所示，扩增曲线有着较好的平行性，表明各管的扩增效率比较相近；由溶解曲线图3可知，其峰值比较单一，而且波峰位置重叠，TM值在80～90℃，说明没有非特异性的扩增，无引物二聚体存在，表明本试验所设计的引物与退火温度比较合适。说明用改良试剂盒法，分装量为25mg时，提取的RNA质量较好，完全可以满足于荧光定量PCR的要求，以及从分子水平上对牡丹种子中的相关基因进行深入研究的需要,为下一步目的基因的表达分析奠定了良好基础。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种油用牡丹种子总RNA提取方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)多次添加液氮对油用牡丹种子进行研磨，得到油用牡丹种子粉末；
(2)将100-150mg油用牡丹种子粉末均分2-6组，将每组油用牡丹种子粉末分别快速加入到相应的含有β-巯基乙醇的700μL裂解液SL中，分别混匀，离心，得到各组上清液a；
(3)将各组上清液a分别转移至相应的过滤柱CS，离心，得到各组上清液b；
(4)将各组上清液b分别与无水乙醇混匀得到各组混合液，将各组混合液全部转移至同一吸附柱CR3中，离心；
(5)采用去蛋白液RW1、DNase I工作液和漂洗液RW对吸附柱CR3分别进行处理后，离心，用RNase-Free ddH2O洗脱，得到总RNA溶液。
2.根据权利要求1所述的总RNA提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述β-巯基乙醇在裂解液SL中的终浓度为2-10％。
3.根据权利要求1所述的总RNA提取方法，其特征在于，步骤(2)中，将150mg油用牡丹种子粉末均分6组，每组油用牡丹种子粉末的质量为25mg。
4.根据权利要求1所述的总RNA提取方法，其特征在于，步骤(4)中，所述上清液b与无水乙醇的体积比为1:0.3-0.5。
5.根据权利要求1所述的总RNA提取方法，其特征在于，步骤(5)具体包括如下步骤：
S1.向吸附柱CR3中加入去蛋白液RW1，离心；
S2.向吸附柱CR3中加入DNase I工作液后，室温放置；
S3.重复步骤S1；
S4.向吸附柱CR3中加入含乙醇的漂洗液RW，离心，重复一次该操作；
S5.将吸附柱CR3离心，向吸附柱CR3的吸附膜中滴加RNase-Free ddH2O，室温放置，离心，得到总RNA溶液。
6.根据权利要求5所述的总RNA提取方法，其特征在于，步骤(5)S5中的所述总RNA溶液于-80℃下保存。
7.根据权利要求1所述的总RNA提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)多次添加液氮对-80℃保存的油用牡丹种子进行研磨，得到油用牡丹种子粉末；
(2)将100-150mg油用牡丹种子粉末均分2-6组，将每组油用牡丹种子粉末分别快速加入到相应的含有β-巯基乙醇的700μL裂解液SL中，分别立即涡旋剧烈震荡混匀，于室温下12000rpm离心1-5min，得到各组上清液a；
其中，β-巯基乙醇在裂解液SL中的终浓度为2-10％；
(3)将各组上清液a分别转移至相应的过滤柱CS后，分别于室温下12000rpm离心1-5min，得到各组上清液b；
(4)将各组上清液b分别与0.3-0.5倍上清液II体积的无水乙醇混匀得到各组混合液，将各组混合液全部转入同一吸附柱CR3中，将吸附柱CR3于室温下12000rpm离心10-20s；
(5)采用去蛋白液RW1、DNase I工作液和漂洗液RW对吸附柱CR3分别进行处理，具体包括如下步骤：
S1.向吸附柱CR3中加入300-450μL去蛋白液RW1，于室温下12000rpm离心10-20s；
S2.向吸附柱CR3中加入60-100μL DNase I工作液，室温放置10-20min；
S3.重复步骤S1；
S4.向吸附柱CR3中加入400-600μL含75％乙醇的漂洗液RW，于室温下12000rpm离心10-20s，并重复一次该操作；
S5.于室温下12000rpm离心1-5min，将吸附柱CR3放入RNase-Free离心管中，向吸附柱CR3的吸附膜滴加30-50μL RNase-Free ddH2O，室温放置1-5min，并于室温下12000rpm离心1-5min，得到RNA溶液；
将所述RNA溶液于-80℃下保存。
8.根据权利要求1所述的总RNA提取方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)多次添加液氮对-80℃保存的油用牡丹种子进行研磨，得到油用牡丹种子粉末；
(2)将150mg油用牡丹种子粉末均分6组，将每组油用牡丹种子粉末分别快速加入到6份含有β-巯基乙醇的700μL裂解液SL中，立即涡旋剧烈震荡混匀，分别于室温下12000rpm离心2min，得到6组上清液a；
其中，β-巯基乙醇在裂解液SL中的终浓度为5％；
(3)将6组上清液a分别转移至6个过滤柱CS后，分别于室温下12000rpm离心2min，得到6组上清液b；
(4)将6组上清液b分别与0.4倍上清液b体积的无水乙醇混匀得到6组混合液，将6组混合液全部转入同一吸附柱CR3中，将吸附柱CR3于室温下12000rpm离心15s；
(5)采用去蛋白液RW1、DNase I工作液和漂洗液RW对吸附柱CR3分别进行处理，具体包括如下步骤：
S1.向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，于室温下12000rpm离心15s；
S2.向吸附柱CR3中加入80μL DNase I工作液，室温放置15min；
S3.重复步骤S1；
S4.向吸附柱CR3中加入500μL含75％乙醇的漂洗液RW，于室温下12000rpm离心15s，并重复一次该操作；
S5.于室温下12000rpm离心2min，将吸附柱CR3放入RNase-Free离心管中，向吸附柱CR3的吸附膜滴加40μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，并于室温下12000rpm离心1min，得到RNA溶液；
将所述RNA溶液于-80℃超低温条件下保存。
9.根据权利要求1所述的总RNA提取方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)多次添加液氮对-80℃保存的油用牡丹种子进行研磨，得到油用牡丹种子粉末；
(2)将150mg油用牡丹种子粉末均分6组，将每组油用牡丹种子粉末分别快速加入到6份含有β-巯基乙醇的700μL裂解液SL中，立即涡旋剧烈震荡混匀，分别于室温下12000rpm离心2min，得到6组上清液a；
其中，β-巯基乙醇在裂解液SL中的终浓度为5％；
(3)将6组上清液a分别转移至6个过滤柱CS后，分别于室温下12000rpm离心2min，得到6组上清液b；
(4)将6组上清液b分别与0.4倍上清液b体积的无水乙醇混匀得到6组混合液，将6组混合液全部转入同一吸附柱CR3中，将吸附柱CR3于室温下12000rpm离心15s；
(5)采用去蛋白液RW1、DNase I工作液和漂洗液RW对吸附柱CR3分别进行处理，主要步骤包括：
S1.向吸附柱CR3中加入去蛋白液RW1，离心；
S2.向吸附柱CR3中加入DNase I工作液后，室温放置；
S3.重复步骤S1；
S4.向吸附柱CR3中加入含乙醇的漂洗液RW，离心，重复一次该操作；
S5.将吸附柱CR3离心，向吸附柱CR3的吸附膜中滴加RNase-Free ddH2O，室温放置，离心，得到总RNA溶液。
10.权利要求1-9任意一项所述的总RNA提取方法在油用牡丹种子中提取的总RNA。
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