CN108330206A - 长裙竹荪、短裙竹荪、棒竹荪的完整its序列及用其鉴定竹荪品种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种真菌品种的DNA序列及利用该序列鉴定其品种的分子鉴定方法。所说的长裙竹荪的ITS1‑5.8S‑ITS2序列如SEQ NO.1所示；短裙竹荪的ITS1‑5.8S‑ITS2序列如SEQ NO.2所示；棒竹荪的ITS1‑5.8S‑ITS2序列如SEQ NO.3所示。鉴定时，先提取待鉴定样品的基因组，PCR扩增ITS1‑5.8S‑ITS2片段，并克隆测序，将所得序列与SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3序列分别进行比较，从而判定是否为长裙竹荪、短裙竹荪或棒竹荪菌种。本发明可以对野生及人工培养的长裙竹荪菌种、短裙竹荪菌种及棒竹荪菌种进行准确的鉴定，能准确区分和判别长裙竹荪、短裙竹荪和棒竹荪菌种，为品系鉴定、品种保护、菌种质量控制、有效菌种繁育及竹荪人工栽培提供可靠技术。

Description

长裙竹荪、短裙竹荪、棒竹荪的完整ITS序列及用其鉴定竹荪 品种的方法

技术领域

本发明涉及一种真菌品种的DNA序列及利用该序列鉴定其品种的方法，更具体地说，本发明涉及一种长裙竹荪菌种、短裙竹荪菌种和棒竹荪菌种的ITS1-5.8S-ITS2序列及利用该序列鉴定其品种的分子鉴定方法，属于分子生物学方法鉴定真菌品种技术领域。

背景技术

竹荪（Dictyophora spp.）属担子菌亚门、腹菌纲、鬼笔目、鬼笔科、竹荪属，是世界上名贵的大型食用菌之一，共12个种。我国有长裙竹荪、短裙竹荪、黄裙竹荪、朱红竹荪、红托竹荪、皱盖竹荪和棘托竹荪7个种。竹荪含有19种氨基酸、多种维生素和多种有益人体健康的微量元素。研究表明，经常食用竹荪具有抗氧化、减肥、增强免疫、保护肝脏及抗辐射减肥等作用；竹荪对降低血压、减少血液中脂肪和总胆固醇的含量也有一定的效果。此外，竹荪作为一种特殊的天然防腐剂，安全性高，抑菌效果好。竹荪可广泛用于各类食用菌终端产品与其它食品行业，经深加工的产品有竹荪保健饮料、竹荪糯米酒、竹荪多糖口服液等。

长裙竹荪（Dictyophora indusiata）、短裙竹荪（Dityophora duplicata）和棒竹荪（Dictyophora phalloidea），三者在形态上相似，其主要区别在于生长地域。随着市场需求量的增加以及竹荪栽培技术的不断进步，竹荪资源已不再是难题。但由于三者的形态特征极其相似，在选种育种、种质资源管理与保护、实验研究及竹荪产品开发等方面导致种与种之间的混淆；且因地域性的差异，其不同地域的竹荪本身的营养价值也会存在一定的差异性，若将竹荪菌种混合，则竹荪在选种繁育、种质资源管理、实验研究及竹荪产品开发等方面会受到一定的负面影响，也会直接影响到竹荪本身的利用价值和消费者的利益。因此，进行相关研究之前须对竹荪菌种做出准确的鉴定，但单纯采用形态学特征和微观解剖还不能对竹荪品种做出全面客观的鉴定。

基于DNA序列的分子标记技术，能达到准确鉴定竹荪菌种的目的。真菌核糖体DNA区段含有多个串联重复序列，每个重复序列包含18S、5.8S、28S rRNA基因及其间隔区域。其中内部间隔区ITS1-5.8S-ITS2（含5.8S）将18S和28S rRNA基因分隔开，这些区域的鉴定适合从种到属的分类鉴定，是很好的分子鉴定标记，不同种的ITS1-5.8S-ITS2序列是不相同的。以ITS1-5.8S-ITS2基因序列分析和分子探针形式应用于竹荪菌种的鉴定中，对菌种的ITS1-5.8S-ITS2序列进行测序，获得序列，就可通过对比ITS1-5.8S-ITS2序列来达到准确鉴定长裙竹荪、短裙竹荪和棒竹荪的目的。

发明内容

本发明的目的是解决现有竹荪鉴定技术存在的不足与问题，提供一种长裙竹荪、短裙竹荪和棒竹荪的ITS1-5.8S-ITS2区序列及利用该序列鉴定其品种的分子鉴定方法，用特定的DNA序列进行竹荪真菌鉴定，保证了竹荪品种及长裙竹荪、短裙竹荪菌种和棒竹荪菌种的鉴定更可靠、正确。

为达到本发明的目的，本发明人从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买了长裙竹荪（编号5.405）、短裙竹荪（编号5.413）、棒竹荪（编号5.187），均经过真菌分类学家的专业鉴定。所测得长裙竹荪样品、短裙竹荪样品和棒竹荪样品的ITS1-5.8S-ITS2序列见序列表，以测得的序列作为菌种鉴定的ITS1-5.8S-ITS2序列，长裙竹荪的ITS1-5.8S-ITS2序列长度为523bp，如SEQ NO.1所示；短裙竹荪的ITS1-5.8S-ITS2序列长度为528bp，如SEQ NO.2所示；棒竹荪的ITS1-5.8S-ITS2序列长度为529bp，如SEQ NO.3所示。长裙竹荪ITS1-5.8S-ITS2序列G+C含量为54%，短裙竹荪ITS1-5.8S-ITS2序列G+C含量为55%，棒竹荪ITS1-5.8S-ITS2序列G+C含量为55%。

本发明首先建立了一套长裙竹荪、短裙竹荪和棒竹荪的高质量基因组DNA的制备方法，然后对其ITS1-5.8S-ITS2序列进行测序，建立了ITS1-5.8S-ITS2序列。在此基础上可通过ITS1-5.8S-ITS2序列对比差异进行长裙竹荪、短裙竹荪和棒竹荪的品种鉴定。其鉴定方法主要包括以下步骤。

（1）提取待鉴定长裙竹荪菌体、短裙竹荪菌体和棒竹荪菌体的基因组DNA。

（2）以提取得到的基因DNA样品为模板，用针对ITS1-5.8S-ITS2的专用引物进行聚合酶链式反应扩增得到长裙竹荪、短裙竹荪和棒竹荪的ITS1-5.8S-ITS2片段产物，其扩增的正向引物为ITS1-F：5’-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3’，反向引物LR3：5’-CCG TGTTTC AAG ACG GG-3’；在25 μL的体系中完成扩增反应，以双蒸水代替模板DNA作空白对照，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

（3）对每一凝胶电泳条带进行琼脂糖凝胶DNA回收。

（4）将步骤（3）回收纯化产物与T-vector PMD19载体连接，并转化到DH5α感受态细胞中，涂布在固体LB（含有Amp）培养基上，37℃倒置培养过夜，次日挑出白色菌斑进行PCR扩增检测，鉴定转化成功后，取菌液进行测序。

（5）将步骤（4）克隆后得到的菌液进行序列测定，分别得到长裙竹荪、短裙竹荪和棒竹荪的ITS1-5.8S-ITS2序列，其中测序引物为聚合酶链式反应所用引物相同的ITS1-F和LR3；所有序列至少经过正反两次重复测定，以保证序列的准确性；建立的ITS1-5.8S-ITS2的全序列，见序列表。

（6）将待鉴定菌种的菌体按上述步骤进行分析，得到待鉴定菌种的ITS1-5.8S-ITS2序列，将此序列与序列表中已经确定的长裙竹荪、短裙竹荪或棒竹荪的ITS1-5.8S-ITS2序列进行比较判定，得到分析鉴定结果，判断是否为长裙竹荪菌种、短裙竹荪菌种或棒竹荪菌种。

本发明的长裙竹荪、短裙竹荪与棒竹荪的ITS1-5.8S-ITS2序列及用其鉴定竹荪品种的方法中，待鉴定菌种的基因组DNA提取采用 CTAB-NaCl方法抽提，其步骤为：称取1.5 g菌丝体材料（PDA液体培养，-20℃冻存），加入等体积石英砂，在冷冻的研钵中研磨；转移样品至5 mL离心管，加入1.5 mL CTAB溶液（2% CTAB，100 mM Tris-HCl，20 mM EDTA，1.4 MNaCl，pH8.0）和30 μL β-巯基乙醇，颠倒混匀；加入20 μL蛋白酶K（20 mg/ml）及1/10体积的10%SDS，55℃水浴2小时以上（或过夜），期间颠倒混匀；室温冷却10 min，加入2 mL酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，pH7.8），颠倒混匀，12000 r/min 离心10 min；取上清，加等体积氯仿:异戊醇(24:1)，振荡混匀，12000 r/min 离心10 min；取上清，加0.8 倍体积预冷异丙醇，混匀后-20℃静置30 min，12000 r/min离心10 min；弃上清，加500 μL NaCl (1 mol/L)溶解沉淀，加500 μL氯仿:异戊醇(24:1)，颠倒混匀，12000 r/min离心10 min；取上清，加0.8倍体积预冷异丙醇，12000 r/min 离心10 min；取沉淀，70%乙醇淌洗2 次，自然风干，加100 μLddH2O，溶解，加核糖核酸酶A 溶液至终浓度0.1 mg/ml，37℃ 30 min水浴；DNA的浓度及纯度检测，进行琼脂糖凝胶电泳分析得到基因组DNA样品。（纯的DNA的纯度检测是按照：OD260/OD280≈1.8，＞1.9表明有RNA污染；＜1.6表明有蛋白质、酚等污染）。

上述方法步骤（2）中，以步骤（1）提取得到的真菌基因组DNA为模板，采用引物对ITS1-F（5’-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3’）和LR3（5’-CCG TGT TTC AAG ACG GG-3’）进行PCR扩增；在25 μL的体系中完成扩增反应，其25μL反应液含：10×Ex-taq Buffer2.5 μL；浓度为2.5 mM的dNTP 溶液2 μL；浓度为10 pM引物ITS1-F ∕LR3各2.5 μL；DMSO溶液为1.25 μL；基因组DNA 1μL；以及13.2 μL的 dd H₂O；以双蒸水代替模板DNA作空白对照，扩增反应程序为：95℃预变性5 min，95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min 45s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。

上述方法步骤（4）中，以菌种ITS1-5.8S-ITS2序列经PCR扩增反应得到纯化产物与T-vector PMD19载体连接并进行转化，其步骤为。

（1）10 μL的连接体系：T-vector PMD19 载体1 μL；ITS模板3.5 μL；SolutionⅠ为4.5 μL；PCR仪中16℃保温30 min。取出后加入1 μL SolutionⅢ。

（2）将100 μL感受态细胞置于冰上解冻后，装入1.5ml EP管中，加入步骤（1）中的10 μL连接液，置冰上30 min。

（3）42℃水浴热激90 s，再在冰上放置5 min。

（4）分别加入900 μL培养基（无抗生素），37℃培养1 h。15000 r/min 离心5 min，取900 μL上清液并弃去，将剩余样品溶液混匀后均匀地涂在在含有X-Gal（20 mg/mL）、IPTG（24 mg/mL）、Amp（100 mg/mL）的LB培养基上培养。

（5）同时，在一个已加X-Gal、IPTG、Amp的平板上涂上未转质粒的感受态细胞，做空白对照。

（6）将平板于37℃培养1 h，待细胞悬浮液等液体全部被固体培养基吸收后，倒置培养基过夜。

（7）次日挑出白色菌斑进行PCR扩增检测，鉴定转化成功后，取菌液进行序列测定。

本发明与现有技术相比还具有一下有益效果。

1、本发明建立了一套快速、有效的长裙竹荪、短裙竹荪和棒竹荪高质量基因组DNA的提取方法。

2、本发明提供了长裙竹荪、短裙竹荪和棒竹荪的核基因组ITS1-5.8S-ITS2区序列，利用它们可以对人工培养的长裙竹荪、短裙竹荪和棒竹荪进行准确鉴定。

3、本发明的鉴定方法可以直接用于检测菌种的序列差异，以准确区和鉴定竹荪菌种的真实性和纯度，为品系鉴定、品种保护、菌种质量控制、有效菌种繁育及竹荪人工栽培提供可靠技术。

具体实施方式

下面通过具体实施例说明本发明，但本发明并不仅仅局限于这些实施例。

实施例1 利用野生竹荪菌株ZST的 ITS1-5.8S-ITS2区序列鉴定竹荪品种。

本实施例取野生竹荪菌株ZST（专利申报实验室采集），通过以下步骤进行鉴定。

（1）野生竹荪菌株ZST菌丝体的制备。

将野生竹荪菌株ZST菌种接种至 PDA 液体培养基，25℃恒温静置培养，待菌丝生长到适量时，收集菌丝并用无菌蒸馏水冲洗菌丝体上液体所含有的液体培养基，无菌滤纸吸去菌丝中的水分，再装入1.5 mL离心管中，冻存于-20℃ 以备用。

（2）基因组DNA的提取。

称取1.5 g -20℃下储存的菌丝体至于已灭菌冷冻的研钵中，加入等体积石英砂研磨；转移样品至5 mL离心管，加入1.5 mL CTAB溶液（2% CTAB，100 mM Tris-HCl，20 mMEDTA，1.4 M NaCl，pH8.0）和30 μL β-巯基乙醇，颠倒混匀；加入20 μL蛋白酶K（20 mg/ml）及1/10体积的10% SDS，55℃水浴2小时以上（或过夜），期间颠倒混匀；室温冷却10 min，加入2 mL酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，pH7.8），颠倒混匀，12000 r/min 离心10 min；取上清，加等体积氯仿:异戊醇（24:1），振荡混匀，12000 r/min 离心10 min；取上清，加0.8 倍体积预冷异丙醇，混匀后-20℃静置30 min，12000 r/min离心10 min；弃上清，加500 μL NaCl (1mol/L)溶解沉淀，加500 μL氯仿:异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000 r/min离心10 min；取上清，加0.8 倍体积预冷异丙醇，12000 r/min 离心10 min；取沉淀，70%乙醇淌洗2 次，自然风干，加100 μL ddH₂O，溶解，加核糖核酸酶A 溶液至终浓度0.1 mg/ml，37℃ 30 min水浴；DNA的浓度及纯度检测，进行琼脂糖凝胶电泳分析得到基因组DNA样品。

（3）以提取得到的基因DNA样品为模板，用针对ITS1-5.8S-ITS2区的专用引物进行聚合酶链式反应扩增得到待鉴定竹荪菌种的ITS1-5.8S-ITS2片段产物，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

其中聚合酶链式反应扩增核基因组DNA的ITS1-5.8S-ITS2区，采用引物为ITS1-F（5’-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3’）和LR3（5’-CCG TGT TTC AAG ACG GG-3’）。

聚合酶链式反应的反应体系采用25 μL，其25 μL反应液含：10×Ex-taq Buffer2.5 μL；浓度为2.5 mM的dNTP 溶液2 μL；浓度为10 pM引物ITS1-F ∕LR3各2.5 μL；DMSO溶液为1.25 μL；基因组DNA 1 μL；Ex-taq polymerase为0.125 μL；以及13.2 μL的 dd H₂O；聚合酶链式反应在T100^TM Themal Cycler上完成。

聚合酶链式反应的反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性1 min，60℃退火1min，72℃延伸1 min 45 s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。每样平行重复5次以上，每次实验设阴性对照（以双蒸水代替模板DNA）用于排除非特异的聚合酶链式反应产物；扩增产物用1-1.5%（w/v）琼脂糖凝胶电泳鉴定（Marker分子量范围100-2000 bp）。

（4）运用普通DNA产物纯化试剂盒进行PCR产物纯化回收，步骤按其说明书进行。

（5）获得的纯化产物与T-vector PMD19载体连接，并转化到DH5α感受态细胞中，涂布在固体LB（含有Amp）培养基上，37℃倒置培养过夜，次日挑出白色菌斑进行PCR扩增检测，鉴定转化成功后，取菌液送上海英潍捷基生物公司完成测序。

其中连接反应的反应体系采用10 μL内含T-vector PMD19 载体1 μL，菌种ITS模板3.5 μL，SolutionⅠ为4.5 μL，PCR仪中16℃保温30 min，取出后加入1 μL SolutionⅢ。

大肠杆菌细胞质粒及连接液转化的主要步骤为：将100 μL感受态细胞置于冰上解冻后，装入1.5 ml EP管中，加入步骤（5）中的10 μL连接液，置冰上30 min；42℃水浴热激90s，再在冰上放置5 min；分别加入900 μL培养基（无抗生素），37℃培养1 h；15000 r/min 离心5 min，取900 μL上清液并弃去，将剩余样品溶液混匀后均匀地涂在在含有X-Gal（20 mg/mL）、IPTG（24 mg/mL）、Amp（100 mg/mL）的LB培养基上培养。同时，在一个已加X-Gal、IPTG、Amp的平板上涂上未转质粒的感受态细胞，做空白对照。将平板于37℃培养1 h，待细胞悬浮液等液体全部被固体培养基吸收后，倒置培养基过夜。

挑选白色菌斑进行菌液培养以及PCR扩增检测，其步骤为：于无菌操作台里挑选白色菌斑置1mL 含Amp（100 mg/mL）LB液体培养基的EP管中，在37℃ 180 r/min的恒温摇床上培养过夜，每样平行5 次以上；次日以培养的菌液为模板，进行PCR扩增检测，其步骤与该实施例步骤（3）中的聚合酶链式反应扩增相同。

（6）鉴定转化成功后，取菌液送上海英潍捷基生物公司完成测序。将序列进行初步分析提取ITS1-5.8S-ITS2区序列（SEQ NO.4），利用DNAMAN软件将其分别与SEQ NO.1、SEQNO.2和SEQ NO.3进行同源序列比对，发现SEQ NO.4与SEQ NO.1、SEQ NO.2和SEQ NO.3序列相似度分别为100%、97.16%和96.98%，故鉴定野生竹荪菌株ZST为长裙竹荪。

实施例2 利用野生竹荪菌株YZS的ITS1-5.8S-ITS2区序列鉴定竹荪品种。

本实施例取野生竹荪菌株YZS（专利申报实验室采集），方法同实施例1。将该菌株的ITS1-5.8S-ITS2区序列（SEQ NO.5），利用DNAMAN软件将其分别与SEQ NO.1、SEQ NO.2和SEQ NO.3进行同源序列比对，发现SEQ NO.5与SEQ NO.1、SEQ NO.2和SEQ NO.3序列相似度分别为97.35%、99.81%和99.62%，故鉴定野生竹荪菌株YZS为短裙竹荪。

实施例3 利用野生竹荪菌株ZZC2的 ITS1-5.8S-ITS2区序列鉴定竹荪品种。

本实施例取野生竹荪菌株ZZC2（专利申报实验室采集），方法同实施例1。将该菌株的ITS1-5.8S-ITS2区序列（SEQ NO.6），利用DNAMAN软件将其分别与SEQ NO.1、SEQ NO.2和SEQ NO.3进行同源序列比对，发现SEQ NO.6与SEQ NO.1、SEQ NO.2和SEQ NO.3序列相似度分别为97.17%、99.62%和99.81%，故鉴定野生竹荪菌株ZZC2为棒竹荪。

序列表

<110> 周培富

汤洪敏

丁邦菊

张静

黎璐

<120> 长裙竹荪、短裙竹荪、棒竹荪的完整ITS序列及用其鉴定竹荪品种的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 523

<212> DNA

<213> 长裙竹荪(Dictyophora indusiata)

<400> 1

ccgatcgtta tatgaagggg gggtacatcc tccctgaccg acacttttgt gcactggagg 60

ggggggagga ctcgagagag cgtcctctcc cgtcatgaac gcccgtttct cgcgcgtatt 120

tgaaacccct tttggagggg ggggggaaag tctttgaaac acaactttca acaacggatc 180

tcttggcttt cgcatcgatg aagaacgccg cgaacgcgcg aaacgtaatg tgaattgcag 240

aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc accttgcgct cctcggcatt ccgaggagca 300

tgcctgtttg agtgtcgtga agtctcatcg gaaggagggt cccttgtgaa aaggggggcc 360

ctcttttttc ggacttggac ggtcttgcct ttgcccgtcg atgaagctcg tcttcaaatc 420

atcggcgagg tttccagtcc ccctcgaaga cgtgtgataa gtctcgcgtc gtccggggaa 480

aaagggatcc gcgccccgtc cctcatcact cttttttaac gct 523

<210> 2

<211> 528

<212> DNA

<213> 短裙竹荪(Dictyophora duplicate)

<400> 2

ccgatcgcta tctgaagggg ggggtaaatc ctccctgacc gacacctttg tgcactcgag 60

gggggggagg actcgagaga gcgtcctctc ccgtcatgaa cgcccgtttc tcgcgcgtat 120

ttgaaacccc ttctggaggg gggggggaaa gtctttgaaa cacaactttc aacaacggat 180

ctcttggctt tcgcatcgat gaagaacgcc gcgaacgcgc gaaacgtaat gtgaattgca 240

gaattcagtg aatcatcgaa tctttgaacg caccttgcgc tcctcggcat tccgaggagc 300

atgcctgttt gagtgtcgtg aagtctcatc ggaaggaggg tcccttgtga aaaggggggc 360

cctctttttt cggacttgga cggtcttgcc tttgcccgtc ggtgaaggct cgtcttcaaa 420

ttcatcggcg aggtttccag tcccctcgaa gacgttgtga taagtctcgc gtcgtccggg 480

gaaaaaggga tccgcgcccc cgtccctcat cactcttttt ttaacgct 528

<210> 3

<211> 529

<212> DNA

<213> 棒竹荪(Dictyophora phalloidea)

<400> 3

ccgatcgcta tctgaagggg gggggtaaat cctccctgac cgacaccttt gtgcactcga 60

ggggggggag gactcgagag agcgtcctct cccgtcatga acgcccgttt ctcgcgcgta 120

tttgaaaccc cttctggagg ggggggggaa agtctttgaa acacaacttt caacaacgga 180

tctcttggct ttcgcatcga tgaagaacgc cgcgaacgcg cgaaacgtaa tgtgaattgc 240

agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcaccttgcg ctcctcggca ttccgaggag 300

catgcctgtt tgagtgtcgt gaagtctcat cggaaggagg gtcccttgtg aaaagggggg 360

ccctcttttt tcggacttgg acggtcttgc ctttgcccgt cggtgaaggc tcgtcttcaa 420

attcatcggc gaggtttcca gtcccctcga agacgttgtg ataagtctcg cgtcgtccgg 480

ggaaaaaggg atccgcgccc ccgtccctca tcactctttt tttaacgct 529

Claims (2)

1.一种长裙竹荪、短裙竹荪和棒竹荪的ITS1-5.8S-ITS2序列，其特征在于：所说长裙竹荪的ITS1-5.8S-ITS2序列，如SEQ NO.1所示；短裙竹荪的ITS1-5.8S-ITS2序列，如SEQ NO.2所示；棒竹荪的ITS1-5.8S-ITS2序列如SEQ NO.3所示。

2.一种利用权利要求1所述的长裙竹荪、短裙竹荪、棒竹荪的ITS1-5.8S-ITS2序列鉴定竹荪品种的方法，包括以下步骤：

（1）从待鉴定真菌样品的菌丝体或子实体中提取基因组DNA；

（2）以步骤（1）提取得到的DNA样品为模板，用针对ITS1-5.8S-ITS2区的专用引物进行聚合酶链式反应扩增得到待鉴定真菌的ITS1-5.8S-ITS2片段产物，其扩增引物为：

ITS1-F：5’-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A- 3’；

LR3：5’-CCG TGT TTC AAG ACG GG -3’；

在25 μL的体系中完成扩增反应，以双蒸水代替模板DNA作空白对照；

（3）将步骤（2）扩增反应得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并对目的片段进行胶回收纯化；

（4）将步骤（3）纯化后的目的片段进行克隆：以ITS1-5.8S-ITS2序列的PCR产物与T-vector PMD19载体连接，并转化到DH5α感受态细胞中，涂布在固体LB（含有Amp）培养基上，37℃倒置培养过夜，次日挑出白色菌斑进行PCR扩增检测，鉴定转化成功后，取菌液进行测序；

（5）将步骤（4）克隆后得到的菌液进行序列测定，得到待鉴定菌种的ITS1-5.8S-ITS2区序列；

（6）将步骤（5）得到的序列与SEQ NO.1、SEQ NO.2和SEQ NO.3序列分别进行比较，判断是否为长裙竹荪菌种、短裙竹荪菌种或棒竹荪菌种。