CN102628039A - 一种通用植物总rna提取法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通用的植物总RNA提取的方法。RNA样品中不含有破坏RNA和抑制逆转录和PCR反应的因子。该方法广泛的适用于各类植物总RNA的提取、纯化及制备之用。而且可以对不同来源、不同生长期、不同处理、不同组织样本的RNA进行分离、纯化。尤其是普通方法难以提取的富含多糖、多酚的植物的总RNA的理想提取方法。

Description

一种通用植物总RNA提取法
技术领域
本发明属于植物分子生物学，具体涉及植物总RNA的提取，纯化方法。
背景技术
植物不仅是整个地球生态系统的重要组成部分，而且还是人类食物和工业原材料的重要来源。随着生活水平的提高，居住环境日益恶化，有限非再生资源的逐渐耗竭，不同领域的研究人员在分子水平上对植物进行着深入研究，以解决当前人类所面临的粮食、环境和能源问题。由此，各种形式的植物分子生物学研究在世界范围内展开。RNA是植物体内重要生物大分子之一，参与植物结构组成、蛋白合成、基因表达调控等，因此众多植物分子实验需对不同来源、不同生长期、不同处理、不同组织样本的RNA进行分离、纯化，如EST和全长cDNA文库构建，RT-和实时定量PCR，基因芯片分析，SAGE，RACE，Northern杂交等等。而分离、纯化RNA的质量则是这些实验成败的关键。目前市场上出售的植物RNA提取试剂及试剂盒种类很多，但这些试剂盒和试剂往往都存在提取效率低，广谱性差，提取的总RNA有多糖、蛋白和多酚的污染，降解，价格昂贵等缺点。因此，提取植物完整的总RNA往往成为各大高校、研究院等研究人员最头疼的问题。
解决的技术问题
从各种植物材料(尤其是含多糖、多酚)的任何组织中提取完整的总RNA。
发明内容
该方法提取液主要由两种特殊的变性剂组成，两种变性剂相互作用，能有效地抑制提取体系中的RNA酶活性，一种变性剂在氯仿和酚混合液存在条件下不稳定容易沉淀，并且可以与多糖多酚形成复合物，另一种变性剂在氯仿和酚混合液存在条件下相当稳定，但不与多糖和多酚形成复合物，优化后的提取液使蛋白的可溶性大大降低。因此，通过样品、提取液、氯仿和酚相互混合剧烈振荡条件下能彻底破坏植物细胞组织，有效地去除多糖、多酚和蛋白。再在优化后的沉淀剂的作用下特异地沉淀体系中的总RNA。提取的具体过程如下：
1.在1.5ml离心管中按先后顺序加入：350ul Tris-饱和酚，350ul氯仿，700ul提取液.
2.向离心管中加入液氮中粉碎后的植物材料＜0.1g，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡15-25min.(PVPP粉末可加可不加，加后有利于改善提取后总RNA的质量)
3.13000rpm，4℃离心6-8min。
4.向另一1.5ml离心管加：350ul Tris-饱和酚和350ul氯仿。将步骤3离心后的上清液完全转移至该离心管内，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡5min.
5.13000rpm，4℃离心5min。
6.取上清至另一含700ul氯仿的1.5ml离心管中，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈充分震荡5min.
7.13000rpm，4℃离心6-8min。
8.取一无RNA酶污染的1.5ml离心管，加450ul沉淀剂。将步骤7离心后的上清液(700ul)转移至该离心管，上下颠倒5-10次，冰浴4-8min.
9.10000rpm(约9000-10000×g)，4℃离心10min。
10.弃上清，加1ml 75％乙醇，涮洗管壁后14000rpm，4℃离心5min。
弃乙醇，气干后加100ulRNase-free水，充分溶解沉淀，取2ul电泳检测。(如果需要，可加1倍体积的氯仿处理一次，去除残余蛋白，用1/10体积乙酸钠和3倍体积乙醇沉淀回收总RNA，260/280比值一般都能大于2.0)。
与以往技术相比有益效果
该方法提取的植物总RNA无蛋白污染、多糖、多酚污染，并且不存在降解问题，OD260/OD280一般在2.0-2.2之间，电泳图谱中28S和18S rRNA条带的亮度比值大于2。
实例1提取杨树花芽总RNA
以杨树花芽为材料提取总RNA，杨树花芽富含多糖、多酚和黄酮类物质，用好多商业化的试剂盒很难提取无多糖、多酚和蛋白污染的总RNA.
11.在1.5ml离心管中按先后顺序加入：350ul Tris-饱和酚，350ul氯仿，700ul溶液I和100ul2-巯基乙醇.
12.向离心管中加入液氮中粉碎后的杨树花芽粉末0.1-0.25g，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡15-25min.(如果材料多酚含量高，可在液氮研磨过程中可加1/5质量的PVPP粉末)
13.13000rpm，4℃离心6-8min。
14.向另一1.5ml离心管加：350ul Tris-饱和酚和350ul氯仿。将步骤3离心后的上清液完全转移至该离心管内，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡5min.
15.13000rpm，4℃离心5min。
1.取上清至另一含700ul氯仿的1.5ml离心管中，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈充分震荡5min.
2.13000rpm，4℃离心6-8min。
3.取一无RNA酶污染的1.5ml离心管，加450ul溶液II。将步骤7离心后的上清液(700ul)转移至该离心管，上下颠倒5-10次，冰浴4-8min.
4.10000rpm(约9000-10000×g)，4℃离心10min。
5.弃上清，加1ml 75％乙醇，涮洗管壁后14000rpm，4℃离心5min。
6.弃乙醇，气干后加100ulRNase-free水，充分溶解沉淀，取1ul电泳检测。
实例2提取月季叶片总RNA
以为月季叶片材料提取总RNA，杨树花芽富含多糖、多酚和黄酮类物质，用商业化的试剂盒很根本提取不出总RNA。
7.在1.5ml离心管中按先后顺序加入：350ul Tris-饱和酚，350ul氯仿，700ul溶液I和100ul2-巯基乙醇.
8.向离心管中加入液氮中粉碎后的月季叶片粉末0.1-0.25g，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡15-25min.(如果材料多酚含量高，可在液氮研磨过程中可加1/5质量的PVPP粉末)
9.13000rpm，4℃离心6-8min。
10.向另一1.5ml离心管加：350ul Tris-饱和酚和350ul氯仿。将步骤3离心后的上清液完全转移至该离心管内，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡5min.
11.13000rpm，4℃离心5min。
12.取上清至另一含700ul氯仿的1.5ml离心管中，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈充分震荡5min.
13.13000rpm，4℃离心6-8min。
14.取一无RNA酶污染的1.5ml离心管，加450ul溶液II。将步骤7离心后的上清液(700ul)转移至该离心管，上下颠倒5-10次，冰浴4-8min.
15.10000rpm(约9000-10000×g)，4℃离心10min。
16.弃上清，加1ml 75％乙醇，涮洗管壁后14000rpm，4℃离心5min。
17.弃乙醇，气干后加100ulRNase-free水，充分溶解沉淀，取1ul电泳检测。

Claims (5)

1.一种提取植物总RNA的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)在1.5ml离心管中按先后顺序加入：350ul Tris-饱和酚，350ul氯仿，700ul提取液。
2)向离心管中加入液氮中粉碎后的植物材料＜0.1g，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡15-25min.(PVPP粉末可加可不加，加后有利于改善提取后总RNA的质量。
3)13000rpm，4℃离心6-8min。
4)向另一1.5ml离心管加：350ul Tris-饱和酚和350ul氯仿。将步骤3离心后的上清液完全转移至该离心管内，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡5min.。
5)13000rpm，4℃离心5min。
6)取上清至另一含700ul氯仿的1.5ml离心管中，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈充分震荡5min。
7)13000rpm，4℃离心6-8min。
8)取一无RNA酶污染的1.5ml离心管，加450ul沉淀剂。将步骤7离心后的上清液(700ul)转移至该离心管，上下颠倒5-10次，冰浴4-8min。9)10000rpm(约9000-10000×g)，4℃离心10min。10)弃上清，加1ml 75％乙醇，涮洗管壁后14000rpm，4℃离心5min。弃乙醇，气干后加100ulRNase-free水，充分溶解沉淀，取2ul电泳检测。(如果需要，可加1倍体积的氯仿处理一次，去除残余蛋白，用1/10体积乙酸钠和3倍体积乙醇沉淀回收总RNA，260/280比值一般都能大于2.0。
2.按照权利要求1的方法，提取液提取液包含的物质及浓度范围：
SDS  2.5％-10％CHAPS：0.1-2％NaCl：0.25M-1.5M KAc：0.25-1.5M
K2HPO4：0.25M KH2PO4：0.25M PEG4000：0.01-10％(NH4)2SO4：0.1-1M
Glycerol：0.5％-5％
其中：K2HPO4、KH2PO4为缓冲剂pH 7.5。
3.按照权利要求1的方法，提取液中沉淀剂包含的物质及浓度范围：
LiCl：4-10M
乙醇：5-50％
PEG8000：1％-20％ 。
4.按照权利要求1的方法，提取RNA的材料来源于植物。
5.按照权利要求1的方法，提取0.1克植物组织中的RNA需要提取液数量0.5-1ml。 
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