CN103993003A

CN103993003A - 一种快速提取荷花花瓣总rna的方法

Info

Publication number: CN103993003A
Application number: CN201310053848.6A
Authority: CN
Inventors: 王坤; 邓娇; 杨平仿
Original assignee: Wuhan Botanical Garden of CAS
Current assignee: Wuhan Botanical Garden of CAS
Priority date: 2013-02-20
Filing date: 2013-02-20
Publication date: 2014-08-20

Abstract

本发明公开了一种快速提取荷花花瓣总RNA的方法，涉及分子生物学领域中提取总RNA的方法。本方法主要是：用液氮研磨荷花花瓣成粉末状，加入65^oC预热的细胞裂解液破裂细胞，并添加乙酸钾溶液作为沉淀辅助剂，经氯仿抽提后离心沉淀RNA，最后用焦炭酸二乙酯处理水溶解。本发明所获得的总RNA质量和产率高；步骤简单，耗时短；试剂便宜；适用于在次级代谢产物含量高的荷花花瓣中大量提取高质量RNA。

Description

一种快速提取荷花花瓣总RNA的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域中提取总RNA（Ribonucleic Acid，核糖核酸）的方法，尤其涉及一种快速提取荷花花瓣总RNA的方法；具体地说，是以一种次级代谢产物含量高的荷花花瓣为材料，快速、经济和有效地提取高质量的总RNA的方法。

背景技术

荷花（Nelumbo nucifera），又称莲花，水芙蓉等，属睡莲科多年生水生草本花卉。荷花在我国已有近3000年的栽培历史，是一种集观赏、食用和药用于一身的重要经济作物。目前对荷花在分子生物学方面的研究还很缺乏，主要集中于分子标记研究品种多态性，一些功能基因的克隆等方面。目前，迫切需要一种有效地提取荷花花瓣的总RNA的方法，为深层地研究与花的发育、花的香气形成、花瓣中与次级代谢物合成以及荷花感光感温等相关的功能基因的研究奠定基础，进而用于培育荷花新品种。

商业化的Trizol（试剂盒）虽然能简单快速地提取植物总RNA，但是无法有效地提取荷花花瓣的总RNA，分析可能是由于RNA被多糖多酚物质吸附不能得到有效的沉淀所致。有报道利用改良的CTAB-LiCl法提取荷花花瓣的总RNA（杨峰，李创等，2009）, 但是所用试剂繁多，而且耗时也很长，增大了提取过程中RNA降解的可能性，实际使用效果欠佳。虽然快速提取植物总RNA的试剂盒采用吸附核酸的树脂或膜，但经实践证明，依然不能解决上述问题，同时存在步骤多和效率低的问题。因此，迫切需要一种简单快速且经济的提取荷花花瓣总RNA的方法以便用于后续的分子生物学实验的研究。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速提取荷花花瓣总RNA的方法。

本发明的目的是这样实现的：

包括提取RNA用具的处理、试剂的配置以及提取的具体步骤。

具体地说：

1、提取RNA用具的处理和试剂的配置

研钵、研杵和药勺用纸包好置于160 ^oC烘箱烘烤6个小时，枪头和1.5ml

的离心管用的是RNase free的Axygen公司产品（美国）；所有用到水配制的试剂都是用DEPC处理水（即0.1%的DEPC水37 ^oC处理12小时后，再经121^oC高温灭菌20min备用）。

2、具体步骤

①称取0.2g荷花花瓣于液氮预冷的研钵中迅速充分地研磨成粉末状；

②将粉末状样品转入1.5mL RNase free的离心管中，加入1mL 65^oC预热的细胞裂解液，混匀后继续65^oC温育10min，期间摇匀2～3次；

③加入300μL的乙酸钾溶液，上下温和颠倒混匀15～20次，室温静置3～5min；

④4^oC，12000rpm，离心5min，取上清于一新的离心管中；

⑤加入300μL氯仿：异戊醇=24：1（V：V），震荡15s，4^oC，12000rpm，离心30s使分层，取上层水相于一新的离心管中，重复此步骤1～2次；

⑥加入与上层水相等体积的-20^oC预冷的异丙醇，置于-20^oC冰箱30min；

⑦在4^oC、12000rpm的条件下，离心5min使RNA沉淀；

⑧移去上清，用1mL的-20^oC预冷的75%乙醇洗涤沉淀两次，在超净工作台内吹干后，加入10～20μL的DEPC（焦炭酸二乙酯）处理水溶解RNA，于-80^oC保存。

本发明的工作原理如下：

细胞裂解液中的SDS（Sodium Dodecyl Sulfonate，十二烷基磺酸钠）能破坏细胞膜，进而迅速抑制细胞内的RNA酶，从而保证释放出来的RNA的完整性。EDTA（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸）是一种金属离子螯合剂，也能抑制需要金属离子辅助的RNA酶的活性。而PVP（Polyvinyl Pyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮）和β-巯基乙醇都是还原剂，防止酚类物质被氧化而和RNA结合。

在65^oC条件下，糖类溶解在提取液的水相中。乙酸钾可以在此条件下有效地沉淀RNA，从而达到有效去除多糖并沉淀高纯度RNA之目的。氯仿可使有机相和无机相迅速分开，从而除去溶于有机相中的酚和蛋白的复合体，此外氯仿作为有机溶剂使部分蛋白变性，使之通过离心除去，而氯仿中加入少量的异戊醇（体积为1/25）可减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，从而避免影响后续操作。最后经异丙醇沉淀和75%乙醇洗涤后便可得到高质量的RNA。

本发明具有下列优点和积极效果：

①所获得的总RNA质量和产率高；

②步骤简单，耗时短；

③试剂便宜；

④适用于在次级代谢产物含量高的荷花花瓣中大量提取高质量RNA。

具体实施方式

一、细胞裂解液

1、1升细胞裂解液中含有下列组分

SDS (十二烷基硫酸钠) 　　　40克

Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐） 200毫摩尔

EDTA(乙二胺四乙酸)　　　　　　　　　　　　　　　　0.5毫摩尔

PVP (聚乙烯吡咯烷酮-40)　　　　　　　　　　　　　 20克

β-巯基乙醇　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 10毫升

其它为DEPC（焦炭酸二乙酯）处理水。

2、细胞裂解液的制备方法

①用DEPC处理水配制200毫摩尔/升的Tris－HCl缓冲液（pH7.4～7.5）置于容器中；

②依次加入SDS、EDTA、PVP和β-巯基乙醇，摇匀；

③置于冰箱内4^oC保存。

二、乙酸钾溶液

称50克乙酸钾，加入11毫升的冰醋酸，用DEPC处理水定容至100毫升，密封置于冰箱内4^oC保存。

二、实验结果

使用等质量的荷花花瓣材料，分别应用本方法，Ttizol 法和改良的CTAB-LiCl法得到荷花花瓣的总RNA，分别使用核酸测定仪（eppendorf Biophotometer plus 6132）测定其在紫外波长分别为230纳米、260纳米和280纳米的吸光值以及RNA的浓度，并计算出这三种方法所得的RNA的A₂₆₀/ A₂₈₀和A₂₆₀/ A₂₃₀的比值，结果如下：

提取方法	A₂₆₀/ A₂₈₀	A₂₆₀/ A₂₃₀	浓度（纳克/微升）
				本方法	2.06	1.89	1500
Trizol法	1.45	0.17	250
				改良CTAB-LiCl法	1.42	0.54	50

从上表可以看出，通过本方法得到的RNA的A₂₆₀/ A₂₈₀和A₂₆₀/ A₂₃₀的值以及浓度均大于Trizol法和改良的CTAB-LiCl法所得的RNA的A₂₆₀/ A₂₈₀和A₂₆₀/ A₂₃₀的值，说明通过本方法所得到的RNA的质量及含量均优于其它两种方法，即所含的多糖、多酚以及蛋白质等杂质较少，RNA的纯度较高，而且产率也较高。此外，本方法还用于提取水仙、茶花、杜鹃以及矮牵牛等的花瓣的总RNA，效果也都较好，如下表，所以本方法还适用于其它物种花瓣总RNA的提取。

物种	A₂₆₀/ A₂₈₀	A₂₆₀/ A₂₃₀	浓度（纳克/微升）
				水仙	2.06	2.03	750
茶花	1.94	1.36	200
				杜鹃	2.05	1.66	250
矮牵牛	2.05	1.95	950

本发明是一种快速、简单、有效且经济的提取荷花花瓣总RNA的方法，故本发明可作为提取荷花花瓣总RNA用于分子生物学实验研究的一种很好的选择。

Claims

1.一种快速提取荷花花瓣总RNA的方法，其特征在于包括下列步骤：

②将粉末状样品转入-1.5mL RNase free的离心管中，加入1mL 65^oC预热的细胞裂解液，混匀后继续65^oC温育10min，期间摇匀2～3次；

④4^oC，12000rpm，离心5min，取上清于一新的离心管中；

⑤加入300μL氯仿：异戊醇=24：1，震荡15s，4^oC，12000rpm，离心30s使分层，取上层水相于一新的离心管中，重复此步骤1～2次；

⑦在4^oC、12000rpm的条件下，离心5min使RNA沉淀；

⑧移去上清，用1mL的-20^oC预冷的75%乙醇洗涤沉淀两次，在超净工作台内吹干后，加入10～20μL的焦炭酸二乙酯处理水溶解RNA，于-80^oC保存；

所述的1升细胞裂解液中含有下列组分：

十二烷基硫酸钠 40克

三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 200毫摩尔

乙二胺四乙酸　　　　　　　　　　　　　0.5毫摩尔

聚乙烯吡咯烷酮　　　　　　　　　　　　20克

β-巯基乙醇　　　　　　　　　　　　　 10毫升

其它为焦炭酸二乙酯处理水。