CN103421765A - 用于叶籽银杏msap分析的dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于叶籽银杏MSAP分析的DNA提取的方法。本发明通过嫁接复壮的叶籽银杏嫩叶为材料，采用改良CTAB法进行全基因组DNA的提取，通过提高β-巯基乙醇和PVP的浓度，去除杂质并防止褐化，加入氯仿异戊醇，二次抽提，有效去除蛋白质的含量。获得了高质量和高浓度的叶籽银杏基因组DNA，用MSAP技术进行分析，显示出了DNA甲基化的多态性。此方法不仅成本低，而且可以获得高浓度的基因组DNA，为叶籽银杏表观遗传学研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别是一种用于叶籽银杏MSAP分析的DNA提取方法。
背景技术
银杏是第四纪冰川运动后现存种子植物中最古老的孑遗植物，而叶籽银杏作为银杏家族中的一个特异种质，具有重要的科研和观赏价值。目前关于叶籽银杏的研究多集中在形态特征的描述、解剖特征和细胞生物学方面，分子生物学方面的研究很少，而基因组DNA和RNA的提取是叶籽银杏分子生物学研究的基础。
目前DNA提取的方法主要有：浓盐法、阴离子去污剂法、苯酚抽提法和水抽提法。从提取原理上看主要有CTAB法和SDS法。叶籽银杏叶片具有多糖多酚等物质含量高的特点，一般DNA提取方法获得的DNA因为杂质较多无法进行MSAP的分析。DNA是叶籽银杏分子生物学研究的基础，DNA的提取对于叶籽银杏的研究有至关重要的作用，MSAP技术是以DNA为模板，通过DNA基因组的酶切、连接、预扩增、选择性扩增、和聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析叶籽银杏DNA甲基化的水平和模式变化的技术。DNA酶切是否充分是验证DNA纯度的一个重要指标。然而，叶籽银杏因为其自身的特点，DNA提取过程中多糖多酚、蛋白质、RNA污染等情况严重，严重制约了叶籽银杏的分子生物学研究。
一般的DNA提取方法在叶籽银杏基因组提取过程中存在以下不足：（1）获得的DNA浓度较低。（2）DNA纯度不高，蛋白质、多糖等杂质含量高，严重影响叶籽银杏MSAP的分析。（3）成本高，操作步骤并不简单。上述问题在一定程度上制约了叶籽银杏分子生物学的研究。截止目前，还未见成本较低、操作方便、可获得叶籽银杏较高浓度DNA的方法的报道，本发明是在这样的技术背景下提出的。
发明内容
本发明的目的是，针对叶籽银杏多糖多酚含量高的特点，为提高叶籽银杏DNA提取的质量，提出一套完整的用于叶籽银杏MSAP分析的DNA提取方法。以实现降低成本、简化操作步骤、为叶籽银杏分子生物学研究奠定基础的目的。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
（1）研钵、研锤、药匙、2ml及1.5ml离心管等高压灭菌，液氮准备，2%CTAB、TE等试剂的配制，CTAB在65℃水浴锅中预热10min以上。
（2）称新鲜嫩叶.015g-0.20g，迅速倒入预冷的研钵中，倒入液氮迅速研磨，多次研磨至粉末状，立即转入装有700μL预热CTAB的2mL离心管中，加入35μLβ-巯基乙醇和20％PVP140μL，充分混匀；
（3）65℃温浴30min以上，中间颠倒离心管摇动3-5次，取出后冷却至室温；
（4）加入等体积的氯仿异戊醇[24：1（V/V）]，轻轻颠倒混匀，室温12000rpm离心10min；
（5）吸取上清转入2mL的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，然后加入20μL3mol.L-1NaAc，一般离心管内会有棉团状DNA出现，-20℃冰箱中放置30min以上；
（6）3000rpm离心6min，弃上清，用70％乙醇洗涤2次，放置30min左右自然风干；
（7）加600μL TE充分溶解DNA；
（8）加入等体积的酚：氯仿：异戊醇[25：24：1（V/V）]，颠倒混匀，12000rpm离心10min；
（9）吸取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心10min；
（10）吸取上清转入2mL的离心管中，然后加入30μL3mol/L NaAc，一般离心管内会有棉团状DNA出现，-20℃冰箱中放置30min以上；
（11）3000rpm离心6min，弃上清，用70％乙醇洗涤2次，再用无水乙醇洗涤1次，自然风干；
（12）加60μL TE充分溶解DNA；
（13）待溶解后，加入4μL5mg/mL RNA酶，37℃水浴30min，冷却至室温，分装后4℃保存备用，-20℃长期保存；
本发明的有益效果是：
（1）由于采用了高浓度的β-巯基乙醇和PVP，从而解决了DNA中多糖多酚等杂质的污染。
（2）酚：氯仿：异戊醇和氯仿：异戊醇反复抽提，有效促进DNA的变性，同时抑制了DNase的降解，使蛋白分子溶于酚相，DNA溶于水相，同时，氯仿抽提能去除核酸溶液中的迹量酚。
（3）传统的DNA提取技术不能有效的去除叶籽银杏DNA中的杂质，并且成本高，本技术可以获得叶籽银杏高质量的DNA，以用于叶籽银杏MSAP的分析。
利用上述方法直接进行叶籽银杏DNA的提取，成本低廉，DNA浓度高、纯度好，对于 解决叶籽银杏DNA提取的问题，特别是叶籽银杏MSAP分析奠定了基础，具有重要的实用和推广意义。
附图说明
图11.0%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA模板电泳图
注：M：DNA marker;1～16不同的基因组DNA
图2叶籽银杏酶切电泳图
注：M:DNA分子量标准；H:EcoR Ⅰ+Hpa Ⅱ双酶切；M:EcoR Ⅰ+Msp Ⅰ双酶切
具体实施方式
实施例1：
本研究于2011年在山东农业大学林学院农业生态与环境实验室进行。称叶籽银杏嫩叶0.15g左右进行DNA的提取，DNA提取方法如下：
1.DNA提取准备工作
研钵、研锤、药匙、2ml及1.5ml离心管等高压灭菌，2%CTAB、NaAc等试剂的配制，液氮的准备，将配制好的CTAB在65℃水浴锅中预热10min以上。
2.称样研磨
称新鲜嫩叶.015g-0.20g，迅速倒入预冷的研钵中，倒入液氮迅速研磨，多次研磨至粉末状，立即转入装有700μL预热CTAB的2mL离心管中，加入35μLβ-巯基乙醇和20％PVP140μL，充分混匀。
3.温浴
65℃温浴30min以上，中间颠倒离心管摇动3-5次，取出后冷却至室温。
4.多次抽提、风干、溶解
（1）加入等体积的氯仿异戊醇[24：1（V/V）]，轻轻颠倒混匀，室温12000rpm离心10min。
（2）吸取上清转入2mL的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，然后加入20μL3mol.L-1NaAc，一般离心管内会有棉团状DNA出现，-20℃冰箱中放置30min以上。
（3）3000rpm离心6min，弃上清，用70％乙醇洗涤2次，放置30min左右自然风干。
（4）加600μLTE充分溶解DNA。
（5）加入等体积的酚：氯仿：异戊醇[25：24：1（V/V）]，颠倒混匀，12000rpm离心10min。
（6）吸取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心10min。
（7）吸取上清转入2mL的离心管中，然后加入30μL3mol/L NaAc，一般离心管内会有棉团状DNA出现，-20℃冰箱中放置30min以上。
（8）3000rpm离心6min，弃上清，用70％乙醇洗涤2次，再用无水乙醇洗涤1次，自然风干。
5.去RNA
加60μLTE充分溶解DNA，待溶解后，加入4μL5mg/mL RNA酶，37℃水浴30min，冷却至室温，分装后4℃保存备用，-20℃长期保存。
6.DNA质量的检测
采用1.0%TAE琼脂糖凝胶电泳检测并用限制性内切酶RcoR Ⅰ和Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ分别组合进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测观察能否充分酶切。
本发明不局限于以上实施方式，只要是在叶籽银杏DNA提取过程中采用了高浓度的β-巯基乙醇和PVP，多次氯仿异戊醇抽提等关键技术，都将落入本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种用于叶籽银杏MSAP分析的DNA提取方法，其特征在于该方法包括下述步骤：
（1）研钵、研锤、药匙、2ml及1.5ml离心管等高压灭菌，液氮准备，2%CTAB、TE等试剂的配制，CTAB在65℃水浴锅中预热10min以上；
（2）称新鲜嫩叶.015g-0.20g，迅速倒入预冷的研钵中，倒入液氮迅速研磨，多次研磨至粉末状，立即转入装有700μL预热CTAB的2mL离心管中，加入35μLβ-巯基乙醇和20％PVP140μL，充分混匀；
（3）65℃温浴30min以上，中间颠倒离心管摇动3-5次，取出后冷却至室温；
（4）加入等体积的氯仿异戊醇24：1V/V，轻轻颠倒混匀，室温12000rpm离心10min；
（5）吸取上清转入2mL的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，然后加入20μL3mol.L-1NaAc，一般离心管内会有棉团状DNA出现，-20℃冰箱中放置30min以上；
（6）3000rpm离心6min，弃上清，用70％乙醇洗涤2次，放置30min左右自然风干；
（7）加600μL TE充分溶解DNA；
（8）加入等体积的酚：氯仿：异戊醇25：24：1V/V，颠倒混匀，12000rpm离心10min；
（9）吸取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心10min；
（10）吸取上清转入2mL的离心管中，然后加入30μL3mol/L NaAc，一般离心管内会有棉团状DNA出现，-20℃冰箱中放置30min以上；
（11）3000rpm离心6min，弃上清，用70％乙醇洗涤2次，再用无水乙醇洗涤1次，自然风干；
（12）加60μL TE充分溶解DNA；
（13）待溶解后，加入4μL5mg/mL RNA酶，37℃水浴30min，冷却至室温，分装后4℃保存备用，-20℃长期保存。
2.根据权利要求1所述的一种用于叶籽银杏MSAP分析的DNA提取方法，其特征在于，所述步骤2）将叶籽银杏多次研磨至粉末状，立即转入装有700μL预热CTAB的2mL离心管中，加入35μLβ-巯基乙醇和20％PVP140μL，充分混匀。
3.根据权利要求1所述的一种用于叶籽银杏MSAP分析的DNA提取方法，其特征在于，所述步骤8）加入等体积的酚：氯仿：异戊醇25：24：1V/V，颠倒混匀，12000rpm离心10min。
4.根据权利要求1所述的一种用于叶籽银杏MSAP分析的DNA提取方法，其特征在于，所述步骤9）吸取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心10min。
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