CN104946760A - 一种检测肿囊腐霉的方法及专用试剂盒 - Google Patents

一种检测肿囊腐霉的方法及专用试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测肿囊腐霉的方法及专用试剂盒。本发明所提供的用于检测肿囊腐霉的LAMP引物，由序列分别为序列1-6的引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成。本发明公开的方法是利用实时荧光环介导等温扩增(real-time fluorescence LAMP,RealAmp)特异性的对土壤和植物病残体中的肿囊腐霉(包括菌丝体和卵孢子)进行快速定量检测。本发明公开的方法具有不需要借助昂贵仪器和试剂，检测结果直观、可靠，不受检测场地限制，适应在田间进行大规模检测的优点。本发明公开的方法将在玉米青枯病的预防和诊断等方面发挥重要的作用，应用前景广阔。

Description

一种检测肿囊腐霉的方法及专用试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测肿囊腐霉的方法及专用试剂盒。
背景技术
玉米青枯病是我国玉米生产上最重要的病害之一。该病的发生引起玉米平均减产5％～20％，严重发生区域可达100％。玉米青枯病的发生可以引起玉米灌浆困难、茎秆折断，进而引起玉米产量降低和影响玉米机械化收割，在连阴多雨的年份表现尤为明显。在我国，玉米青枯病病原菌主要有：肿囊腐霉(Pythium inflatum)、禾生腐霉(P.graminicola)，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和轮枝镰刀菌(F.verticillioides)。在我国最大的玉米产区黄淮海玉米带，自1994年至今，肿囊腐霉一直是引起玉米青枯病的优势病原菌。然而，至今未见对肿囊腐霉玉米青枯病有防治效果的杀菌剂，这主要是由于该病原菌次年作为初侵染源的越冬孢子(卵孢子)具有约2μm厚的细胞壁。由于生产上缺乏抗病的品种，玉米青枯病一直是玉米生产上的主要问题，因此，开发出一种高效快捷的肿囊腐霉检测方法，在玉米种植前，对土壤中的病菌进行动态监测，显得尤为重要。
肿囊腐霉所在的腐霉属包括140个确定的种。卵器、卵孢子、雄器和孢子囊的大小和形状一度被科学家用来作为腐霉菌形态学鉴定的标准。然而，以形态学特征作为腐霉菌的分类依据往往不准确，也费时费力，这是由于形态学特征在不同的培养条件下会产生变化，或同一种也会产生表型差异；此外，一些腐霉菌之间存在形态相似性。特别地，肿囊腐霉和近缘的禾生腐霉在形态上和生态型上都非常相似，因此，通过形态学特征对腐霉菌进行种类划分往往无法进行下去。
近年来，腐霉菌的核酸检测方法包括PCR、增强型PCR(booster PCR)、多重PCR、实时PCR(real-time PCR)、PCR-限制性片段长度多态性、DNA寡核苷酸阵列和环等温介导扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等基于PCR的DNA扩增技术。这些反应往往通过特异性的引物对核糖体DNA内部转录间隔区(internaltranscribed spacer,ITS)、细胞色素氧化酶II基因、β-微管蛋白基因的靶片段进行扩增。现有的肿囊腐霉检测方法主要基于booster PCR。这些检测手段是分析腐霉菌潜在侵染或早期侵染的有效方法。然而，这些检测方法往往需要在实验室使用昂贵的仪器设备，耗费大量时间按照固定的流程进行操作。此外，这些检测方法中设计的特异性引物并不能将肿囊腐霉与其近缘种(如禾生腐霉)有效地区分开。
除了real-time PCR、booster PCR等可以用于定量检测腐霉菌等土壤病原菌。实时荧光环介导等温扩增(real-time fluorescence LAMP,RealAmp)是一种可替代的用于检测土壤病原菌的检测方法。
LAMP是2000年由日本的研究人员Notomi等人发明的一种新型核酸扩增技术。该技术主要是针对目标DNA的6个区域设计4条(特异性)引物，再利用一种链置换聚合酶(Bst DNA聚合酶)在(恒温条件)下保温1h-2h，即可完成核酸扩增反应。在LAMP反应中，不需要通过热变性将双链DNA变成单链。因为双链DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一条引物与双链DNA的互补部位进行碱基互补配对，在Bst DNA聚合酶的作用下延伸，另一条链就会脱落变成单链。LAMP方法正是利用这一特点进行反应的。该方法克服了传统PCR反复热变性的缺点，并大大节省了反应时间，从而实现在恒温条件下进行连续的快速扩增，其灵敏度比PCR高出1～2个数量级。同时因为两对引物针对靶基因的6个区域，从而使LAMP具有较好的特异性，该技术可以在30min到1h内扩增出109～1010拷贝数。
LAMP反应结束后通过琼脂糖凝胶电泳，或伴随反应产生的焦磷酸酶沉淀，也可以通过反应液中加入的染料在反应前后颜色的变化，通过测流装置检测反应中或反应完成后整合到扩增产物中的特定标签进行检测，判断是否有靶标片段扩增。
同样，也可以对LAMP反应的靶标进行实时定量监测：如对随着扩增的进行不断增加的焦磷酸酶沉淀进行检测，从而达到对靶标进行定量的目的。而RealAmp通过ESE-Quant tube scanner(ESE Gmbh,Stockach,Germany)监测反应过程中检测荧光染料颜色的变化，收集颜色变化的信号，通过仪器自带的程序对反应模板进行实时定量，是近年来新发展的一种新型的实时定量LAMP检测方法。此外，也可以通过在反应前在反应管盖上加入SYBR Green I染料，通过反应前后染料颜色的变化，对扩增反应进行定性检测。RealAmp跟普通LAMP相比，不需要借助昂贵的仪器和试剂，同时反应快捷、灵敏，由于ESE-Quant tube scanner自带电源，因此可以在田间进行操作。
作为土壤传播的病原菌，肿囊腐霉在土壤中可以长期存活，玉米植株受该病菌侵染后，无法进行有效的防治。因此，开发一种省时省力、能够对土壤中的存活的肿囊腐霉进行灵敏、定量的检测方法对该病害的预防显得尤为必要。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种检测肿囊腐霉的环介导等温扩增引物组。
本发明所提供的检测肿囊腐霉的环介导等温扩增引物组，具体可为引物组A或引物组B。
所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；
所述引物1(F3)、所述引物2(B3)、所述引物3(FIP)、所述引物4(BIP)、所述引物5(LooF)和所述引物6(LooB)的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
本发明的第二个目的是检测肿囊腐霉的环介导等温扩增试剂。
本发明所提供的检测肿囊腐霉的环介导等温扩增试剂，包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dNTPs、Mg2+和所述引物组。
当所述引物组为所述引物组A时，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为5pmol：5pmol：40pmol：40pmol：20pmol：20pmol：40nmol：200nmol：8U：25μmol。
当所述引物组为所述引物组B时，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为5pmol：5pmol：40pmol：40pmol：40nmol：200nmol：8U：25μmol。
在本发明中，所述链置换型DNA聚合酶具体可为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。
在本发明中，所述检测肿囊腐霉的环介导等温扩增试剂组成如下：每23-24μl所述试剂中含有各5pmol的所述引物1和所述引物2、各40pmol的所述引物3和所述引物4、各20pmol的所述引物5和所述引物6、40nmol的dNTP、200nmol的MgSO4、8U的Bst DNA聚合酶、25μmol的甜菜碱、500nmol的Tris·HCl(pH 8.8)、250nmol的KCl、250nmol的(NH4)2SO4、0.025μl的Tween 20，5nmol的SYTO-9荧光染料；余量为水。
本发明的第三个目的是提供一种检测肿囊腐霉的环介导等温扩增试剂盒。
本发明所提供的检测肿囊腐霉的环介导等温扩增试剂盒，含有所述引物组或所述试剂。
所述试剂盒中还包括荧光染料。
所述荧光染料为SYTO-9荧光染料和/或SYBR Green I荧光染料。
如下a)或b)的应用也属于本发明的保护范围：
a)所述引物组在制备所述试剂或所述试剂盒中的应用；
b)所述的引物组或所述试剂或所述试剂盒在检测肿囊腐霉或制备检测肿囊腐霉的产品中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品中是否含有肿囊腐霉的方法。
本发明所提供的检测或辅助检测待测样品中是否含有肿囊腐霉的方法，具体可包括如下(a)和(b)的步骤：
(a)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，用所述引物组进行环介导等温扩增；
(b)根据步骤(a)的扩增结果，按照如下(b1)或(b2)的方法确定所述待测样品中是否含有肿囊腐霉：
(b1)反应结束后，将所述待测样品的反应液进行琼脂糖凝胶电泳，若出现阶梯状条带，则所述待测样品中含有或候选含有肿囊腐霉；反之，则所述待测样品不含或候选不含有肿囊腐霉；
(b2)反应结束后，向所述待测样品的反应液中加入SYBR Green I荧光染料，然后观察所述反应液的颜色变化；
若所述待测样品反应液为绿色，则所述待测样品中含有或候选含有肿囊腐霉；若所述待测样品反应液为橘黄色，则所述待测样品中不含有或候选不含有肿囊腐霉。
在所述(b2)中，所述SYBR Green I荧光染料与所述待测样品的反应液的体积配比具体可为1:25。
其中，所述待测样品可源自于土壤或植物病残体等，既可含有肿囊腐霉，也可不含肿囊腐霉。
本发明的第五个目的是提供一种检测待测样品中肿囊腐霉含量的方法。
本发明所提供的检测待测样品中肿囊腐霉含量的方法，具体可包括如下(c)和(d)的步骤：
(c)以具有序列表中序列7的第406-688位所示核苷酸序列的DNA样品作为肿囊腐霉标准品，将所述肿囊腐霉标准品进行梯度稀释，以所得系列浓度的所述肿囊腐霉标准品的溶液分别作为模板，用所述引物组进行实时荧光环介导等温扩增，获得对应于各所述肿囊腐霉标准品的溶液的反应时间阈值，以所述反应时间阈值为纵坐标，以所述肿囊腐霉标准品的溶液中所述肿囊标准品的浓度为横坐标，得到标准曲线方程；
(d)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，用所述引物组进行实时荧光环介导等温扩增，获得对应于所述待测样品的基因组DNA的反应时间阈值，然后根据所述标准曲线方程计算得到所述待测样品中肿囊腐霉的含量。
其中，进行所述实时荧光环介导等温扩增获得所述反应时间阈值具体为：在ESE-Quant Tube Scanner管内比色/荧光检测系统(Embedded SystemsEngineering GmbH,Stockach,Germany)进行所述实时荧光环介导等温扩增，每间隔1min采集1次荧光信号，通过6-羧基荧光素通道(487nm激发，525nm检测)收集荧光数据，荧光达到阈值时的时间点即为所述反应时间阈值。
所述待测样品含肿囊腐霉，可源自于土壤或植物病残体等。
在本发明中，所述环介导等温扩增反应具体为60-65℃(如65℃)条件下的恒温反应20-90min(如60min)。
在本发明中，进行所述环介导等温扩增时，所述引物1和所述引物2在反应体系中的终浓度为0.2μM，所述引物3和所述引物4在反应体系中的终浓度为1.6μM，所述引物5和所述引物6在反应体系中的终浓度为0.8μM。所述反应体系(25μl)具体可由1-2μl所述基因组DNA与23-24μl所述试剂组成。
本发明提供的方法是利用实时荧光环介导等温扩增(real-time fluorescence LAMP,RealAmp)特异性的对土壤和植物病残体中的肿囊腐霉(包括菌丝体和卵孢子)进行快速定量检测。本发明提供的方法具有不需要借助昂贵仪器和试剂，检测结果直观、可靠，不受检测场地限制，适应在田间进行大规模检测的优点。本发明提供的方法将在玉米青枯病的预防和诊断等方面发挥重要的作用，应用前景广阔。
附图说明
图1为肿囊腐霉RealAmp引物的序列在目标序列上对应的位置信息。
图2为肿囊腐霉RealAmp引物特异性检测1。
图3为肿囊腐霉RealAmp引物特异性检测2。
图4为RealAmp检测灵敏度分析。
图5为RealAmp检测人工接种的土壤样品中的肿囊腐霉卵孢子的灵敏度分析。
图6为RealAmp对田间样品的肿囊腐霉检测。
如在实施例中无特殊说明，上述图中的Negative control均代表阴性对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)：在文献“楼兵干,张炳欣.基于rDNA ITS序列探讨部分腐霉种的系统发育与其形态特征[J]菌物学报,2005,24(2):207-220；(2)Asano T,Senda M,Suga H,et al.Development of mμltiplex PCR to detect five Pythiumspecies related to turfgrass diseases[J].J Phytopathol,2010,158:609-615”中公开过，公众可从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。
肿囊腐霉(Pythium inflatum)：在文献“(1)Asano T,Senda M,Suga H,et al.Development of mμltiplex PCR to detect five Pythium species related to turfgrassdiseases[J].J Phytopathol,2010,158:609-615；(2)Long Y Y,Wei J G,Huang C L,et al.Anew Pythium species isolated from vegetable fields and analysis by rDNA ITS sequence[J].Mycosystema,2010,29:795-800；(3)Wang P H,Wang Y T,White J G.Species-specificPCR primers for Pythium developed from ribosomal ITS1region[J].Lett Appl Microbiol,2003,37:127-132；(4)Lévesque C A,de Cock A W.Molecμlar phylogeny and taxonomy ofthe genus Pythium[J].Mycol Res,2004,108:1363-1383”中公开过，公众可从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。
禾生腐霉(Pythium graminicola)：在文献“(1)Asano T,Senda M,Suga H,et al.Development of mμltiplex PCR to detect five Pythium species related to turfgrassdiseases[J].J Phytopathol,2010,158:609-615；(2)楼兵干,张炳欣.基于rDNA ITS序列探讨部分腐霉种的系统发育与其形态特征[J]菌物学报,2005,24(2):207-220”中公开过，公众可从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。
周雄腐霉(Pythium periilum)：在文献“Long Y Y,Wei J G,Huang C L,et al.A newPythium species isolated from vegetable fields and analysis by rDNA ITS sequence[J].Mycosystema,2010,29:795-800”中公开过，公众可从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。
广西腐霉(Pythium guangxiensis)：在文献“Long Y Y,Wei J G,Huang C L,et al.Anew Pythium species isolated from vegetable fields and analysis by rDNA ITS sequence[J].Mycosystema,2010,29:795-800”中公开过，公众可从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。
链状腐霉(Pythium catenμlatum)：在文献“Kageyama K,Ohyama A,HyakumachiM.Detection of Pythiumμltimum using polymerase chain reaction with species-specificPrimers[J].Plant Dis,1997,81:1155-1160”中公开过，公众可从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。
强雄腐霉(Pythium arrhenomanes)：在文献“Asano T,Senda M,Suga H,et al.Development of mμltiplex PCR to detect five Pythium species related to turfgrassdiseases[J].J Phytopathol,2010,158:609-615”中公开过，公众可从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。
棘腐霉(Pythium acanthicum)：在文献“(1)Asano T,Senda M,Suga H,et al.Development of mμltiplex PCR to detect five Pythium species related to turfgrassdiseases[J].J Phytopathol,2010,158:609-615；(2)楼兵干,张炳欣.基于rDNA ITS序列探讨部分腐霉种的系统发育与其形态特征[J]菌物学报,2005,24(2):207-220”中公开过，公众可从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。
顶生腐霉(Pythium acrogenum)：在文献“Ho H H,Chen X X,Zheng H C,et al.Theoccurrence and distribution of Pythium species on Hainan island of south China[J].Botanical Studies,2012,53:525-534”中公开过，公众可从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。
林栖腐霉(Pythium sylvaticum)：在文献“楼兵干,张炳欣.基于rDNA ITS序列探讨部分腐霉种的系统发育与其形态特征[J]菌物学报,2005,24(2):207-220”中公开过，公众可从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。
间型腐霉(Pythium intermedium)：在文献“Asano T,Senda M,Suga H,et al.Development of mμltiplex PCR to detect five Pythium species related to turfgrassdiseases[J].J Phytopathol,2010,158:609-615”中公开过，公众可从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。
终极腐霉(Pythiumμltimum)：在文献“楼兵干,张炳欣.基于rDNA ITS序列探讨部分腐霉种的系统发育与其形态特征[J]菌物学报,2005,24(2):207-220”中公开过，公众可从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。
辣椒疫霉(Phytophthora capasici)：在文献“崔晓岚,孟庆晓,毕扬,等.辣椒疫霉对烯酰吗啉的敏感性基线及室内抗药突变体研究[J]植物病理学报,2009,39(6):630-637”中公开过，公众可从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。
禾谷镰刀菌(F.graminearum)：在文献“(1)Zhang X,Zhang H,Pu J,et al.Development of a real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification assay forrapid and quantitative detection of Fusarium oxysporum f.sp.cubense Tropical Race 4insoil[J].Plos One,2014,9(1).doi:10.1371/annotation/8a1fd6a3-754f-42e2-a906-9d224167344e.(2)何婧,郭庆元,王哓鸣,等.利用ISSR技术分析禾谷镰孢菌群体遗传多样性的研究[J]植物病理学报,2011,19(2):129-134”中公开过，公众可从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。
新月弯孢霉(Curvμlaria lunata)：在文献“Zhang X,Zhang H,Pu J,et al.Development of a real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification assay forrapid and quantitative detection of Fusarium oxysporum f.sp.cubense Tropical Race 4insoil[J].Plos One,2014,9(1).doi:10.1371/annotation/8a1fd6a3-754f-42e2-a906-9d224167344e.”中公开过，公众可从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。
甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus)：在文献“Cao Y,Shi Y,Li Y,et al.Possibleinvolvement of maize Rop1in the defence responses of plants to viral infection[J].MolPlant Pathol,2012,13:732-743”中公开过，公众可从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。
实施例1、实时荧光环介导等温扩增定量检测肿囊腐霉方法的建立
一、病原菌
本发明涉及到的腐霉菌和其他病原物如表1所示。
表1本发明中涉及到的腐霉菌和其他病原物
*Phylogenetic clades in Pythium and Phytophthora species provided by Lévesque andde Cock(2004)and Long et al.(2010),respectively.
腐霉菌和疫霉菌的遗传分支划分标准分别基于[Lévesque and de Cock(2004)Molecμlar phylogeny and taxonomy of the genus Pythium.Mycological Research,108,1363–1383.]和[Long,Y.Y.,Wei,J.G.,Huang,C.L.,He,Y.Q.,Yuan,G.Q.,Shi,Y.,&Xiong,Y.(2010).A new Pythium species isolated from vegetable fields and analysis by rDNA ITSsequence.Mycosytema,295,795–800.]的文献描述。
LAMP：环介导等温扩增；+：阳性扩增；-：阴性扩增。
参考文献：
1.楼兵干,张炳欣.基于rDNA ITS序列探讨部分腐霉种的系统发育与其形态特征[J]菌物学报,2005,24(2):207-220
2.Asano T,Senda M,Suga H,et al.Development of mμltiplex PCR to detect five Pythiumspecies related to turfgrass diseases[J].J Phytopathol,2010,158:609-615
3.Long Y Y,Wei J G,Huang C L,et al.A new Pythium species isolated from vegetablefields and analysis by rDNA ITS sequence[J].Mycosystema,2010,29:795-800
4.Wang P H,Wang Y T,White J G.Species-specific PCR primers for Pythium developedfrom ribosomal ITS1region[J].Lett Appl Microbiol,2003,37:127-132
5.Lévesque C A,de Cock A W.Molecμlar phylogeny and taxonomy of the genusPythium[J].Mycol Res,2004,108:1363-1383
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二、菌丝体和卵孢子的制备
1、菌丝体的制备
将表1中的腐霉菌菌丝体转移到覆盖有玻璃纸(GE Healthcare Bio-Sciences Inc.,Piscataway,NJ,USA)的PDA培养基上培养，25℃培养一段时间后，收集各腐霉菌的菌丝体，所有的其他种类真菌在未覆盖玻璃纸的PDA培养基上培养，收集菌丝体。
其中，PDA培养基的配制方法如下：马铃薯200g去皮切成小块，加水煮沸20～30min后用8层纱布过滤，加入10g葡萄糖，10g琼脂，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，分装试管或者锥形瓶，121℃灭菌20min左右后取出试管摆斜面或者平板，冷却后贮存备用。
2、孢子的制备
将肿囊腐霉(P.inflatum)转移到V8蔬菜汁培养基(配方详见“Abdelzaher H,IchitaniT,Elnaghy M.Effect of temperature,hydrogen ion concentration and osmotic potential onoospore germination of five Pythium spp.isolated from pond water[J].Mycoscience,1994,35,315–318”一文)，于25℃黑暗条件下培养7d-14d，诱导肿囊腐霉卵孢子形成，得到肿囊腐霉卵孢子培养液；将肿囊腐霉卵孢子培养液通过70％的蔗糖垫(2500rpm)，在圆形离心管底部收集肿囊腐霉卵孢子，并用血细胞计数板(德国ISOLAB)将其浓度调至108个/ml，得到肿囊腐霉卵孢子悬浮液。
三、土壤样品的制备
在15ml锥形管中加入10g经过2轮消毒灭菌的土壤基质，加入1ml步骤二制备的肿囊腐霉卵孢子悬浮液(含108个孢子)，25℃下黑暗培养10d，在室温下干燥3d，将其于液氮中研磨成细粉末，制备成人工接种的土壤样品，-80℃保存。
四、DNA提取
将步骤三制备的人工接种的土壤样品、步骤二制备的肿囊腐霉卵孢子悬浮液、步骤二制备的菌丝体用E–ZFungal DNA试剂盒(Omega Bio-Tek,Norcross,GA,USA)提取肿囊腐霉基因组DNA。
五、LAMP引物的设计和合成
采用引物设计软件设计了十几套根据软件分析预测可行的候选引物。对这些候选引物进行实际扩增检测试验，筛选出特异性强灵敏度高的引物。结果显示表2中的LAMP引物能够实现对肿囊腐霉的特异性扩增，且灵敏度较好；而其他的引物或者不能扩增出任何条带，或者不能实现对肿囊腐霉的特异性扩增，或扩增效率低。因此本发明的发明人选择了表2中的引物作为特异性检测肿囊腐霉的LAMP引物。
外部引物：F3(上游外部引物)/B3(下游外部引物)、上下游内部引物：FIP(上游内部引物)/BIP(下游内部引物)、环引物：LoopF(上游环引物)/LoopB(下游环引物)。其中LAMP引物中各条引物序列在目标序列上对应的位置信息如图1所示。
表2肿囊腐霉RealAmp引物
六、RealAmp反应标准曲线的建立
(一)RealAmp反应体系及条件根据在已有方法的基础上进行修改，具体如下：
RealAmp反应体系：1.6μM FIP/BIP、0.2μM F3/B3，12.5μl LAMP反应缓冲液[1.6mM dNTPs、1M甜菜碱、8mM MgSO4、20mM Tris-HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、0.1％(v/v)Triton X-20(Deao Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,China)]，8U Bst DNA聚合酶(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)，0.2mMSYTO-9荧光染料(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)]，1-2μl步骤四提取的DNA或用于建立标准曲线的DNA样品，ddH2O将最终体系定容至25μl。如无特殊说明，各物质的浓度均为在均指在反应体系中的最终浓度。
用于建立标准曲线的DNA样品的制备按照以下方案进行：
将pPiITS质粒(pPiITS质粒的结构描述为：在pMD18-T载体上正向连接序列表中序列7所示的肿囊腐霉的ITS序列后得到的重组质粒)DNA浓度调至100ng/μl，以10倍浓度梯度进行稀释(1×100～1×10-7)，然后与从1g土壤(经过2次高温高压灭菌)中提取的DNA混合，制备成标准曲线DNA样品1。
收集1ml卵孢子(108)悬浮液，提取DNA，以10倍浓度梯度进行稀释(1×108～1×101)，然后与从1g土壤(经过2次高温高压灭菌)中提取的DNA混合，制备成标准曲线DNA样品2。
上述RealAmp反应体系中的FIP、BIP、F3、B3均为表2中LAMP引物。如果为了加快反应的速度，可以在反应体系中加入环引物LoopF/LoopB(0.8μM)。内引物FIP与BIP的浓度相同(1.6μM)，外引物F3、B3的浓度相同(0.2μM)，LoopF/LoopR的浓度相同，即FIP/BIP、F3/B3、LoopF/LooR三者在反应体系中的摩尔比为8:1:4。
在RealAmp反应进行前，在反应液表面加入25μl矿物油避免反应液蒸发，在反应管盖子内部中间加入1μl SYBR Green I(Invitrogen)，SYBR Green I作为荧光增补染料，在反应完成后与反应体系充分接触，如果存在扩增产物，伴随RealAmp反应产生焦磷酸酶沉淀，加入SYBR Green I后，RealAmp反应液具有由橘黄色变为绿色的变化。
在ESE-Quant Tube Scanner管内比色/荧光检测系统(Embedded SystemsEngineering GmbH,Stockach,Germany)运行RealAmp反应体系，最佳扩增温度为63℃、最佳反应时间为60min(60℃-65℃反应，20-90min均可)，每间隔1min采集1次荧光信号，通过6-羧基荧光素通道(487nm激发,525nm检测)收集荧光数据。将荧光达到阈值时的时间点确定为时间阈值(threshold time,Tt))。反应完成后，得到ESE-QuantTube Scanner产生的扩增曲线，y轴代表荧光单元(mV)，x轴代表反应时间(min)。
(二)RealAmp反应是否为阳性反应可以通过如下方法进行分析
1、琼脂糖凝胶(2％,w/v)电泳检测，如果阳性扩增，则在凝胶上出现的是从点样孔开始由大小不同的区带组成的连续阶梯式图谱。
2、轻柔颠倒反应管，使得反应前加入的SYBR Green I与RealAmp反应液充分接触，根据RealAmp反应液颜色的变化确定是否为阳性扩增(即RealAmp反应中的模板含有肿囊腐霉(P.inflatum)的基因组DNA)，如果有阳性扩增，SYBR Green I与反应液颜色充分接触后，RealAmp反应液的颜色由橘黄色变为绿色。
(三)以模板DNA的质量的对数为横坐标，单位为ng，以反应时间阈值(threlsholdtime,Tt)为纵坐标，单位为min，建立RealAmp反应标准曲线，得到标准曲线公式。
七、待测DNA样品的检测
以待测DNA样品或其稀释液为模板，进行步骤六中(一)所示的RealAmp反应，得到相应的应时间阈值(threlshold time,Tt)，带入步骤六构建的标准曲线公式，计算得到待测DNA样品中肿囊腐霉(P.inflatum)基因组DNA的质量。
实施例2、RealAmp引物特异性检测
一、提取表1中肿囊腐霉(P.inflatum)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)的两种分离物TR4和FGHN09-1-1、新月弯孢霉(C.lunata)、辣椒疫霉(Phytophthora capasici)和甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus)的病原菌的基因组DNA，分别以其为模板，进行实施例1中步骤六中(一)所示的RealAmp反应，得到各菌的RealAmp反应产物。
二、同时提取表1中甘蔗花叶病毒(Suagrcane mosaic virus,SCMV)的RNA，并反转录为cDNA，以其为模板，进行实施例1中步骤六中(一)所示的RealAmp反应，得到SCMV的RealAmp反应产物。
三、分别以步骤一和步骤二得到的各RealAmp反应产物为模板，以F3和B3为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(扩增片段长度为283bp)，进一步验证表2中各LAMP引物组合中引物的特异性。
F3：5′-TCTTCGGAGGAGAAGACG-3′(序列1)
B3：5′-CAGCAACCATCTACTACACAA-3′(序列2)
如果PCR扩增产物的长度为283bp，则表明RealAmp反应的模板DNA包含肿囊腐霉(P.inflatum)的基因组DNA。
同时以包含香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense TropicalRace 4)基因间隔区(intergenic spacer)序列的质粒DNA和ddH2O为模板，进行上述步骤一至步骤三的实验，分别作为RealAmp阳性对照和阴性对照，阳性模板扩增泳道的LAMP引物序列具体参照“Zhang X,Zhang H,Pu J,et al.Development of a real-timefluorescence loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and quantitativedetection of Fusarium oxysporum f.sp.cubense”和“Tropical Race 4in soil[J].Plos One,2014,9(1).doi:10.1371/annotation/8a1fd6a3-754f-42e2-a906-9d224167344e.”。
四、将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示。
图2中，a为步骤一和步骤二的RealAmp反应产物的琼脂糖凝胶电泳检测。泳道1、2分别为RealAmp阳性对照和阴性对照；泳道3～泳道8：肿囊腐霉(P.inflatum)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)的两种分离物TR4和FGHN09-1-1、新月弯孢霉(C.lunata)、辣椒疫霉(Phytophthora capasici)和甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus)的RealAmp反应产物；泳道M为D2000DNA分子量标准。
b为步骤三的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测。泳道D为50bp DNA分子量标准；泳道1、2分别为RealAmp阳性对照和阴性对照；泳道3～泳道8：肿囊腐霉(P.inflatum)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)的两种分离物TR4和FGHN09-1-1、新月弯孢霉(C.lunata)、辣椒疫霉(Phytophthora capasici)和甘蔗花叶病毒(Sugarcanemosaic virus)的PCR扩增产物。
五、将肿囊腐霉(P.inflatum)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)的两种分离物TR4和FGHN09-1-1、新月弯孢霉(C.lunata)、辣椒疫霉(Phytophthora capasici)和甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus)的RealAmp反应液与反应前加入的SYBR Green I充分接触，根据反应液颜色的变化确定是否为阳性扩增，如果有阳性扩增(即RealAmp反应中的模板含有肿囊腐霉(P.inflatum)的基因组DNA)，RealAmp反应液的颜色由橘黄色变为绿色，结果如图2中c所示。
图2的c中，1和2分别为阳性对照和阴性对照；3-8分别为肿囊腐霉(P.inflatum)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)的两种分离物TR4和FGHN09-1-1、新月弯孢霉(C.lunata)、辣椒疫霉(Phytophthora capasici)和甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus)的RealAmp反应液。
六、RealAmp反应结束后，由ESE-Quant Tube Scanner生成的扩增图如图2中d所示。
图2的d中，1和2分别为阳性对照和阴性对照；3-8分别为肿囊腐霉(P.inflatum)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)的两种分离物TR4和FGHN09-1-1、新月弯孢霉(C.lunata)、辣椒疫霉(Phytophthora capasici)和甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus)的RealAmp反应。y轴代表荧光强度(mV)，x轴代表反应时间(min)。
图2中a表明，只有以肿囊腐霉(P.inflatum)的基因组DNA为模板得到的RealAmp反应产物具有阶梯状条带。图2中b表明，只有以肿囊腐霉(P.inflatum)的RealAmp反应产物为模板，以F3和B3为引物，进行PCR扩增得到的PCR扩增产物中有283bp特异性目的条带。图2中c表明，以肿囊腐霉(P.inflatum)的基因组DNA为模板进行RealAmp反应得到的RealAmp反应液，在加入SYBR Green I后颜色由橘黄色变为绿色，而其他反应液的颜色保持不变。图2中d表明，ESE-Quant Tube Scanner产生的扩增曲线中，只有以肿囊腐霉(P.inflatum)的基因组DNA为模板的RealAmp反应体系具有特异性的扩增，具有荧光信号。
七、以表1中的肿囊腐霉属真菌的基因组DNA为模板，进行上述实验，按照步骤一得到的P.inflatum(MAFF305863),P.inflatum(GuoLD001447),P.graminicola(MAFF425415),P.acanthicum(MAFF425319),P.arrhenomanes(E-1)和P.guangxiensis(GuoLD001418)的RealAmp反应产物，按照步骤三得到其对应的PCR扩增产物，并进行步骤四至步骤六的检测，结果如图3所示。
图3中的a为RealAmp反应产物的琼脂糖凝胶电泳检测。泳道1、2分别为RealAmp阳性对照和阴性对照；泳道3～泳道8：P.inflatum(MAFF305863)，P.inflatum(GuoLD001447)，P.graminicola(MAFF425415)，P.acanthicum(MAFF425319)，P.arrhenomanes(E-1)和P.guangxiensis(GuoLD001418)的RealAmp反应产物；泳道M为D2000DNA分子量标准。
图3中的b为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测。泳道D为50bp DNA分子量标准；泳道1、2分别为RealAmp阳性对照和阴性对照；泳道3～泳道8：P.inflatum(MAFF305863)，P.inflatum(GuoLD001447)，P.graminicola(MAFF425415)，P.acanthicum(MAFF425319)，P.arrhenomanes(E-1)和P.guangxiensis(GuoLD001418)的PCR扩增产物。
图3中的c为RealAmp反应液的颜色的变化。1和2分别为RealAmp阳性对照和阴性对照；3～8分别为P.inflatum(MAFF305863)，P.inflatum(GuoLD001447)，P.graminicola(MAFF425415)，P.acanthicum(MAFF425319)，P.arrhenomanes(E-1)和P.guangxiensis(GuoLD001418)的RealAmp反应液。
图3中的d为RealAmp反应结束后，由ESE-Quant Tube Scanner生成的扩增图。1和2分别为RealAmp阳性对照和阴性对照；3～8分别为P.inflatum(MAFF305863)，P.inflatum(GuoLD001447)，P.graminicola(MAFF425415)，P.acanthicum(MAFF425319)，P.arrhenomanes(E-1)和P.guangxiensis(GuoLD001418)的RealAmp反应。y轴代表荧光强度(mV)，x轴代表反应时间(min)。
图3的结果与图2的结果一致，只有以肿囊腐霉(P.inflatum)的基因组DNA为模板得到的RealAmp反应产物具有阶梯状条带，只有以肿囊腐霉(P.inflatum)的RealAmp反应产物为模板，以F3和B3为引物，进行PCR扩增得到的PCR扩增产物中有283bp特异性目的条带，并且以肿囊腐霉(P.inflatum)的基因组DNA为模板进行RealAmp反应得到的RealAmp反应液，在加入SYBR Green I后颜色由橘黄色变为绿色，而其他反应液的颜色保持不变，只有以肿囊腐霉(P.inflatum)的基因组DNA为模板的RealAmp反应体系能进行特异性的扩增，具有荧光信号。
将P.inflatum(MAFF305863)，P.inflatum(GuoLD001447)的RealAmp反应产物进行测序，测序结果表明该产物的序列与P.inflatum ITS序列(序列7)一致。
实施例3、RealAmp反应灵敏度的检测
一、将含有肿囊腐霉(P.inflatum)ITS序列的片段(序列7)插入pMD18-T载体上，得到重组质粒，将其命名为pPiITS，将pPiITS送测序，结果正确。pPiITS质粒的结构描述为：在pMD18-T载体上正向连接序列表中序列7所示的肿囊腐霉的ITS序列后得到的重组质粒。
二、将pPiITS质粒用ddH2O调至100ng/μl，并进一步以10倍浓度梯度进行稀释，得到1.0×101ng/μl、1.0×100ng/μl、1.0×10-1ng/μl、1.0×10-2ng/μl、1.0×10-3ng/μl、1.0×10-4ng/μl、1.0×10-5ng/μl的pPiITS质粒梯度稀释溶液。
将1g不含肿囊腐霉的土壤经过2次高温高压灭菌后提取总DNA(DNA提取方法具体参照“Wang PH,Chang CW.Detection of the low-germination-rate resting oospores ofPythium miriotylum from soil by PCR[J].Lett Appl Microbiol,2003,36:157–161”一文进行)，将1μl各pPiITS质粒梯度稀释溶液与1μl土壤DNA混合。
三、以步骤二得到的2μlDNA混合液为模板，进行实施例1中步骤六(一)所示的RealAmp反应，得到RealAmp反应产物，RealAmp反应产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4中a所示。
图4的a中，泳道M为D2000分子量标准，泳道1-7：1.0×101ng/μl、1.0×100ng/μl、1.0×10-1ng/μl、1.0×10-2ng/μl、1.0×10-3ng/μl、1.0×10-4ng/μl、1.0×10-5ng/μl的pPiITS质粒为模板的RealAmp反应产物；泳道8：阴性对照(以ddH2O为模板)。
四、将步骤三得到的RealAmp反应液与SYBR Green I充分接触，根据反应液颜色的变化确定是否为阳性扩增(即RealAmp反应中的模板含有肿囊腐霉(P.inflatum)的基因组DNA)，如果有阳性扩增，反应液的颜色由橘黄色变为绿色，结果如图4中b所示。
图4的b中，1-8分别为1.0×101ng/μl、1.0×100ng/μl、1.0×10-1ng/μl、1.0×10-2ng/μl、1.0×10-3ng/μl、1.0×10-4ng/μl、1.0×10-5ng/μl的pPiITS为模板的RealAmp反应产物。
五、RealAmp反应结束后，由ESE-Quant Tube Scanner生成的扩增图如图4中c所示。
图4的c中，y轴代表荧光强度(mV)，x轴代表反应时间(min)。
六、RealAmp反应结束后，以起始DNA质量的对数为横坐标、以反应时间阈值(Tt)为纵坐标，制作标准曲线，如图4中d所示。
图4的a表明，RealAmp能够检测的质粒DNA和土壤DNA混合模板最低浓度为0.1pg/μl，图4的b表明，SYBR Green I染色结果表明，RealAmp扩增的模板DNA浓度范围为10ng/μl～1.0×10-4ng/μl，图4的c所示的ESE-Quant tube scanner扩增曲线表明，在模板浓度10ng/μl～1.0×10-4ng/μl梯度范围内，除阴性对照和模板浓度为1.0×10-5ng/μl的RealAmp反应体系以外，其余反应体系的反应产物以指数级增长，图4的d表明，浓度模板扩增的反应时间阈值(Tt)与对应的模板DNA质量的对数之间具有线性关系(R2>0.99,P<0.05)。
实施例4、RealAmp检测人工接种的土壤样品中的卵孢子的灵敏度分析
一、稀释实施例1中步骤二制备的肿囊腐霉卵孢子悬浮液，得到孢子浓度分别为1.0×106个/μl、1.0×105个/μl、1.0×104个/μl、1.0×103个/μl、1.0×102个/μl、1.0×101个/μl、1.0×100个/μl的卵孢子悬浮液的滴度稀释液。
提取1μl的各卵孢子悬浮液的滴度稀释液的基因组DNA，以其模板，进行实施例1中步骤六(一)所示的RealAmp反应，同时以ddH2O为模板，进行该反应，作为阴性对照。
RealAmp反应结束后，由ESE-Quant Tube Scanner生成的扩增图如图5中a所示。
二、将实施例1中步骤二制备的肿囊腐霉卵孢子悬浮液与经过2轮消毒灭菌的土壤基质混匀，制成含有1.0×106个孢子/g土壤、1.0×105个孢子/g土壤、1.0×104个孢子/g土壤、1.0×103个孢子/g土壤、1.0×102个孢子/g土壤、1.0×101个孢子/g土壤、1.0×100个孢子/g土壤的土壤样品，提取土壤样品DNA。
以土壤样品的DNA为模板，进行实施例1中步骤六(一)所示的RealAmp反应，同时以没有加入肿囊腐霉孢子的土壤中提取的DNA为模板，进行该反应，作为阴性对照。
RealAmp反应结束后，由ESE-Quant Tube Scanner生成的扩增图如图5中b所示。
图5表明，在未接种的卵孢子的土壤样品中(阴性对照)的RealAmp反应均没有阳性扩增产物，RealAmp对土壤样品的肿囊腐霉卵孢子浓度检测最低值为103个孢子/g土壤(图5中b)，对卵孢子悬浮液的肿囊腐霉卵孢子浓度检测最低值为103个/μl(图5中a)。
实施例5、通过RealAmp对田间样品进行肿囊腐霉(P.inflatum)检测
一、采集160份土壤和玉米病残体样品，提取其中的DNA，以其为模板，进行实施例1中步骤六(一)所示的RealAmp反应，结果表明，160份样品中，145份经RealAmp检测为肿囊腐霉(P.inflatum)阳性，剩余15份样品为肿囊腐霉(P.inflatum)阴性。
二、以步骤一中提取的160份土壤和玉米病残体样品的DNA为模板，以ITSqF(5′-TTGGCGGTATGTTAGGCTTC-3′)和ITSqR(5′-TGGTGTTGCCTTCTTTACCC-3′)为引物，进行Real-time PCR扩增。
Real-time PCR在PRISMH 7500Fast Real-Time PCR(Applied Biosystems)上进行。Real-time PCR反应体系为25μl，反应条件为：95℃变性5min,40个循环(95℃变性15s,60℃退火30s,72℃延伸15s)。反应完成后，65℃～99℃范围内生成融解曲线，根据仪器自带的软件包进行Ct值计算、生成扩增曲线，结果表明，绝大多数样品的Real-timePCR结果与RealAmp表现一致。
三、将经步骤二的Real-time PCR检测表现为肿囊腐霉(P.inflatum)阴性的2份样品用PDA斜面培养基分离培养，培养出菌丝后，转移到PDA平板上生长，提取菌丝基因组DNA，再以其为模板，分别进行步骤一的RealAmp检测和步骤二的Real-time PCR检测，两个检测结果均表明2份样品均为肿囊腐霉(P.inflatum)阳性。
同一批样品，RealAmp和Real time的阳性检测率分别为90.6％(145/160)和89.4％(143/160)。
其中，经步骤二的Real-time PCR检测表现为肿囊腐霉(P.inflatum)阴性的2份样品、6份经步骤二的Real-time PCR检测表现为肿囊腐霉(P.inflatum)阳性的样品的RealAmp检测结果如图6中a所示。
图6中，Negative control代表经步骤二的Real-time PCR检测表现为肿囊腐霉(P.inflatum)阴性的样品，1-6分别代表经步骤二的Real-time PCR检测表现为肿囊腐霉(P.inflatum)阳性的样品。
将上述样品的Real-time PCR和RealAmp定量检测结果进行统计分析，结果如图6中b所示。图6的b表明，上述样品在Real-time PCR和RealAmp的定量分析上没有明显差异。

Claims (10)

1.检测肿囊腐霉的环介导等温扩增引物组，为引物组A或引物组B；所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；
所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
2.检测肿囊腐霉的环介导等温扩增试剂，包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dNTPs、Mg2+和权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为5pmol：5pmol：40pmol：40pmol：20pmol：20pmol：40nmol：200nmol：8U：25μmol；或
所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为5pmol：5pmol：40pmol：40pmol：40nmol：200nmol：8U：25μmol。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述链置换型DNA聚合酶为BstDNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。
5.检测肿囊腐霉的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1所述的引物组或权利要求2-4中任一所述的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括荧光染料。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光染料为SYTO-9荧光染料和/或SYBR Green I荧光染料。
8.如下a)或b)的应用：
a)权利要求1所述的引物组在制备权利要求2-4中任一所述试剂或权利要求5-7中任一所述试剂盒中的应用；
b)权利要求1所述的引物组或权利要求2-4中任一所述的试剂或权利要求5-7中任一所述试剂盒在检测肿囊腐霉或制备检测肿囊腐霉的产品中的应用。
9.检测或辅助检测待测样品中是否含有肿囊腐霉的方法，包括如下(a)和(b)的步骤：
(a)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物组进行环介导等温扩增；
(b)根据步骤(a)的扩增结果，按照如下(b1)或(b2)的方法确定所述待测样品中是否含有肿囊腐霉：
(b1)反应结束后，将所述待测样品的反应液进行琼脂糖凝胶电泳，若出现阶梯状条带，则所述待测样品中含有或候选含有肿囊腐霉；反之，则所述待测样品不含或候选不含有肿囊腐霉；
(b2)反应结束后，向所述待测样品的反应液中加入SYBR Green I荧光染料，然后观察所述反应液的颜色变化；
若所述待测样品反应液为绿色，则所述待测样品中含有或候选含有肿囊腐霉；若所述待测样品反应液为橘黄色，则所述待测样品中不含有或候选不含有肿囊腐霉。
10.检测待测样品中肿囊腐霉含量的方法，包括如下(c)和(d)的步骤：
(c)以具有序列表中序列7的第406-688位所示核苷酸序列的DNA样品作为肿囊腐霉标准品，将所述肿囊腐霉标准品进行梯度稀释，以所得系列浓度的所述肿囊腐霉标准品的溶液分别作为模板，用权利要求1所述引物组进行实时荧光环介导等温扩增，获得对应于各所述肿囊腐霉标准品的溶液的反应时间阈值，以所述反应时间阈值为纵坐标，以所述肿囊腐霉标准品的溶液中所述肿囊标准品的浓度为横坐标，得到标准曲线方程；
(d)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物组进行实时荧光环介导等温扩增，获得对应于所述待测样品的基因组DNA的反应时间阈值，然后根据所述标准曲线方程计算得到所述待测样品中肿囊腐霉的含量。
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