CN103898236B - 检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的引物对、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药药材鉴别技术领域，具体涉及检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的引物对、试剂盒及方法。本发明要解决的技术问题是提供特异性的检测冬虫夏草中掺入蜡蚧轮枝菌发酵粉伪品的方法。本发明的技术方案是检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的引物对，包括用于扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对和扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对。本发明还提供了检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的试剂盒。本发明还提供了定量检测冬虫夏草超微粉及掺入蜡蚧轮枝菌发酵粉的方法。本发明可用于冬虫夏草的质量检测，具有广阔的应用前景。

Description

检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的引物对、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于商品化中药药材保健品鉴别领域，具体涉及检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的引物对、试剂盒及方法。
背景技术
冬虫夏草(Cordyceps sinensis[Berk.]Sacc.)系子囊菌纲(Ascomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草属(Cordycep)真菌寄生在鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科(Hepialidae)昆虫幼虫上所形成的子座及幼虫尸体的复合体。冬虫夏草主要分布在我国青海、西藏、云南、四川等地海拔3,000米以上的高寒草甸区，具有调节免疫系统，补肺益肾、止血化痰等功效，是我国珍稀的传统名贵中药材之一，市场价格昂贵。市场上出现了许多与冬虫夏草相似的菌粉产品，部分产品在冬虫夏草超微粉中掺入发酵粉或者直接使用发酵粉制成的产品。如何鉴定和区别并保证100％纯正冬虫夏草且无任何添加，让消费者放心食用，切实保证消费者利益，是目前亟待解决的难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供特异性的检测冬虫夏草中掺入蜡蚧轮枝菌发酵粉伪品比例的可靠方法。本发明的技术方案是检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的引物对，包括用于扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对和扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对；扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
用于扩增冬虫夏草特异DNA片段的PCR引物对：
上游引物(SEQ ID No.1)：5'GCAGTGGCATCTCTCAGTCA3'；
下游引物(SEQ ID No.2)：5'GCGTTCAAAGATTCGATGGT3'。
用于扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉伪品特异DNA片段的PCR引物对：
上游引物(SEQ ID No.3)：5’CCGGAGACCCCTAAACTCTG3’；
下游引物(SEQ ID No.4)：5’CGATGCCAGAACCAAGA GAT3’。
本发明还提供了检测冬虫夏草超微粉中添加伪品的试剂盒，包括用于扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对和扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对；扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
进一步的，所述试剂盒还包括含有冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒DC，按如下浓度独立包装：DC-12.0×106拷贝/μL、DC-24.0×105拷贝/μL、DC-38.0×104拷贝/μL、DC-41.6×104拷贝/μL、DC-53.2×103拷贝/μL。
进一步的，所述试剂盒还包括蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的标准品质粒JS，按如下浓度独立包装：JS-12.0×106拷贝/μL、JS-24.0×105拷贝/μL、JS-38.0×104拷贝/μL、JS-41.6×104拷贝/μL、JS-53.2×103拷贝/μL。
本发明还提供了检测冬虫夏草超微粉中添加伪品的方法，该方法包括以下步骤：
a、绘制标准曲线：以含冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒DC为模板，用扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对进行荧光定量PCR，得到冬虫夏草标准品质粒标准曲线；以含蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的标准品质粒JS为模板，用扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对进行荧光定量PCR，得到蜡蚧轮枝菌发酵粉标准品质粒标准曲线；
b、提取样品总DNA；
c、荧光定量PCR：以样品总DNA为模板，以扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对和扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对分别进行荧光定量PCR，依据标准曲线对样品中冬虫夏草和蜡蚧轮枝菌发酵粉扩增的荧光值进行计算，得出掺入比例。
本发明经过充分的前期实验筛选和优化，得到有效的且特异性强的PCR引物对。本发明引物对能够有效地在荧光定量PCR仪上，分别特异地扩增冬虫夏草超微粉、标准品质粒DC和蜡蚧轮枝菌发酵粉伪品、标准品质粒JS中的目标DNA片段；测定标准品在扩增过程中的荧光值，荧光定量PCR仪系统根据荧光值的变化规律生成标准曲线；依据标准曲线对样品中冬虫夏草和蜡蚧轮枝菌发酵粉伪品扩增的荧光值进行计算，得出掺入比例。在痕量检测方面具有很好的应用前景。
附图说明
图1、使用本发明引物对(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2)扩增冬虫夏草超微粉特异DNA片段和使用本发明引物对(SEQ ID No.3、SEQ ID No.4)扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)特异DNA片段的电泳图。从左至右，第1泳道为Marker2000，第2、3泳道本发明引物对(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2)扩增冬虫夏草超微粉特异DNA片段，第4、5泳道为本发明引物对(SEQ ID No.3、SEQ ID No.4)扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)特异DNA片段。
图2、使用本发明引物对(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2)扩增冬虫夏草标准品质粒DC-1、DC-2、DC-3、DC-4、DC-5的荧光定量PCR扩增曲线。
图3、使用本发明引物对(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2)扩增冬虫夏草标准品质粒DC-1、DC-2、DC-3、DC-4、DC-5绘制的标准曲线。
图4、使用本发明引物对(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2)扩增冬虫夏草标准品质粒DC-1、DC-2、DC-3、DC-4、DC-5绘制的溶解曲线。
图5、使用本发明引物对(SEQ ID No.3、SEQ ID No.4)扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)标准品质粒JS-1、JS-2、JS-3、JS-4、JS-5的荧光定量PCR扩增曲线。
图6、使用本发明引物对(SEQ ID No.3、SEQ ID No.4)扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)标准品质粒JS-1、JS-2、JS-3、JS-4、JS-5绘制的标准曲线。
图7、使用本发明引物对(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2)扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)标准品质粒DC-1、DC-2、DC-3、DC-4、DC-5绘制的溶解曲线。
图8、使用本发明引物对(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2)扩增样品1(冬虫夏草超微粉中掺入不同比例的蜡蚧轮枝菌发酵粉)的荧光定量PCR扩增曲线。
图9、使用本发明引物对(SEQ ID No.1、SEQ ID No.2)扩增1-7号样品(冬虫夏草超微粉中掺入不同比例的蜡蚧轮枝菌发酵粉)的荧光定量PCR扩增曲线。
图10、使用本发明引物对(SEQ ID No.3、SEQ ID No.4)扩增样品1(冬虫夏草超微粉中掺入不同比例的蜡蚧轮枝菌发酵粉)的荧光定量PCR扩增曲线。
图11、使用本发明引物对(SEQ ID No.3、SEQ ID No.4)扩增1-7号样品(冬虫夏草超微粉中掺入不同比例的蜡蚧轮枝菌发酵粉)的荧光定量PCR扩增曲线。
在图2～11中：Amplification Plot表示扩增曲线；Cycle表示循环数；Standard Curve表示标准曲线；Quantity表示总量；Melt Curve表示熔解曲线；Temperature表示温度。
具体实施方式
为了定量测定冬虫夏草超微粉中掺入市售蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)的比例，本项目使用真菌ITS区域特异性引物进行实时荧光PCR定量分析。发明试剂盒中制备了用于扩增冬虫夏草特异DNA片段的PCR引物对、用于扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)特异DNA片段的PCR引物对、含有冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒DC、含有蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)特异DNA片段的标准品质粒JS。将测试样品和标准样品通过两种引物对的荧光PCR扩增后，由标准曲线求得样品中蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)的掺入比例。
以下结合附图通过具体实施方式对本发明进行具体说明。
实施例1检测用PCR引物对的设计
根据GenBank上公开登录的真菌的18s-ITS1-5.8s-ITS2-28s核糖体基因序列信息进行引物的设计。
冬虫夏草的序列信息为GenBank:AB067721(Cordyceps sinensis genes for18S rRNA,ITS1,5.8S rRNA,ITS2,28S rRNA,partial and complete sequences,isolate:GYOKUJU，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB067721，SEQ ID No.5)，下划线所示为引物区域：
在177-196设计上游引物，命名为：DC-qPCR-F。序列为：5'GCAGTGGCATCTCTCAGTCA3'(SEQ ID No.1)；在305-324设计下游引物，命名为：DC-qPCR-R。序列为：5'GCGTTCAAAGATTCGATGGT3'(SEQ ID No.2)。扩增的目标序列长度为148bp。
蜡蚧轮枝菌的序列信息为GenBank:FJ515771：
(Lecanicillium lecanii isolate ICAL-718S ribosomal RNA gene,partial sequence；internal transcribed spacer1,5.8S ribosomal RNA gene,and internal transcribedspacer2,complete sequence；and28S ribosomal RNA gene,partial sequence，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/253971823？report＝genbank&log$＝nuclalign&b last_rank＝1&RID＝DZE4VU4201R&from＝37&to＝557，SEQ ID No.6)，下划线所示为引物区域：
在91-110设计上游引物，命名为：JS-qPCR-F。序列为：5'CCGGAGACCCCTAAACTCTG3'(SEQID No.3)；在175-194设计下游引物，命名为：JS-qPCR-R。序列为：5'CGATGCCAGAACCAAGAGAT3'(SEQ ID No.4)。扩增的目标序列长度为104bp。
将设计好的引物信息，委托上海捷瑞生物科技有限公司合成。SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4各合成2OD。收到引物后，12000转/分，离心1分钟，加入灭菌超纯水，制备100μM储存液，并稀释制备10μM工作液。
实施例2标准品的制备
提取虫草超微粉DNA所用试剂为“柱式真菌DNAout基因提取试剂盒”(产品编号：70901)购自北京天恩泽基因科技有限公司，按照说明书进行提取；
准确称取样品100mg，转移到1.5mL离心管中，加入1mL溶液A充分混匀，65℃保温30分钟；12,000转/分离心3分钟；转移上清到新离心管中，加入等体积的溶液B，混匀，冰浴5分钟；室温12,000转/分离心3分钟，转移上清到新的离心管中；加入0.2mL氯仿，振荡30秒混匀；室温12,000转/分离心3分钟，转移上清到新离心管中；加入1.5倍体积的溶液C，混匀，将混合液转移到离心吸附柱中，室温放置5分钟；12,000转/分离心1分钟；加入0.7mL洗柱液，室温离心1分钟；加入0.3mL洗柱液重复一次；空甩1分钟去除残留液体；将离心柱放置在一新的1.5mL离心管中，加入100μL通用洗脱液。室温放置5分钟后离心1分钟，即获得DNA溶液，-20℃保存。使用NanoDrop2000超微量分光光度计(美国Thermo Fisher公司)测定提取的DNA浓度，并将该浓度稀释成终浓度为500ng/μL。
参照前述方法分别提取冬虫夏草粉DNA和蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)DNA。分别进行PCR，扩增冬虫夏草特异DNA片段和蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)特异DNA片段，克隆到载体，制备标准品。
(一)含有冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒制备
(1)冬虫夏草特异DNA片段扩增
2×Taq PCR Master Mix(Code:F-532L)PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher公司，反应体系见表1。
表1冬虫夏草特异片段PCR反应体系
PCR反应条件如下：预变性98℃1min；98℃10sec，60℃20sec，72℃30sec，30循环；72℃5min。
PCR反应结束后，取各PCR反应产物6μL加1μL加样缓冲液(6×Loading Buffer，TaKaRaCode:9156,宝生物工程有限公司)在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。电压120V，电泳时间30min。紫外光下观察电泳结果，使用凝胶成像系统拍照记录。
(2)冬虫夏草特异DNA片段PCR产物的纯化
使用QIAquick Gel Extraction Kit凝胶回收试剂盒(Code:28706,德国Qiagen公司)纯化PCR产物。
1)制备1％的琼脂糖DNA回收凝胶，进行PCR产物电泳：电压120V，电泳时间30min。
2)电泳完毕后，在紫外观察台上，用锋利的刀片割下目的条带DNA的凝胶，尽可能去掉多余凝胶部分，放入1.5mL的离心管内并称重。
3)按每100mg凝胶加入300μL QG Buffer，置55℃水浴中10min，每2min颠倒混匀一次，使凝胶块完全溶化。
4)每100mg凝胶加入100μL异丙醇，混匀。
5)将吸附柱装入2.0mL的收集管中。
6)将溶化后的凝胶液移入吸附柱(最大容量800μL)，静置1min，12000转/分离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
7)向吸附柱中加入500μL QG Buffer，12000转/分离心1min，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。
8)向吸附柱中加入750μL PE Buffer，静置1min，12000转/分离心1min，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中；12000转/分再离心2min。
9)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入20μL ddH2O，静置3min，12000转/分离心1min。将所得的PCR纯化产物-20℃保存。
(3)PCR产物与载体的连接
大部分DNA聚合酶在扩增结束时会在DNA3’末端加A，形成粘性末端，与T粘性末端的DNA在连接酶的催化下，可迅速连接。连接反应体系为TakaRa公司产品，所用质粒载体为pMDTM18-T载体(TaKaRaCode:6011,宝生物工程有限公司)。连接反应体系见表2。
表2连接反应体系
(4)重组子转化与阳性克隆筛选
1)取出-70℃保存的1支100μL的感受态细胞E.coli JM109Competent Cells(Code:9052,宝生物工程有限公司)，冰浴30min。
2)加入2μL连接产物，用移液器轻轻混匀，冰浴30min。
3)42℃水浴热激90sec，立即冰浴2min。
4)加800μL液体SOC培养基，37℃孵育50min。
5)涂30μL X-Gal及20μL IPTG于琼脂平板上，37℃60min。
6)取200μL菌液涂在预先涂有X-gal及IPTG的Amp琼脂糖平板上，37℃过夜培养。
7)转化过夜培养的平板于4℃放置3hr，挑选白色克隆，接种到盛有5mL LB液体培养基的玻璃试管中，37℃恒温振荡(200转/分)，过夜培养。
(5)质粒DNA的提取
8)用1.5mL离心管分次收集在LB培养基中培养过夜的菌液。
9)加入250μL的Solution I充分悬浮细菌沉淀。
10)加入350μL的Solution II，盖紧管口，快速倒置、震荡10sec。
11)加入250μL的Solution III，盖紧管口，快速倒置后温和震荡10sec，使SolutionIII在粘稠的细菌裂解物中分散均匀。
12)细菌裂解物室温12000转/分离心10min，将吸附柱装入2mL的收集管中待用。
13)将上清液小心移入吸附柱(最大容量800μL)，静置1min，12000转/分离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
14)向吸附柱中加入750μL PE Buffer，静置1min，12000转/分离心1min，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。
15)再次向吸附柱中加入500μL PE Buffer，静置1min，12000转/分离心1min，倒掉收集管中的液体。
16)将吸附柱放入同一个收集管中，12000转/分再离心2min。
17)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入20μL ddH2O，静置3min，14000转/分离心1min，-20℃保存。
(6)阳性克隆的鉴定
pMDTM18-T载体(TaKaRaCode:6011,宝生物工程有限公司)两端含有通用引物位点，通过质粒PCR(M13引物M47和M48,TaKaRaCode:3830B,宝生物工程有限公司)确认其中含有目的片段基因的阳性克隆，反应体系见表3。反应程序：95℃，3min；95℃，30sec，55℃，30sec，72℃，30sec，30循环；72℃，10min。
表3质粒鉴定PCR反应体系
PCR反应结束后，取各PCR反应产物5μL加1μL加样缓冲液(6×Loading Buffer，TaKaRaCode:9156,宝生物工程有限公司)在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。电压120V，电泳时间30min。紫外光下观察电泳结果，使用凝胶成像系统拍照记录，并进行测序。
(二)含有蜡蚧轮枝菌特异DNA片段的标准品质粒制备
(1)蜡蚧轮枝菌特异DNA片段扩增
2×Taq PCR Master Mix(Code:F-532L)PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher公司。反应体系见表4。PCR反应条件如下：预变性98℃1min；98℃10sec，60℃20sec，72℃30sec，30循环；72℃5min。
表4蜡蚧轮枝菌特异DNA片段PCR反应体系
PCR反应结束后，取各PCR反应产物6μL加1μL加样缓冲液(6×Loading Buffer，TaKaRaCode:9156,宝生物工程有限公司)在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。电压120V，电泳时间30min。紫外光下观察电泳结果，使用凝胶成像系统拍照记录(见图1)。
(2)蜡蚧轮枝菌特异DNA片段PCR反应产物的纯化
使用QIAquick Gel Extraction Kit凝胶回收试剂盒(Code:28706，德国Qiagen公司)纯化PCR产物。
1)制备1％的琼脂糖DNA回收凝胶，进行PCR产物电泳：电压120V，电泳时间30min。
2)电泳完毕后，在紫外观察台上，用锋利的刀片割下目的条带DNA的凝胶，尽可能去掉多余凝胶部分，放入1.5mL的离心管内并称重。
3)按每100mg凝胶加入300μL QG Buffer，置55℃水浴中10min，每2min颠倒混匀一次，使凝胶块完全溶化。
4)每100mg凝胶加入100μL异丙醇，混匀。
5)将吸附柱装入2.0mL的收集管中。
6)将溶化后的凝胶液移入吸附柱(最大容量800μL)，静置1min，12000转/分离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
7)向吸附柱中加入500μL QG Buffer，12000转/分离心1min，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。
8)向吸附柱中加入750μL PE Buffer，静置1min，12000转/分离心1min，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中；12000转/分再离心2min。
9)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入20μL ddH2O，静置3min，12000转/分离心1min。将所得的PCR纯化产物-20℃保存。
(3)PCR产物与载体的连接
连接反应体系为TakaRa公司产品，所用质粒载体为pMDTW18-T载体(TaKaRaCode:6011,宝生物工程有限公司)。连接体系见表5。
表5连接体系
(4)重组子转化与阳性克隆筛选
1)取出-70℃保存的1支100μL的感受态细胞E.coli JM109Competent Cells(Code:9052,宝生物工程有限公司)，冰浴30min。
2)加入2μL连接产物，用移液器轻轻混匀，冰浴30min。
3)42℃水浴热激90sec，立即冰浴2min。
4)加800μL液体SOC培养基，37℃孵育50min。
5)涂30μL X-Gal及20μL IPTG于琼脂平板上，37℃60min。
6)取200μL菌液涂在预先涂有X-gal及IPTG的Amp琼脂糖平板上，37℃过夜培养。
7)转化过夜培养的平板于4℃放置3hr，挑选白色克隆，接种到盛有5mL LB液体培养基的玻璃试管中，37℃恒温振荡(200转/分)，过夜培养。
(5)、质粒DNA的提取
用1.5mL离心管分次收集在LB培养基中培养过夜的菌液。加入250μL的Solution I充分悬浮细菌沉淀。加入350μL的Solution II，盖紧管口，快速倒置、震荡10sec。加入250μL的SolutionIII，盖紧管口，快速倒置后温和震荡10sec，使SolutionIII在粘稠的细菌裂解物中分散均匀。细菌裂解物室温12000转/分离心10min，将吸附柱装入2mL的收集管中待用。将上清液小心移入吸附柱(最大容量800μL)，静置1min，12000转/分离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。向吸附柱中加入750μL PE Buffer，静置1min，12000转/分离心1min，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。再次向吸附柱中加入500μL PEBuffer，静置1min，12000转/分离心1min，倒掉收集管中的液体。将吸附柱放入同一个收集管中，12000转/分再离心2min。将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入20μL ddH2O，静置3min，14000转/分离心1min，-20℃保存。
(6)阳性克隆的鉴定
pMDTM18-T载体(TaKaRaCode:6011,宝生物工程有限公司)两端含有通用引物位点，通过质粒PCR(M13引物,TaKaRaCode:3830B,宝生物工程有限公司)确认其中含有目的片段基因的阳性克隆，反应体系见表6。反应程序：95℃，3min；95℃，30sec，55℃，30sec，72℃，30sec，30循环；72℃，10min。
表6质粒鉴定PCR反应体系
PCR反应结束后，取各PCR反应产物5μL加1μL加样缓冲液(6×Loading Buffer，TaKaRaCode:9156,宝生物工程有限公司)在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。电压120V，电泳时间30min。紫外光下观察电泳结果，使用凝胶成像系统拍照记录，并进行测序。
(三)不同浓度质粒标准品制备
采用NanoDrop2000超微量分光光度计(美国Thermo Fisher公司)，测定质粒浓度、260/280比值；每个样品测3次，并计算平均浓度。
冬虫夏草特异性DNA片段的长度为148bp，质粒浓度为732.375ng/μL，其拷贝数为2.38×1011拷贝/μL；将该质粒原液稀释成标准品：DC-1(2.0×106拷贝/μL)、DC-2(4.0×105拷贝/μL)、DC-3(8.0×104拷贝/μL)、DC-4(1.6×104拷贝/μL)、DC-5(3.2×103拷贝/μL)。
蜡蚧轮枝菌特异DNA片段的长度为104bp，质粒浓度为534.85ng/μL，其拷贝数为1.75×1011拷贝/μL；将该质粒原液稀释成标准品：JS-1(2.0×106拷贝/μL)、JS-2(4.0×105拷贝/μL)、JS-3(8.0×104拷贝/μL)、JS-4(1.6×104拷贝/μL)、JS-5(3.2×103拷贝/μL)。
(四)标准曲线的获得
以含有冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒DC-1(2.0×106拷贝/μL)、DC-2(4.0×105拷贝/μL)、DC-3(8.0×104拷贝/μL)、DC-4(1.6×104拷贝/μL)、DC-5(3.2×103拷贝/μL)为模板，用扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对(DC-qPCR-F、DC-qPCR-R)进行荧光定量PCR，得到冬虫夏草标准品质粒标准曲线；以含有蜡蚧轮枝菌特异DNA片段的标准品质粒JS-1(2.0×106拷贝/μL)、JS-2(4.0×105拷贝/μL)、JS-3(8.0×104拷贝/μL)、JS-4(1.6×104拷贝/μL)、JS-5(3.2×103拷贝/μL)为模板，用扩增蜡蚧轮枝菌特异DNA片段的引物对(JS-qPCR-F、JS-qPCR-R)进行荧光定量PCR，得到蜡蚧轮枝菌发酵粉标准品质粒标准曲线。
实施例3采用本发明试剂进行检测
1.提取虫草超微粉DNA
提取虫草超微粉DNA所用试剂为“柱式真菌DNAout基因提取试剂盒”(产品编号：70901)购自北京天恩泽基因科技有限公司，按照说明书进行提取；
准确称取样品100mg，转移到1.5mL离心管中，加入1mL溶液A充分混匀，65℃保温30分钟；12,000转/分离心3分钟；转移上清到新离心管中，加入等体积的溶液B，混匀，冰浴5分钟；室温12,000转/分离心3分钟，转移上清到新的离心管中；加入0.2mL氯仿，振荡30秒混匀；室温12,000转/分离心3分钟，转移上清到新离心管中；加入1.5倍体积的溶液C，混匀，将混合液转移到离心吸附柱中，室温放置5分钟；12,000转/分离心1分钟；加入0.7mL洗柱液，室温离心1分钟；加入0.3mL洗柱液重复一次；空甩1分钟去除残留液体；将离心柱放置在一新的1.5mL离心管中，加入100μL通用洗脱液。室温放置5分钟后离心1分钟，即获得DNA溶液，-20℃保存。使用NanoDrop2000超微量分光光度计(美国Thermo Fisher公司)测定提取的DNA浓度，并将该浓度稀释成500ng/μL的终浓度。
2.混合样本
冬虫夏草超微粉为青海春天药用资源科技利用有限公司“5X极草”冬虫夏草含片；蜡蚧轮枝菌发酵虫草粉(伪品)购自市售药店。冬虫夏草超微粉与蜡蚧轮枝菌发酵虫草粉(伪品)按表7比例混合。采用“柱式真菌DNAout基因提取试剂盒”(产品编号：70901)提取混合虫草超微粉DNA；使用NanoDrop2000超微量分光光度计(美国Thermo Fisher公司)测定提取的DNA浓度，并将该浓度稀释成终浓度为500ng/μL。
表7混合比例
3.荧光定量PCR扩增
为确保PCR扩增效率和准确性，PCR试剂优先采用TAKARA试剂：PremixDimerEraserTM(Perfect Real Time)(TaKaRaCode:RR091,宝生物工程有限公司)；定量PCR仪器优先使用ABI7500Real-Time PCR System(美国Thermo Fisher公司)。样品扩增的曲线见图8～11。
PCR反应体系如下：
表8扩增冬虫夏草标准品质粒和样品1#-7#的PCR反应体系
表9扩增蜡蚧轮枝菌标准品质粒和样品1#-7#的PCR反应体系
表10荧光定量PCR反应条件
4.结果分析
PCR反应结束后，荧光定量PCR仪测定标准品扩增过程中的荧光值，系统根据荧光值的变化规律自动生成标准曲线；依据标准曲线对样品中冬虫夏草(表11)和蜡蚧轮枝菌发酵粉(伪品)(表12)扩增的荧光值进行计算(表13)。分析发现，只要有伪品掺入，即可检出。其中以5％、10％、15％、20％掺入比例，检测准确性高。
表11冬虫夏草标准品质粒和样品1#-7#的荧光定量数据
表12蜡蚧轮枝菌发酵虫草粉标准品质粒和样品1#-7#的荧光定量数据
表13冬虫夏草超微粉中掺入蜡蚧轮枝菌发酵虫草粉样品1#-7#的掺入比例数据
实施例4采用本发明试剂进行检测
1.混合样本
冬虫夏草超微粉为“5X极草”冬虫夏草含片；蜡蚧轮枝菌发酵虫草粉(伪品)购自市售药店。冬虫夏草超微粉与蜡蚧轮枝菌发酵虫草粉(伪品)按表14比例混合，充分研磨。
表14混合比例
2.提取虫草超微粉DNA
提取虫草超微粉DNA所用试剂为“柱式真菌DNAout基因提取试剂盒”(产品编号：70901，北京天恩泽基因科技有限公司)，每次准确称取混合样品100mg，按照说明书进行提取，每份样品共分十次提取，最后将十次提取的DNA溶液混合；使用NanoDrop2000超微量分光光度计(美国Thermo Fisher公司)测定提取的DNA浓度，并将该浓度稀释成终浓度为500ng/μL。
3.定量扩增与计算
按照前述方法进行荧光定量PCR，计算掺入比例。分析发现，只要有伪品掺入，即可检出。对混合样品分次提取，将全部DNA混合后进行定量扩增，发现提高了检测的准确性。
表15冬虫夏草超微粉中掺入蜡蚧轮枝菌发酵虫草粉样品1#-7#的掺入比例数据

Claims (5)

1.检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的引物对，其特征在于：包括用于扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对和扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对；扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
2.检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的试剂盒，其特征在于：包括用于扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对和扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对；扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括含有冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒，按如下浓度独立包装：含有冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒-1 2.0×106拷贝/μL、含有冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒-2 4.0×105拷贝/μL、含有冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒-3 8.0×104拷贝/μL、含有冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒-4 1.6×104拷贝/μL、含有冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒-5 3.2×103拷贝/μL。
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：还包括含蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的标准品质粒JS，按如下浓度独立包装：含蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的标准品质粒-12.0×106拷贝/μL、含蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的标准品质粒-2 4.0×105拷贝/μL、含蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的标准品质粒-3 8.0×104拷贝/μL、含蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的标准品质粒-4 1.6×104拷贝/μL、含蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的标准品质粒-53.2×103拷贝/μL。
5.检测冬虫夏草超微粉中添加蜡蚧轮枝菌发酵粉的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
a、绘制标准曲线：以含冬虫夏草特异DNA片段的标准品质粒为模板，用扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对进行荧光定量PCR，得到冬虫夏草标准品质粒标准曲线；以含蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的标准品质粒为模板，用扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对进行荧光定量PCR，得到蜡蚧轮枝菌发酵粉标准品质粒标准曲线；
b、提取样品总DNA；
c、荧光定量PCR：以样品总DNA为模板，以扩增冬虫夏草特异DNA片段的引物对和扩增蜡蚧轮枝菌发酵粉特异DNA片段的引物对分别进行荧光定量PCR，依据标准曲线对样品中冬虫夏草和蜡蚧轮枝菌发酵粉扩增的荧光值进行计算，得出掺入比例。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN104212893B (zh) * 2014-08-25 2015-12-09 张艳军 蜡蚧轮枝菌的荧光定量pcr检测方法及其试剂盒
CN106932525B (zh) * 2017-03-02 2018-12-21 广州安诺科技股份有限公司 金胺o快速检测试剂盒、检测方法及在检测中药材的应用
CN113832247A (zh) * 2021-09-29 2021-12-24 中国食品药品检定研究院 一种中国被毛孢菌的引物、探针以及鉴定方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533942A (zh) * 2010-12-10 2012-07-04 谢明 一种用于扩增蜡蚧轮枝菌的特异性引物
CN102890091A (zh) * 2010-04-21 2013-01-23 张雪峰 鉴别纯冬虫夏草粉的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102890091A (zh) * 2010-04-21 2013-01-23 张雪峰 鉴别纯冬虫夏草粉的方法
CN102533942A (zh) * 2010-12-10 2012-07-04 谢明 一种用于扩增蜡蚧轮枝菌的特异性引物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Identification of Chinese Medicinal Fungus Cordyceps sinensis by PCR-Single-Stranded Conformation Polymorphism and Phylogenetic Relationship;HSIAO-CHE KUO等;《J. Agric. Food Chem.》;American Chemical Society;20050419;第53卷(第10期);3963-3968 *
轮枝菌形态的低温扫描电镜观察;阎峻等;《真菌学报》;19961231;第15卷(第1期);34-37 *

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