KR101564823B1 - 곰팡이의 검출 방법, pcr용 반응액 및 곰팡이 검출용 담체 - Google Patents

Abstract

곰팡이의 존재여부를 확인하는 검사에서 광범위한 종류의 곰팡이를 정밀도 높게 특이적으로 검출할 수 있다. 곰팡이의 DNA에서의 표적 영역을 포함한 DNA단편을 증폭시켜서 증폭 산물의 유무를 확인하는 공정을 포함한 곰팡이의 검출 방법이며, 표적 영역으로서, ITS영역 및 β-튜불린 유전자를 사용하는 방법으로 한다. 또한, 표적 영역의 증폭을 하기 위한 PCR용 반응액에서 β-튜불린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트와 ITS영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트의 농도비를 1:0.9~1:0.1로 한다.

Description

곰팡이의 검출 방법, PCR용 반응액 및 곰팡이 검출용 담체 {Method for detecting fungi, reaction solution for PCR, and carrier for detecting fungi}

본 발명은 곰팡이의 검출 방법에 관한 것이며 특히 광범위한 종류의 곰팡이를 정밀도 높게 특이적으로 검출하기 위한 곰팡이의 검출 방법, PCR용 반응액 및 곰팡이 검출용 담체에 관한 것이다.

최근 식품 제조 현장이나 임상 현장, 문화재 보호 환경 등에서 곰팡이 등의 미생물의 존재 여부를 검사하여 안전성을 확인하는 동시에 그 번식을 방지하는 것이 중요하다.

이러한 곰팡이의 검사에서는 일반적으로 환경 중에서 시료를 채취해서 선 배양하고, 이어서 균 종마다 최적의 배지에서 20일 정도의 배양을 한 후, 형태적 특징을 관찰함으로써 곰팡이를 동정하는 형태 관찰 법(배양법)이 이루어지고 있다(특허 문헌 1참조).

하지만 이 방법으로는 곰팡이 종류마다 분리 배양 할 필요가 있기 때문에, 검사 공정이 번잡하게 된다는 문제가 있었다. 또한, 배양에 장기간을 필요로 하므로 예를 들면 사람이 생활하는 건물내 검사나 음식물의 검사 등 신속성이 요구되는 검사에는 부적절하다는 문제가 있었다. 더욱이 형태적 특징을 나타내는 포자가 형성되지 않으면 동정을 할 수 없어서 노력이 헛되이 되는 경우가 있다는 문제도 있었다.

또한 최근에는 곰팡이의 검사에서 유전자를 사용한 동정법도 이루어지고 있다. 예를 들면, 환경 중에서 채취한 시료를 배양한 후, 배양 세포에서 DNA를 추출하여 PCR(중합 효소 연쇄 반응)법에 의해서 목표 영역을 증폭하여 그 증폭 산물을 해석하므로써, 시료 중의 곰팡이의 동정이 행해지고 있다. 증폭 산물을 해석하는 방법으로서는 예를 들면 전기 영동을 통해서 증폭 산물의 크기를 분석하는 방법이나, 증폭 산물과 상보적으로 결합하는 프로브를 고정화한 DNA칩을 사용해서 시료 중에 존재하는 곰팡이를 동정하는 방법 등이 제안되고 있다(특허 문헌 2~6참조).

[특허 문헌 1] 일본특허공개공보 특개 2007-195454호 공보 [특허 문헌 2] 일본특허공개공보 특개 2008-35773호 공보 [특허 문헌 3] 일본특허공개공보 특개 2008-278848호 공보 [특허 문헌 4] 일본특허공개공보 특개 2008-278861호 공보 [특허 문헌 5] 일본특허공개공보 특개 2010-4879호 공보 [특허 문헌 6] 일본특허공개공보 특개 2009-284832호 공보

그러나 이러한 유전자를 사용한 동정법에 의해서도, 곰팡이 종류내의 유사성이 높은 경우에는 단일 표적 유전자의 유무나 사이즈만으로 종을 특정하는 것은 매우 어려우며, 예를 들면 종 수준의 동정 정확도가 요구되는 검사에는 적합하지 않다는 문제가 있었다.

여기서 특허 문헌 2~4에서는 각종 곰팡이의 유전자에서의 ITS(Internal Transcribed Spacer)영역을 증폭 대상 영역으로서, 동정이 이루어지고 있다. 이러한 ITS영역에 의거한 곰팡이의 동정에서는 곰팡이의 종류가 증가함에 따라 위양성 반응도 증가하고 검사 정밀도가 저하되어 버린다는 문제가 있었다.

한편 특허 문헌 5,6에는 β-튜불린 유전자를 증폭 대상 영역으로서 동정을 하는 것이 기재되어 있다. 이들 문헌에는 β-튜불린 유전자를 증폭 대상 영역으로 함으로써, 특정 종류의 곰팡이를 검출할 수 있는 것으로 나타났다.

그러나 β-튜불린 유전자만을 증폭 대상 영역으로 하면 ITS영역만을 증폭 대상 영역으로 하는 경우와 마찬가지로 위양성 반응이 생기는 경우가 있다는 문제가 있었다.

그래서 본 발명자들은 예의 연구한 결과, ITS영역과 β-튜불린 유전자 양쪽을 증폭 대상 영역으로서 사용함으로써 광범위한 종류의 곰팡이를 정밀도 높게 검출하는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다. 또한, ITS영역과 β-튜불린 유전자를 동시 반응계에서 효율적으로 증폭시키기 위한 조건도 알아냈다.

그런데, 상기와 같이, 형태 동정을 하는 방법에는 형태적 특징을 발현시키기 위해서 균 종마다 최적인 배지와 장기간의 배양이 필요하며, 또한 동정에는 숙련이 필요해지므로 신속한 검사나 검사의 간이화에 적합하지 않다는 문제가 있었다.

또한 PCR 및 배열 해석에 의한 방법에서도 균 종마다 개별적으로 배양하기 위해서 14일 정도의 비교적 긴 검사 기간이 필요하며, 또한 균들마다 개별적으로 해석할 필요가 있으므로 다 검체 처리가 요구될 경우에 적합하지 않다는 문제가 있었다.

이에 대해 DNA칩에 의한 새로운 검출 방법에 의하면 이론상, 복수 종류의 곰팡이를 일괄해서 검출이 가능하며 신속하고 간단한 검사 방법으로서 기대되고 있다.

한편, 곰팡이는 생육에 적합한 습도에 따라 호 건성 곰팡이(건조 상태를 좋아하는), 내 건성 곰팡이(건조에 견딜 수 있는)및 호 습성 곰팡이(습윤 상태를 좋아하는)으로 나뉘고, 이들은 각각에 적합한 다른 배지에 의해서 배양할 필요가 있었다. 또한 전술한 종래 일반적으로 행해지고 있는 제1및 제2의 방법으로는 균 종 별로 배양할 필요가 있어서 복수의 곰팡이를 혼합하여 배양하고 나서 각각의 곰팡이를 개별적으로 검출한다는 개념은 존재하지 않았다. 그래서 호 건성 곰팡이, 내 건성 곰팡이 및 호 습성 곰팡이를 동시에 배양하고, 각각의 곰팡이를 특이적으로 검출 가능하게 하는 기술은 종래에는 존재하지 않았다.

본 발명은 상기 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 시료 중의 곰팡이의 게놈 DNA에서의 ITS영역 및 β-튜불린 유전자를 증폭하고 그 증폭 산물의 유무를 확인함으로써 곰팡이의 동정을 하는 곰팡이의 검출 방법 및 이에 사용 하는 PCR용 반응액 및 곰팡이 검출용 담체의 제공을 목적으로 한다.

또한 복수 종류의 곰팡이를 분리 배양 하지 않고 같은 배지에서 동시에 배양함과 동시에 이들을 혼합하여 일괄해서 게놈 DNA를 추출하여 DNA칩에 의해서 곰팡이를 특이적으로 검출 가능하게 하는 곰팡이의 검사 방법의 제공을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해서 본 발명의 곰팡이의 검출 방법은 곰팡이의 DNA에서의 표적 영역을 포함한 DNA단편을 증폭시키고 증폭 산물의 유무를 확인하는 공정을 포함한 곰팡이의 검출 방법이며, 표적 영역으로서, ITS영역 및 β-튜불린 유전자를 사용하는 방법으로 하고 있다.

이와 같이 증폭의 표적 영역으로서, ITS영역 및 β-튜불린 유전자를 병용하면 이들 중 어느 한쪽만을 표적 영역으로서 사용한 경우에 비해서 위 양성 반응을 저감시킬 수 있다. 그래서 광범위한 곰팡이를 보다 정밀도 높게 검출할 수 있게 된다.

또한 본 발명의 곰팡이의 검출 방법에서 표준 영역의 증폭을 PCR법에 의해 서 실시하는 경우, PCR용 반응액에서의 β-튜불린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트와 ITS영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트와의 농도 비율을 1:0.9~1:0.1로 하는 것이 바람직하다.

프라이머 세트의 농도비를 이렇게 하면, 이러한 프라이머 세트를 함유하는 PCR용 반응액을 사용해서 PCR 반응을 함으로써, ITS영역과 β-튜불린 유전자 양쪽을 함께 효율적으로 증폭할 수 있다. 따라서 이들을 동시에 검출함으로써 곰팡이의 검사를 보다 높은 정밀도로 할 수 있게 된다. 또한 β-튜불린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트 및 ITS영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트의 농도비를 1:0.5~1:0.25라고 하면 이들 양쪽의 증폭 효율을 가장 효율적으로 할 수 있어서 보다 바람직하다.

또한 본 발명의 PCR용 반응 액은, 표적 영역의 증폭을 하기 위한 PCR용 반응액이며, ITS영역을 증폭시키기 위한 프라이머 셋트로서 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 및 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열로 이루어진 리버스 프라이머를 갖춘 프라이머 세트와 β-튜불린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 셋트로서 서열 번호 3에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머 및 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 리버스 프라이머를 갖춘 프라이머 세트를 포함하는 것으로 되어 있다.

PCR용 반응액을 이렇게 하면 각종 곰팡이의 ITS영역과 β-튜불린 유전자 의 양쪽을 증폭시킬 수 있다. 따라서 이들 양쪽의 증폭 산물에 따라 곰팡이의 유무를 판정할 수 있어서 보다 광범위한 곰팡이를 정밀도 높게 검출할 수 있다.

또한 본 발명의 PCR용 반응액을, 클라도스포륨속균을 특이적으로 증폭시키기 위한 포워드 프라이머로서 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프라이머를 더 포함하게 하는 것도 바람직하다.

PCR용 반응액을 이렇게 하면 서열 번호 1~4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프라이머를 포함한 PCR용 반응액을 사용한 것만으로는 효율적으로 증폭할 수 없는 클라도스포륨속균의 DNA단편을 증폭할 수 있으며 해당 균을 적절히 검출할 수 있다.

또한 본 발명의 곰팡이 검출용 담체는 하나 또는 둘이상의 곰팡이의 종류마다 ITS영역에서 선택된 염기 서열을 가진 프로브 및 β-튜불린 유전자에서 선택된 염기 서열을 가진 프로브를 고정화한 것으로 알려져 있다.

곰팡이 검출용 담체를 이렇게 하면 ITS영역과 β-튜불린 유전자를 동시에 증폭해서 얻어진 증폭 산물을 이 곰팡이 검출용 담체에 적하함으로써, 프로브의 염기 서열과 상보적으로 결합하는 DNA를 가진 곰팡이를 검출할 수 있다. 이 곰팡이 검출용 담체에는 곰팡이의 종류마다 ITS영역에서 선택된 염기 서열을 가진 프로브 및 β-튜불린 유전자에서 선택된 염기 서열을 가진 프로브의 양쪽이 고정화되어 있기 때문에 이들 양쪽에 의거하여 곰팡이의 존재 여부 확인을 할 수 있다. 그리고 ITS영역과 β-튜불린 유전자의 양쪽에 검출이 있었을 경우에 곰팡이가 존재한다고 판정함으로써 위양성에 따라 존재한다는 판정이 되는 것을 저감할 수 있어서 보다 높은 정밀도의 곰팡이 검출을 할 수 있게 된다.

또한 본 발명의 곰팡이의 검사 방법은 복수 종류의 곰팡이를 배양하여 이 배양된 복수 종류의 곰팡이를 혼합하여 일괄적으로 게놈 DNA를 추출하여 DNA칩을 사용하여 복수 종류의 곰팡이의 각각을 동시에 또한 특이적으로 검출하는 방법으로 하고 있다.

본 발명의 곰팡이의 검사 방법을 이와 같은 방법으로 하면, 곰팡이를 균종마다 개별적으로 나누지 않고, 혼재된 채 배양 해도, 배양된 균종을 특이적으로 검출할 수 있다. 즉, 배양된 복수 종류의 곰팡이가 혼합된 상태에서 각각의 곰팡이의 게놈 DNA추출을 정리해서 실시해도, DNA칩에 의해서 각 곰팡이를 검출할 수 있다.

또한 추출된 게놈 DNA를 DNA칩을 사용해서 검출하는 방법으로는 일반적 인 방법을 사용할 수 있다.

구체적으로는, 예를 들면 검출 대상 곰팡이의 특정 영역을 증폭하기 위한 프라이머 세트를 포함한 PCR 반응액을 사용하여 PCR법에 의해서 게놈 DNA의 특정 영역을 증폭한다. 이 프라이머 세트에 의한 증폭 영역에서 미리 선택된 프로브를 DNA칩에 고정화해 둔다. 이때 프라이머 세트 및 프로브는 검출 대상 곰팡이의 특정 영역마다 미리 작성해 둘 필요가 있다. 그리고 PCR법에 의해서 얻어진 증폭 산물을 해당 DNA칩에 적하하여, 프로브에 결합한 증폭 산물을 검출하므로, 혼합물에 포함된 각종 곰팡이를 각각 특이적으로 검출할 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 곰팡이의 검사 방법에서 적어도 호 건성 곰팡이, 내 건성 곰팡이 및 호 습성 곰팡이의 군에서 선택될 2종류 이상의 곰팡이를 소정의 하나의 배지에서 동시에 배양해서 이 배양한 곰팡이의 각각을 동시에 특이적으로 검출하는 방법으로 하는 것도 바람직하다.

본 발명의 곰팡이의 검사 방법을 이러한 방법으로 하면, 통상은 개별적으로 배양되는 다른 습도 환경을 요구하는 곰팡이를 소정의 하나의 배지에서 동시에 배양할 수 있다. 그리고 이들의 혼합물에서 각각의 곰팡이를 특이적으로 검출할 수 있다. 그래서 곰팡이의 성질 등을 고려하지 않고, 일괄해서 동시에 배양해서 검출을 할 수 있고, 곰팡이의 검사의 간략화를 도모할 수 있게 된다.

또한, 상기 본 발명의 곰팡이의 검사 방법에서 복수 종류의 곰팡이를 수분 활성치가 1.0미만, 0.90이상인 동시에 탕 농도는 5~50%, 또는 10%~40%로 하는 것이 바람직하다. 당의 종류로서 구체적으로는 포도당, 슈크로스가 알맞게 사용된다.

이러한 수분 활성치, 당 농도의 고형 배지에 따르면, 호 건성 곰팡이, 내 건성 곰팡이 및 호 습성 곰팡이의 어느 것도 알맞게 배양할 수 있고 모든 곰팡이를 일괄해서 동시에 배양하고 그 검출을 할 수 있게 된다.

또한 상기 본 발명의 곰팡이의 검사 방법에 있어서 복수 종류의 곰팡이를, 25℃±2℃의 온도로 배양하는 방법으로 하는 것도 바람직하다.

이런 온도 범위이면 호 건성 곰팡이, 내 건성 곰팡이 및 호 습성 곰팡이의 모두를 충분히 번식시킬 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 곰팡이의 검사 방법에서 배양한 복수 종류의 곰팡이를, 곰팡이의 세포 벽을 물리적으로 파쇄하기 위한 비즈를 수용한 용기에 넣고 혼합하여 일괄해서 게놈 DNA를 추출하는 것도 바람직하다.

본 발명의 곰팡이의 검사 방법을 이런 방법으로 하면 동시에 배양된 복수 종류의 곰팡이에서 정리하여 게놈 DNA를 추출할 수 있다.

또한 상기 본 발명의 곰팡이의 검사 방법에서 복수 종류의 곰팡이가 대기 중에 떠다니거나 또는 부착된 곰팡이 홀씨 및 균사인 것도 바람직하다.

본 발명의 곰팡이의 검사 방법을 이런 방법으로 하면, 환경 중의 곰팡이를 채취해서 배양하여 이들을 쉽게 동시에 검출할 수 있다.

본 발명에 의하면, 광범위한 종류의 곰팡이를 정밀도 높게 검출할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 복수 종류의 곰팡이를 같은 배지에서 동시에 배양함과 동시에 이들을 혼합하여 일괄해서 게놈 DNA를 추출하고 DNA칩에 의해서 곰팡이를 특이적으로 검출할 수 있게 된다.

[도 1] 서열 번호 3과 서열 번호 4로 이루어진 프라이머 세트로 PCR증폭된 β-튜불린 유전자 내에서의 종 또는 속 특이적 영역 및 곰팡이 공통 영역을 나타내는 도이다.
[도 2] 본 발명의 곰팡이의 검출 방법에 사용하는 프라이머를 나타내는 도이다.
[도 3] 본 발명의 곰팡이의 검출 방법에서 사용하는 프로브를 나타내는 도이다.
[도 4] 시설 환경에서 채취한 샘플 A~H에 각각 포함되는 균종을 나타내는 도이다.
[도 5] 동시 반응계에서 ITS영역과 β-튜불린 유전자의 양쪽을 검출 가능한 프라이머 세트 농도의 범위를 찾기 위한 시험 1의 결과(샘플 A)를 나타내는 도이다.
[도 6] 동시 반응계에서 ITS영역과 β-튜불린 유전자의 양쪽을 검출 가능한 프라이머 세트 농도의 범위를 찾기 위한 시험 1의 결과(샘플 B)를 나타내는 도이다.
[도 7] 동시 반응계에서 ITS영역과 β-튜불린 유전자의 양쪽을 검출 가능한 프라이머 세트 농도의 범위를 찾기 위한 시험 1의 결과(샘플 C)를 나타내는 도이다.
[도 8] 동시 반응계에 있어서 ITS영역과 β-튜불린 유전자의 양쪽을 검출 가능한 프라이머 세트 농도의 범위를 찾기 위한 시험 1의 결과(샘플 D)를 나타내는 도이다.
[도 9] 시험 1의 샘플 A에 대해서 프라이머 세트 농도비마다 및 프로브마다의 형광 강도를 나타내는 도이다.
[도 10] 시험 1의 샘플 B에 대해서 프라이머 세트 농도비마다 및 프로브마다의 형광 강도를 나타내는 도이다.
[도 11] 시험 1의 샘플 C에 대해서 프라이머 세트 농도비마다 및 프로브마다의 형광 강도를 나타내는 도이다.
[도 12] 시험 1의 샘플 D에 대해서 프라이머 세트 농도비마다 및 프로브마다의 형광 강도를 나타내는 도이다.
[도 13] DNA칩 해석에서의 형광 강도와 PCR에 의한 증폭산 물량의 상관 관계를 확인하기 위한 시험 2의 결과를 나타내는 도이다.
[도 14] 동시 반응계에서 ITS영역과 β-튜불린 유전자의 양쪽을 검출 가능한 프라이머 세트 농도의 범위를 찾기 위한 시험 3의 결과를 나타내는 도이다.
[도 15] 시설 환경에서 채취한 샘플 A~H에 포함되어 있지 않았든 각종 곰팡이가 멀티 플렉스 PCR을 사용한 DNA칩 해석에서 검출 가능 여부를 확인하기 위한 시험 4의 결과를 나타내는 도이다.
[도 16] 시험 4의 샘플에 대하여 프라이머 세트 농도비마다 및 프로브마다의 형광 강도를 나타내는 도이다.
[도 17] 클라도스포륨속균이 멀티 플렉스 PCR을 사용한 DNA칩 해석에서 검출 가능 여부를 확인하기 위한 시험 5의 결과를 나타내는 도이다.
[도 18] 클라도스포륨속균 특이적 포워드 프라이머의 PCR용 반응액에의 첨가가 다른 균종의 검출에 미치는 영향을 확인하기 위한 시험 6의 결과를 나타내는 도이다.
[도 19] 각종 배지 조성에 의한 배양 시험의 배양 평가를 나타내는 도이다.
[도 20] 호 건성 곰팡이, 내 건성 곰팡이 및 호 습성 곰팡이를, 각종 배지에서 배양했을 때의 콜로니의 지름을 나타내는 도이다.
[도 21] 호 건성 곰팡이, 내 건성 곰팡이 및 호 습성 곰팡이를, 각종 온도에서 배양했을 때의 콜로니의 지름을 나타내는 도이다.
[도 22] 호 건성 곰팡이, 내 건성 곰팡이 및 호 습성 곰팡이를, 각종 온도에서 배양했을 때의 콜로니의 사진을 나타내는 도이다.
[도 23] 검체 1-20에서의 균종의 DNA칩 해석 및 서열 해석 결과를 나타내는 도이다.
[도 24] 검체 21-40애서의 균종의 DNA칩 해석 및 서열 해석 결과를 나타내는 도이다.
[도 25] 검체 45-60의 균종의 DNA칩 해석 및 서열 해석 결과를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명의 곰팡이의 검출 방법, PCR용 반응액 및 곰팡이 검출용 담체의 1 실시 형태에 대해서 상세히 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 본 실시 형태 및 후술하는 실시예의 구체적인 내용에 한정되는 것은 아니다.

[곰팡이의 검출 방법]

본 실시 형태의 곰팡이의 검출 방법은 곰팡이의 DNA에서의 표적 영역을 포함한 DNA단편을 증폭시켜서 증폭 산물의 유무를 확인하는 공정을 포함한 곰팡이의 검출 방법이며, 표적 영역으로서, ITS영역 및 β-튜불린 유전자를 사용하는 것을 특징으로 한다.

곰팡이의 종류는 특히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 유로치움속균(Eurotium sp.), 아스페르길루스 페니시리오이데스종균( Aspergillus penicillioides), 아스페르길루스 리스트릭티절균( Aspergillus Section Restricti), 와레미아 세비종균( Wallemia sebi ), 아스페르길루스 비트리코라종균( Aspergillus vitricola ), 페니실륨속균( Penicillium sp .), 아스페르길루스 푸미가티절균( Aspergillus Section Fumigati ), 아스페르길루스 프라비절균( Aspergillus Section Flavi ), 아스페르길루스 니듀랑테스절균( Aspergillus Section Nidulantes), 아스페르길루스 니그리절균( Aspergillus Section Nigri ), 스타치보토리스 챠루타람종균( Stachybotrys chartarum ), 푸사리움 소라니종균( Fusarium solani), 클라도스포륨속균(Cladosporium sp.)등의 곰팡이를 본발명의 곰팡이의 검출 방법, PCR용 반응액 및 곰팡이 검출용 담체에 의한 검출 대상 곰팡이로 할 수 있다. 또한 그 외에도 푸사리움 오키스포람종균(Fusarium oxysporum), 푸사리움 구라미니알람종균(Fusarium graminiarum), 푸사리움 바티시리오이데스종균( Fusarium verticillioides), 피시움 울티멈종균( Pythium ultimum ), 코레토토리캄 그로에오스포리오이데스종균( Colletotrichum gloeosporioides ), 코레토토리캄 아큐테이탐종균( Colletotrichum acutatum ), 버티실리움 다리에종균( Verticillium dahiae ), 버티실리움 알보아토램종균( Verticillium albo - atrum ), 알타나리어 알타나타종균( Alternaria alternate ), 트리코피톤 루브럼종균( Trichophyton rubrum ), 트리코피톤 통즈랑스종균( Trichophyton tonsurans ), 트리코델마 빌리데종균( Trichoderma viride)등의 곰팡이를, 검출 대상으로 할 수 있다.

본 실시 형태의 곰팡이의 검출 방법에서의 표적 영역이란 곰팡이의 DNA에서의 증폭 대상 영역이고, 특정 스페이서나 유전자 등을 그와 같은 영역으로서 사용할 수 있다. 본 발명에서는 이 표적 영역으로서, ITS(Internal Transcribed Spacer)영역과 β-튜불린 유전자의 양쪽을 동시에 사용하고 있다.

표적 영역을 포함한 DNA단편을 증폭시키는 방법은 특히 한정되지 않지만, PCR(중합 효소 연쇄 반응)법을 사용할 수 있다.

PCR법에서는, 표적 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 함유하는 PCR반응액을 사용해서, 곰팡이의 DNA에서의 특정 영역을 증폭한다. PCR장치로는 일반적인 서멀 사이클라 등을 사용할 수 있고, 예를 들면 다음과 같은 반응 조건에서 PCR을 할 수 있다.

(a)95℃ 10분(b)95℃(DNA변성 공정)30초(c)56℃(아닐링 공정)30초(d)72℃(DNA합성 공정)60초((b)~(d)를 40사이클),(e)72℃ 10분

증폭 산물의 유무를 확인하는 방법으로는 전기영동에 의한 방법이나 DNA칩을 사용해서 검출하는 방법 등을 사용할 수 있다.

전기영동에 의한 방법은 예를 들면 MultiNA(R)(주식회사 시마즈제작 소제)를 사용하여 마이크로캬피라리 전기영동으로 PCR의 증폭 산물을 영동 시켜서 밴드의 위치에 따라 그 크기를 확인함으로써 올바른 증폭 산물을 얻고 있는지 여부를 판정할 수 있다.

DNA칩에 의한 방법은, 표적 영역에 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브를 미리 DNA칩에 고정화하고 이 DNA칩에 PCR의 증폭 산물을 적하하여, 증폭 산물의 표지를 검출하는 것 등으로 올바른 증폭 산물이 얻어지고 있는지의 여부를 판정할 수 있다. 표지의 검출은 형광 스캐닝 장치 등 일반적인 표지 검출 장치를 사용해서 할 수 있으며, 예를 들면 동양 강판주식회사의 BIOSHOT를 사용하여 증폭 산물의 형광 강도를 측정함으로써 실시 할 수 있다.

또한 표지는 형광에 한정되지 않고 그 밖의 것을 사용해도 좋다.

본 실시 형태에서는 프라이머로서, 곰팡이의 DNA에서의 ITS영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트와 β-튜불린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 사용한다.

ITS영역은 RNA에 전사 후에 스프라이싱 되는 부분이다. 이 때문에, 코딩 영역에 비하면 저장성이 낮고 변화가 풍부하지만, 곰팡이 종간의 유사성이 높고 위양성 반응이 생기는 경우가 비교적 많다. 그래서, DNA칩에 많은 종류의 곰팡이의 프로브를 고정화하여 곰팡이의 식별에 사용할 경우에는 이 프로브로서 ITS영역에서 선택된 것만을 사용하면 검출 정밀도의 저하를 초래할 우려가 있다.

한편 복수 종류의 곰팡이에서의 β-튜불린 유전자의 유사성을 검증하면 도 1에 나타낸 바와 같이, 곰팡이 종류마다 독특한 서열이 비교적 많이 존재하고 있으며 이들의 영역은 특이성이 높은 탐침 설계에 최적이라고 생각된다.

그래서 ITS영역과 β-튜불린 유전자 양쪽을 표적 영역으로서 사용하여 광범위한 종류의 곰팡이를 대상으로 검증했는데, 이들 영역을 조합해서 사용함으로써, 위양성 반응을 적절히 줄일 수 있는 것이 밝혀졌다.

본 실시 형태의 곰팡이의 검출 방법으로는 이렇게 표적 영역으로서, ITS영역과 β-튜불린 유전자의 양쪽을 사용함으로써 광범위한 종류의 곰팡이를 정밀도 높게 검출할 수 있도록 하고 있다.

[PCR용 반응액]

본 실시 형태의 PCR용 반응 액은 전술한 곰팡이의 검출 방법에서 표적 영역을 포함한 DNA단편의 증폭을 PCR법에 의해서 실시하는 경우에 사용된다. 이 PCR용 반응액으로는 예를들면 이하의 조성으로 구성되는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 핵산 합성 기질(dNTPmixture(dCTP, dATP, dTTP, dGTP), 프라이머 세트, 핵산 합성 효소( Nova Taq polymerase등), 표지 성분(Cy5-dCTP등), 시료의 게놈 DNA, 완충액 및 나머지 용량 분으로서 물을 포함한 PCR 반응액을 사용할 수 있다. 또한 완충액로는 예를들면, Ampdirect(R)(주식회사 시마즈제작 소제)를 사용할 수 있다.

본 실시 형태의 PCR용 반응액에서의 프라이머 세트는 곰팡이의 DNA에서의 ITS영역을 증폭시키는 것이 가능한 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 및 곰팡이의 DNA에서의 β-튜불린 유전자를 증폭시키는 것이 가능한 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트가 사용된다.

본 실시 형태의 PCR용 반응액에서의 프라이머 세트는 이와같이 ITS영역 증폭용 프라이머 세트와 β-튜불린 유전자 증폭용 프라이머 세트를 가진 것이라면 특히 한정되지 않지만, 구체적으로는 예를 들면 이하의 것을 사용할 수 있다. 즉, 도 2와 같이 ITS영역 증폭용 프라이머 셋트로서 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열로 이루어진 포워드 프라이머 및 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열로 이루어진 리버스 프라이머를 갖춘 프라이머 세트를 사용할 수 있다. 또한 β-튜불린 유전자 증폭용 프라이머 셋트로서 서열 번호 3에 나타내는 염기 서열로 이루어진 포워드 프라이머 및 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 리버스 프라이머를 갖춘 프라이머 세트를 사용할 수 있다.

또한 β-튜불린 유전자 증폭용 프라이머 세트와 ITS영역 증폭용 프라이머 세트의 농도비를 1:0.9~1:0.1로 하는 것이 바람직하다. 프라이머 세트의 농도비를 이렇게 하면 이들의 증폭 대상 영역을 동시에 알맞게 증폭할 수 있기 때문이다.

여기서, 곰팡이의 DNA에서 ITS영역은 100카피 이상 존재하는 반면 β-튜불린 유전자는 1카피밖에 존재하지 않는다. 또한, 전자의 PCR법에 의한 증폭 산물의 사이즈는 약 250bp인 데 대해서 후자의 PCR법에 의한 증폭 산물의 사이즈는 350~550bp이다.

따라서 β-튜불린 유전자 증폭용 프라이머 세트와 ITS영역 증폭용 프라이머 세트의 농도를 PCR용 반응액에서 동일하게 하면 β-튜불린 유전자의 증폭 산물을 충분히 얻지 못하고, 검출 정밀도가 낮아진다고 하는 문제가 있었다.

이에 대해서PCR용 반응액에서의 ITS영역 증폭용 프라이머 세트의 농도를 너무 낮추면 이번에는 ITS영역의 증폭 효율이 낮아진다.

이 때문에 β-튜불린 유전자 증폭용 프라이머 세트와 ITS영역 증폭용 프라이머 세트의 농도비로서 최적의 조건을 찾아야 했다.

그래서 본 발명자들은 여러가지 농도 비율을 검증함으로써 상기의 농도비라면 ITS영역 및 β-튜불린 유전자의 양쪽을 증폭할 수 있는 것을 찾아냈다. 특히 β-튜불린 유전자 증폭용 프라이머 세트와 ITS영역 증폭용 프라이머 세트의 농도비를 1:0.5~1:0.25로 하면 증폭 산물을 형광 표지해서 형광 강도에 의한 곰팡이의 검출을 실시하는 경우, ITS영역과 β-튜불린 유전자의 형광이 함께 큰 강도로 얻을 수 있어서 보다 바람직하다.

또한 본 실시 형태의 PCR용 반응액에 클라도스포륨속균을 특이적으로 증폭시키기 위한 프라이머를 포함시키는 것이 바람직하다. 이러한 프라이머로는 도 2의 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 포워드 프라이머를 사용할 수 있다.

여기서 전술한 ITS영역 증폭용 프라이머 세트 및 β-튜불린 유전자 증폭용 프라이머 세트를 사용한 경우 클라도스포륨속균의 β-튜불린 유전자에 대해서는 PCR에 의해서 증폭 산물은 얻을 수 있으나, β-튜불린 유전자에 상보적인 서열에서 선택된 프로브와 해당 증폭 산물에 의한 하이브리다이제이션은 충분히 이루어지지 않고, 클라도스포륨속균은 적절히 검출하지 못 했다.

그래서, 클라도스포륨속균에 대해서는 이것를 특이적으로 증폭 가능한 포워드 프라이머를 PCR용 반응액에 추가하여 PCR을 하여 새로운 증폭 산물을 얻었다. 그리고 실시 예에서 후술 하는 바와 같이, 이 새로운 증폭 산물을 본실시 형태의 곰팡이 검출용 담체에 적하여 검사한 바 해당 균종을 적절히 검출할 수 있었다.

즉, 이 클라도스포륨속균을 특이적으로 증폭시키기 위한 포워드 프라이머는 β-튜불린 유전자를 증폭하기 위한 것이며, 서열 번호 4에 나타낸 리버스 프라이머와 쌍을 이루어, 클라도스포륨속균의 β-튜불린 유전자를 증폭시킬 수 있다.

PCR용 반응액의 클라도스포륨속균의 특이적 포워드 프라이머의 마지막 농도는 0.5μM이하로 하는 것이 바람직하며, 0.125μM~0.5μM로 하는 것이 보다 바람직하다. 클라도스포륨속균이 특이적 포워드 프라이머의 마지막 농도의 범위를 이렇게 하면 클라도스포륨속균을 검출하는 것이 가능하기 때문이다.

또한 PCR용 반응액에 있어서 클라도스포륨속균이 특이적 포워드 프라이머의 마지막 농도를 0.25μM~0.5μM으로 하면 클라도스포륨속균을 더욱 적절하게 검출할 수 있다. 특히 이 마지막 농도를 0.25μM으로 하면 다른 균종의 검출에 미치는 영향을 거의 최소화할 수 있어서 더욱 바람직하다.

상기 프라이머 세트에서의 각 프라이머의 서열은 상기 염기 서열 자체에 한정되지 않고, 동일한 기능을 다하는 범위에서 적절히 변경한 것을 사용할 수 있다. 즉, 각각의 염기 서열에 있어서 하나 또는 여러 개의 염기가 결손, 치환 또는 부가된 것으로 할 수 있다. 또한, 각각의 염기 서열에 대해서 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산 단편에 대해서 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈 가능한 것으로 할 수도 있다.

스트린젠트한 조건이란 특이적인 하이브리드가 형성되고 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 예를 들면, 상기 프라이머 세트에 대하여 높은 상동성(상동성이 90%이상, 바람직하게는 95%이상)을 가진 DNA가 상기 프라이머 세트와 상보적인 염기 서열로 이루어진 DNA와 하이브리다이즈하는 조건을 들수 있다. 통상 완전 하이브리드의 용해 온도(Tm)보다 약 5℃~약 30℃ 바람직하게는 약 10℃~약 25℃ 낮은 온도로 하이브리다이제이션이 일어나는 경우를 말한다. 스트린젠트한 조건에 대해서는 J.Sambrook들, Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), 특히 11.45절"Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes"에 기재되어 있는 조건 등을 사용할 수 있다.

[곰팡이 검출용 담체]

본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체는 하나 또는 둘이상의 곰팡이의 종류마다 ITS영역에서 선택된 염기 서열을 가진 프로브 및 β-튜불린 유전자에서 선택된 염기 서열을 가진 프로브를 고정화한 것을 특징으로 하고, DNA칩 등을 사용해서 구성할 수 있다.

이와 같이 곰팡이의 종류마다 ITS영역의 증폭 산물과 결합하는 프로브와 β-튜불린 유전자 증폭 산물과 결합하는 프로브의 양쪽을 갖춘 것으로 하고, 이들 양쪽의 프로브에서 형광이 검출되는 곰팡이를 양성으로 판정함으로써 위양성 반응에 의한 판정의 오류를 적절하게 배제할 수 있게 되어 있다.

구체적으로는, 예를 들면 도 3과 같이, 곰팡이의 종류마다, 이하의 프로브를 사용할 수 있다.

즉 유로튬속균(Eurotium sp.)을 검출하기 위한 프로브로서, ITS영역에서 선택된 서열 번호 6 또는 7에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브 중 적어도 하나, 및 β-튜불린 유전자에서 선택된 서열 번호 8에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브를 사용할 수 있다.

또한 아스페르길루스 페니시리오이데스종균( Aspergillus penicillioides )을 검출하기 위한 프로브로서, ITS영역에서 선택된 서열 번호 9~11에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브 중 적어도 하나, 및 β-튜불린 유전자에서 선택된 서열 번호 12에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브를 사용할 수 있다.

또한 아스페르길루스 비토리코라종균(Aspergillus vitricola)을 검출하기 위한 프로브로서, ITS영역에서 선택된 서열 번호 13또는 14에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브 중 적어도 하나, 및 β-튜불린 유전자에서 선택된 서열 번호 15에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브를 사용할 수 있다.

또한 아스페르길루스 리스트릭티절균(Aspergillus Section Restricti )을 검출하기 위한 프로브로서, ITS영역에서 선택된 서열 번호 16~20에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브 중 적어도 하나, 및 β-튜불린 유전자에서 선택된 서열 번호 21에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브를 사용할 수 있다.

또한 아스페르길루스 니듈란테스절균( Aspergillus Section Nidulantes )을 검출하기 위한 프로브로서, ITS영역에서 선택된 서열 번호 22에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브 및 β-튜불린 유전자에서 선택된 서열 번호 23에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브를 사용할 수 있다.

또한 아스페르길루스 후미가티절균( Aspergillus Section Fumigati )을 검출하기 위한 프로브로서, ITS영역에서 선택된 서열 번호 24에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브 및 β-튜불린 유전자에서 선택된 서열 번호 25에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브를 사용할 수 있다.

또한 아스페르길루스 후라비절균(Aspergillus Section Flavi)을 검출하기 위한 ITS영역에서 선택된 서열 번호 26에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브 및 β-튜불린 유전자에서 선택된 서열 번호 27에 나타나는 염기 서열을 가진 프로브를 사용할 수 있다.

또한 페니실륨속균(Penicillium sp.)을 검출하기 위한 ITS영역에서 선택된 서열 번호 28또는 29에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브 및 β-튜불린 유전자에서 선택된 서열 번호 30~32에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브의 적어도 하나를 사용할 수 있다.

또한 스타치보트리스 챠타륨종균(Stachybotrys chartarum)을 검출하기 위한 ITS영역에서 선택된 서열 번호 33에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브 중 적어도 하나, 및 β-튜불린 유전자에서 선택된 서열 번호 34에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브를 사용할 수 있다.

또한 푸사리움 소라니종균(Fusarium solani)을 검출하기 위한 ITS영역에서 선택된 서열 번호 35에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브 및 β-튜불린 유전자에서 선택된 서열 번호 36에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브를 사용할 수 있다.

또한, 클라도스포륨속균(Cladosporium sp.)을 검출하기 위한 ITS영역에서 선택된 서열 번호 37에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브 및 β-튜불린 유전자에서 선택된 서열 번호 38또는 39에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브 중 적어도 하나를 사용할 수 있다.

또한 곰팡이 공통의 프로브로서, ITS영역에서 선택된 서열 번호 40에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브 및 β-튜불린 유전자에서 선택된 서열 번호 41에 나타내는 염기 서열을 가진 프로브를 사용할 수 있다.

그리고 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체는 상기 각 곰팡이를 검출하기 위한 각 프로브 군을 각각 하나 또는 두 군 이상 고정화한 것으로 할 수 있다.

이와 같이 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체는 각 곰팡이의 ITS영역과 β-튜불린 유전자의 증폭 산물에 각각 결합하는 프로브를 정화함으로써 위양성 반응에 의한 판정 미스를 저하시켜서 광범위한 곰팡이를 높은 정밀도로 검출하는 것이 가능하게 되어 있다.

본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체는 통상적인 방법으로 사용할 수 있고 그 방법은 특히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 다음과 같이 사용할 수 있다.

먼저 본 실시 형태의 곰팡이의 검출 방법에 의해서 얻어진 PCR의 증폭 산물에 완충액(3×SSC 구연산-생리 식염수)에 0.3%SDS(도데실 황산 나트륨)을 첨가한 것을 혼합하여, 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체에 적하한다.

이 곰팡이 검출용 담체를 45℃에서 1시간 정치한 뒤 하이브리다이즈 하지 않은 PCR산물을 상기 완충액을 사용해서 곰팡이 검출용 담체에서 씻어낸다. 그리고 이를 표지 검출 장치에 넣고 형광 강도를 측정함으로써 곰팡이의 검출할 수 있다.

또한 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체에 고정화하는 상기 각 프로브는 전술한 프라이머 세트에서의 각 프라이머의 서열의 경우와 마찬가지로 동일한 기능을 하는 범위에서 적절히 변경한 것을 사용할 수 있다. 즉, 각각의 염기 서열에 있어서 하나 또는 여러개의 염기가 결손, 치환 또는 부가된 것으로 할 수 있다. 또한 각각의 염기서열에 대해서 상보적인 염기 서열로 이루어진 핵산 단편에 대해서 스토린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈 가능한 것으로 할 수도 있다.

또한 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체에 고정화하는 프로브로서 상기 각 프로브나, 각각의 염기 서열에 있어서 하나 또는 여러개의 염기가 결손, 치환 또는 부가된 것, 또는 각각의 염기서열에 대해서 상보적인 염기서열로 이루어진 핵산 단편에 대해서 스토린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈 할 수 있는 것에 대해서 상보적인 염기서열을 가진 프로브를 사용할 수도 있다.

여기서 본 실시 형태의 곰팡이의 검출 방법에서의 PCR법에 의해서 얻을 수 있는 증폭 산물에는 상기의 프로브와 하이브리다이즈 하는 핵산 단편에 대해서 상보적인 염기서열을 가진 핵산 단편도 포함된다. 이 때문에, 도 3에 나타내는 서열번호 6~41에 대해서 상보적인 염기서열 및 이들과 동등한 염기서열로 이루어진 프로브는 상기의 프로브와 하이브리다이즈하는 핵산 단편에 대해서 상보적인 염기서열을 가진 핵산 단편과 하이브리다이즈할 수 있다.

따라서 도 3에 나타내는 서열번호 6~41에 대해서 상보적인 염기서열 및 이들과 동등한 염기서열로 이루어진 프로브, 즉 서열번호 6~41의 각각의 염기서열에 있어서 하나 또는 여러개의 염기가 결손, 치환 또는 부가된 것, 또는 각각의 염기서열에 대해서 상보적인 염기서열로 이루어진 핵산 단편에 대해서 스토린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈 할 수 있는 것을 본 실시 형태의 곰팡이 검출용 담체에 고정화한 경우에도 각각의 대상으로 하는 곰팡이를 검출할 수 있다.

다음에, 본 발명의 곰팡이의 검사 방법의 한 실시 형태에 대해서 상세히 설명한다. 또한 본 실시 형태의 곰팡이의 검사 방법은 복수 종류의 곰팡이를 배양해서 배양된 복수 종류의 곰팡이를 혼합하여 일괄적으로 게놈 DNA를 추출하여 DNA칩을 사용하여 복수 종류의 곰팡이의 각각을 동시에 또한 특이적으로 검출하는 것이라면 좋고, 이하의 실시 형태 및 실시예의 구체적인 내용에 한정되는 것은 아니다.

본 실시 형태의 곰팡이의 검사 방법은 이하의 공정을 포함하는 것으로 할 수 있다.

(1)곰팡이의 채취

먼저 에어 샘플러를 사용해서 식품 제조 현장이나 임상 현장, 문화재 보호 환경 등에서의 공기를 채취한다. 이어서 채취한 공기를 에어 샘플러용으로 스트립 형상으로한 전용 배지 등에 분사하여 배양한다.

그 배지는 실시 예에서 후술 하는 바와 같이 호 건성, 내 건성 및 호 습성의 어떠한 곰팡이라도 배양할 수 있는 M40Y, MY10G배지, MY30G배지 등을 사용하는 것이 바람직하다. 이들 중 M40Y배지를 사용하면 상기 어떤 성질의 곰팡이라도 효율적으로 배양할 수 있어서 특히 바람직하다.

또한 배양 조건으로서는, 23℃~27℃의 온도의 어두운 곳에, 2일~7일 정밀도 정치시키는 것이 바람직하다.

또한 일반적으로 M40Y배지, MY10G배지, 및 MY30G배지는 호 건성 곰팡이용의 것으로 여겨지며 호 습성 곰팡이 배양에는 적합하지 않는다고 생각되어 왔다.

다음에 배지에 생긴 복수 종류의 곰팡이의 콜로니를 개별적으로 분리하지 않고, 일괄해서 채취한다. 그리고, 채취된 시료를, 예를 들면 φ 0.5mm지르코니아 비즈를 넣은 바이알 병 등에 넣어 바이알 병마다 액체 질소에 담가서 시료를 동결한 후 진탕 장치 등을 사용하여, 곰팡이의 세포를 파쇄한다. 또한 세포의 파괴는 DNA를 추출할 수 있도록 하면 되고, 또 다른 방법으로 해도 된다.

(2)DNA추출

곰팡이의 세포를 파괴한 시료에서 게놈 DNA를 추출하는 방법으로는 CTAB법(Cetyl trimethyl ammonium bromide)이나 DNA추출 장치를 사용하는 방법 등 일반적인 방법을 사용할 수 있다.

(3)PCR법에 의한 ITS영역의 증폭

다음에, 각종 곰팡이 rDNA의 ITS1영역을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 PCR반응액에 더하여, PCR법에 의해서 상기 시료 중의 곰팡이의 게놈 DNA에서의 특정 영역을 증폭한다. 구체적으로는 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머로서 각각 서열번호 42,43에 나타내는 염기서열의 것을 사용할 수 있다. 또한, PCR장치로서는 일반적인 서멀 사이클라 등을 사용할 수 있다.

본 실시 형태의 PCR 반응액으로는 예를 들면, 이하의 조성으로 구성되는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 핵산 합성 기질(dNTPmixture(dCTP, dATP, dTTP, dGTP), 프라이머 세트, 핵산 합성 효소(Nova Taq polymerase등), 표지 성분(Cy5-dCTP등), 시료의 게놈 DNA, 완충액 및 나머지 용량 분으로서 물을 포함한 PCR 반응액을 적당히 사용할 수 있다. 완충액으로는 예들 들면 Ampdirect(R)(주식회사 시마즈제작소)을 사용할 수 있다.

본 실시 형태의 곰팡이의 검사 방법에서의 PCR반응 조건으로는, 예를 들면 다음과 같이 하는 것이 바람직하다.

(a)95℃ 10분 (b)95℃(DNA변성 공정)30초 (c)56℃(아닐링 공정)30초 (d)72℃(DNA합성 공정)60초((b)~(d)를 40사이클), (e)72℃ 10분

(4)DNA칩에 의한 검출

본 실시 형태의 DNA칩은, 검출 대상인 곰팡이의 DNA에서 선택된 프로브를 고정화한 것이라면 좋고, 또 다른 점에서는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 스포트형 DNA칩, 합성형 DNA칩 등을 사용할 수 있다.

구체적으로는 본 실시 형태의 곰팡이의 검사 방법의 PCR반응액에 포함되는 프라이머 세트에 의해서 증폭되는 증폭 영역과 결합하는 프로브를 미리 합성해서 DNA칩의 기판상에 고정화한다. 예를 들면, 아스페르길루스 비트리코라(Aspergillus vitricola)검출용 프로브로서는 서열번호 44에 나타내는 염기 서열로 이루어진 것을 사용할 수 있다. 아스페르길루스 페니시리오이데스(Aspergillus penicillioides)검출용 프로브로서는 서열번호 45에 나타내는 염기서열로 이루어진 것을 사용할 수 있다. 또한 유로치움속균( Eurotium sp .)검출용 프로브로서는 서열번호 46에 나타내는 염기서열로 이루어진 것을 사용할 수 있다.

다음에, PCR증폭 산물을 DNA칩 위에 떨어뜨려서, 상기 곰팡이 검출용 프로브에 하이브리다이즈한 PCR증폭산물의 표지를 검출한다. 구체적으로는, 예를 들면 다음과 같이 할 수 있다.

우선 PCR증폭 산물에 소정의 완충액을 혼합하여, DNA칩에 적하한다.

다음에 DNA칩을 45℃에서 1시간 정치하고 그 후 소정의 완충액에 의해서 하이브리다이즈하지 않은 PCR산물을 DNA칩에서 씻어버린다.

그리고 DNA칩을 표지 검출 장치에 의해서 표지의 검출을 하고, 검출 대상 곰팡이의 존재 여부를 판정한다. 또한 표시 검출 장치로는 예를 들면 형광 스캐닝 장치 등 일반적인 것을 사용할 수 있다. 또한 표지 및 그 검출 방법은 형광에 한정되지 않고, 기타의 방법을 사용해도 좋다.

이상 설명한 바와 같이, 본 실시 형태의 곰팡이의 검사 방법에 의하면, 호 건성, 내 건성 및 호 습성 중 어느 곰팡이라도 배양할 수 있는 배지를 사용하여 복수의 곰팡이를 동시에 배양할 수 있다. 그리고, 배양된 곰팡이를 혼합하여 일괄해서 게놈 DNA를 추출하고 DNA칩을 사용하여 복수 종류의 곰팡이의 각각을 동시에 특이적으로 검출할 수 있다.

그래서, 채취된 곰팡이를 분리 배양 할 필요가 없고, 복수 종류의 곰팡이를 신속하게 일괄하여 쉽게 검출할 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명의 곰팡이의 검출 방법, PCR용 반응액 및 곰팡이 검출용 담체를 사용해서 실시한 시험에 대해서 구체적으로 설명한다.

(시험 1)

본 발명의 곰팡이의 검출 방법에 있어서 멀티 플렉스 PCR을 사용한 DNA칩 해석에 의해서 각종 곰팡이를 검출할 때, ITS영역과 β-튜불린 유전자 양쪽을 동시에 증폭될 수 있도록 하는, PCR용 반응액에서의 각 프라이머 세트의 농도 범위를 찾기 위해 시험 1을 실시하였다.

검출 대상 곰팡이는 시설 환경에서 채취한 야생 곰팡이를 사용하였다. 즉, 에어 샘플러를 사용해서 시설 환경 내의 공기를 채취하여 이것을 샘플 A~D의 각 배지에 분사하여 배양하였다. 배양은 25℃의 어두운 곳에서 7일 간 정치해서 실시하였다.

다음으로 샘플마다, 배지에 생긴 다양한 종류의 곰팡이의 콜로니의 일부를 개별적으로 채취해서 각각 25℃의 어두운 곳에서 7~10일 간 분리 배양을 실시하고, 각 콜로니를 DNA서열 해석에 제공하고, 그 균종을 확인했다. 그 결과를 도 4에 나타낸다. 또한 DNA서열 해석은, 다카라 바이오 주식 회사에 위탁하여 DNA서열 분석기에 의해서 실시하였다. 이하에서도 마찬가지이다.

또한 샘플마다, 배지에 생긴 다양한 종류의 곰팡이의 콜로니를 일괄하여 채취해서 φ 0.5mm지르코니아 비즈를 넣은 바이알 병에 넣어 액체 질소에 담가 서 시료를 동결한 후 진탕 장치를 사용해서, 곰팡이의 세포를 파쇄하였다.

이어서 샘플마다, DNA추출 장치에 의해서 곰팡이의 게놈 DNA를 추출하여 PCR법에 의해서 각 곰팡이의 ITS영역과 β-튜불린 유전자를 동시에 증폭하였다.

이 때 ITS영역 증폭용 프라이머 세트로서 도 2에 도시한 서열 번호 1의 염기 서열로 이루어진 포워드 프라이머(F프라이머)및 서열 번호 2의 염기 서열로 이루어진 리버스 프라이머(R프라이머)를 사용하였다. 또한 β-튜불린 유전자 증폭용 프라이머 세트로서 도 2에 도시한 서열 번호 3의 염기 서열로 이루어진 포워드 프라이머 및 서열 번호 4의 염기 서열로 이루어진 리버스 프라이머를 사용하였다. 또한 모두 오페론 테크놀로지 주식회사에 의해 서 합성한 것을 사용하였다.

또한 PCR용 반응액으로서 샘플 A~D의 각각에 대해서 Ampdirect(R)(주식회사 시마즈제작소 제품)을 사용하여 다음 조성의 것을 20μl 작성하였다.

1.Ampdirect(G/Crich)4.0μl

2.Ampdirect(addition-4)4.0μl

3.dNTPmix 1.0μl

4.Cy-5dCTP 0.2μl

5.ITS1-Fw primer(10μ M)1.0μl

6.ITS1-Rv primer(10μ M)1.0μl

7.BtF primer(10μ M)1.0μl

8.BtR primer(10μ M)1.0μl

9.Template DNA(샘플 A~D마다 각각)1.0μl

10.NovaTaq polymerase 0.2μl

11. 물(전체가 20.0μl이 될 때까지 물을 첨가)

또한 ITS영역 증폭용 프라이머로서 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머의 각각이 다음의 비율로 배합되고 그 밖의 점은 상기와 같은 4가지 PCR용 반응액을 작성하였다.

primer(9μM)0.9μl

primer(8μM)0.8μl

primer(5μM)0.5μl

primer(2.5μM)0.25μl

primer(1.25μM)0.125μl

primer(1μM)0.1μl

primer(0.625μM)0.0625μl

이상과 같이 β-튜불린 유전자 증폭용 프라이머 세트와 ITS영역 증폭용 프라이머 세트의 마지막 농도비로서 샘플 A~D마다 이하의 5종류의 것을 작성하고 각각에 대해서 시험을 하였다.

(i)0.5μM:0.5μM

(ii)0.5μM:0.45μM

(iii)0.5μM:0.40μM

(iv)0.5μM:0.25μM

(v)0.5μM:0.125μM

(vi)0.5μM:0.0625μM

(vii)0.5μM:0.050μM

(viii)0.5μM:0.03125μM

상기 각 PCR용 반응액을 사용하여 핵산 증폭 장치(TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(R)Gradient 다카라바이오 주식회사제)에 의해서 다음의 조건으로 DNA증폭을 하였다.

(a)95℃ 10분

(b)95℃ 30초

(c)56℃ 30초

(d)72℃ 60초((b)~(d)을 40사이클)

(e)72℃ 10분

DNA칩에는 질실리콘(R)(동양강판주식회사제)를 사용하여 도 3에 도사하는 프로브 중, 아래의 프로브를 고정화한 것을 사용하였다.

<ITS영역에서 선택된 프로브>

(1)유로치움속균 서열번호 6,7

(2)아스페르길루스 페니시리오이데스종균 서열번호 9~11

(3)아스페르길루스 비토리코라종균 서열번호 13

(4)아스페르길루스 리스트릭티절균 서열번호 16~20

(5)아스페르길루스니 듀랑테스절균 서열번호 22

(7)아스페르길루스 후라우이절균 서열번호 26

(8)페니실륨속균 서열번호 28

(11)클라도스포륨속균 서열번호 37

(12)곰팡이 공통서열번호 40

<β-튜불린 유전자에서 선택된 프로브>

(1)유로치움속균 서열번호 8

(2)아스페르길루스 페니시리오이데스종균 서열번호 12

(3)아스페르길루스 비토리코라종균 서열번호 15

(4)아스페르길루스 리스트릭티절균 서열번호 21

(5)아스페르길루스니 듀랑테스절균 서열번호 23

(7)아스페르길루스 후라우이절균 서열번호 27

(8)페니실륨속균 서열번호 30

(12)곰팡이 공통서열번호 41

다음에, PCR증폭산물에 완충액(3×SSC 구연산-생리식염수+0.3%SDS)를 혼합하여, 94℃에서 5분간 가열하고 상기 DNA칩에 적하하였다.

이 DNA칩을 45℃에서 1시간 정치하고 상기 완충액을 사용해서 하이브리다이즈하지 않은 PCR산물을 DNA칩에서 씻어 냈다.

이어서 DNA칩을 표지 검출 장치(GenePix4100A Molecular Devices사제)에 의해서 각 프로브에서의 형광 강도를 측정하여 프라이머 세트의 농도비마다 ITS영역용 프로브의 형광 강도 및 β-튜불린 유전자용 프로브의 형광 강도의 평균치를 산출하였다. 그 결과를 도 5~도 8에 나타낸다. 도 5는 샘플 A, 도 6은 샘플 B, 도 7은 샘플 C, 도 8은 샘플 D를 사용한 경우의 프라이머 세트의 각종 농도비에 대한 형광 강도를 나타내고 있다.

또한 도 9~도 12는 각각 샘플 A~D를 사용했을 경우의 프리마 세트의 각종 농도비에 대한 프로브마다의 형광 강도를 나타내고 있다. 또한 도 5~도 8의 "N"은 도 9~도 12에서의 프로브 수를 각각 나타내고 있다. 도 15에 있어서도 마찬가지이다.

(시험 2)

DNA칩 해석에서의 형광 강도와, PCR에 의한 증폭산물량과의 상관 관계를 확인하기 위해서 시험 2를 하였다.

구체적으로는 시험 1의 샘플 B, C의 각각에 대해서 β-튜불린 유전자용 프라이머 세트의 마지막 농도와 ITS영역용 프라이머 세트의 마지막 농도의 비가 다음과 같은 5종류의 PCR용 반응액을 사용하여 시험 1과 마찬가지로 PCR을 실시하였다.

(레인 1)0.5μM:0.5μM

(레인 2)0.5μM:0.25μM

(레인 3)0.5μM:0.125μM

(레인 4)0.5μM:0.0625μM

(레인 5)0.5μM:0.03125μM

그리고 얻어진 증폭 산물을 MultiNA(R)(주식회사 시마즈제작소제)를 사용하여 해석하였다. 그 결과를 도 13에 나타낸다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 샘플 B에서 β-튜불린 유전자에 대해서는 레인 1밴드가 엷고 레인 2밴드가 약간 진하고, 레인 3~5의 밴드가 진하게 표시되어 있다. ITS영역에 대해서는 레인 1,2의 밴드가 진하고 레인 3밴드가 약간 진하고, 레인 4,5밴드가 엷게 표시되어 있다. 이 결과는 도 6에 도시하는 샘플 B의 DNA칩 해석에서의 형광 강도와 대응하고 있다.

또한 샘플 C에서 β-튜불린 유전자에 대해서는 레인 1,2의 밴드가 엷고 레인 3~5의 밴드가 상대적으로 진하게 표시되어 있다. 또한 ITS영역에 대해서는 레인 1~3의 밴드가 진하고 레인 4,5밴드가 엷게 표시되어 있다. 이 결과는 도 7에 도시되는 샘플 C의 DNA칩 해석에서의 형광 강도와 대응하고 있다.

이상으로부터, DNA칩 해석에서의 형광 강도와, PCR에 의한 증폭산물량과의 사이에는 상관관계가 있음이 확인되었다.

(시험 3)

ITS영역과 β-튜불린 유전자 양쪽을 동시에 검출 가능한 프라이머 세트 농도를 확인하기 위해서 시험 1과 별개의 샘플을 사용해서 같은 시험을 재차 실시하였다.

검출 대상 곰팡이는 시험 1과 마찬가지로 시설 환경에서 채취한 야생 곰팡이를 샘플 E~H의 각 배지에 분사하여 배양한 것을 사용하였다. 이 샘플 E~H의 배지에 생긴 각종 곰팡이의 콜로니를 분리 배양해서 각 콜로니를 DNA 서열 해석에 제공하고, 그 균종을 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타낸다.

그리고, 샘플마다, 배지에 생긴 다양한 종류의 곰팡이의 콜로니를 일괄하여 채취해서 곰팡이의 세포를 파쇄하여 게놈 DNA를 추출하여 PCR법에 의해서곰팡이의 ITS영역과 β-튜불린 유전자를 증폭하였다.

이때 프라이머에는 시험 1과 마찬가지의 도 2에 도시한 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 염기 서열로 이루어진 ITS영역 증폭용 프라이머 세트와 서열 번호 3및 서열 번호 4의 염기 서열로 이루어진 β-튜불린 유전자 증폭용 프라이머 세트를 사용하였다.

또한 PCR용 반응액으로서 샘플 E~H의 각각에 대해서 Ampdirect(R)(주식회사 시마즈제작소 제품)을 사용하고 다음 조성의 것을 20μl작성하였다.

1.Ampdirect(G/Crich)4.0μl

2.Ampdirect(addition-4)4.0μl

3.dNTPmix 1.0μl

4.Cy-5dCTP 0.2μl

5.ITS1-Fw primer(5μM)0.5μl

6.ITS1-Rv primer(5μM)0.5μl

7.BtF primer(10μM)1.0μl

8.BtR primer(10μM)1.0μl

9.Template DNA(샘플 E~H마다각각)1.0μl

10.NovaTaq polymerase 0.2μl

11. 물(전체가 20.0μl이 될 때까지 물첨가)

또한 PCR용 반응액으로서 샘플 E~H의 각각에 대해서 ITS영역 증폭용 프라이머를 다음과 같이하고, 기타의 조성은 상기와 같은 것을 20μl작성하였다.

ITS1-Fw primer(2.5μM)2.5μM

ITS1-Rv primer(2.5μM)2.5μM

이와 같이 β-튜불린 유전자 증폭용 프라이머 세트와 ITS영역 증폭용 프라이머 세트의 마지막 농도비로서 샘플마다, 0.5μM:0.25μM과 0.5μM:0.125μM의 2가지 PCR용 반응액을 작성하고 각각에 대해서 시험을 하였다. PCR의 반응 조건은 시험 1과 같다.

또한 DNA칩에는, 도 3에 도시된 프로브 중, 아래의 프로브를 고정화한 것을 사용하였다. 기타의 점에 대해서는 시험 1과 마찬가지로, 프로브에서의 형광 강도를 측정하여 프라이머 세트의 농도비 마다 ITS영역용 프로브에서의 형광 강도 및 β-튜불린 유전자용 프로브의 형광 강도의 평균치를 산출하였다. 그 결과를 도 14에 나타낸다. 또한 이 도면에서의 "N"은 프로브 수×3회(시험 횟수)를 각각 나타내고 있다.

<ITS영역에서 선택된 프로브>

(1)유로치움속균 서열번호 6

(2)아스페르길루스 페니시리오이데스종균 서열번호 9

(8)페니실륨속균 서열번호 29

(11)클라도스포륨속균 서열번호 37

(12)곰팡이 공통서열번호 40

<β-튜불린 유전자에서 선택된 프로브>

(1)유로치움속균 서열번호 8

(2)아스페르길루스 페니시리오이데스종균 서열번호 12

(4)아스페르길루스 리스트릭티절균 서열번호 21

(12)곰팡이 공통서열번호 41

도 14의 샘플 E~H를 참조하면, β-튜불린 유전자용 프라이머 세트의 마지막 농도와 ITS영역용 프라이머 세트의 마지막 농도의 비율이 0.5μM:0.25μM(1:1/2)의 경우보다 0.5μM:0.125μM(1:1/4)의 경우인 쪽이 ITS영역과 β-튜불린 유전자의 양쪽의 프로브의 형광 강도가 함께 커져 있다.

따라서 이들 양쪽의 검출 결과에 따라 곰팡이의 존재 여부를 판정하기 위해서는 β-튜불린 유전자용 프라이머 세트의 마지막 농도와 ITS영역용 프라이머 세트 마지막 농도 비율을 0.5μM:0.125μM로 하는 것이 최적이라고 생각된다.

(시험 4)

시설 환경에서 채취한 샘플 A~H에 포함되는 야생 곰팡이가 아닌 각종 곰팡이를 대상으로 한 경우에도 본 발명의 ITS영역 및 β-튜불린 유전자를 표적 영역으로 하는 곰팡이의 검출 방법에 의해서 검출할 수 있는지를 검증하였다.

검출 대상 곰팡이로는 다음 4종류의 균주 1~4를 혼합하여 사용하였다.

1. 아스페르길루스 후미가타스(Aspergillus fumigatus)균주 No.JCM10253

2. 푸사리움 소라니(Fusarium solani)균주 No.NBRC5232

3. 스타키보토리스 챠타람(Stachybotrys chartarum)균주 No.NBRC5369

4. 크라도스포리움 스폐로스파맘( Cladsoporium sphaerospermum )균주 No.JCM11787

또한 상기 균주는 이하의 기관에서 입수한 것이다.

JCM:독립 행정 법인 이화학 연구소 생물 자원 센터 미생물 재료 개발실(Japan Collection of Microorganisms)

NBRC:독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 바이오 테크놀로지 본부 생물 유전자 자원 부문(NITE Biological Resource Center)

이들 균주를 배지에 심어서 25℃의 어두운 곳에서 7일 간 정치시켜서 배양한 후 각 균주의 곰팡이의 콜로니를 일괄하여 채취해서 시험 1과 마찬가지로 곰팡이의 게놈 DNA를 추출하여 PCR법에 의해서 각 곰팡이의 ITS영역과 β-튜불린 유전자를 동시 증폭하였다.

이 때, 시험 3과 마찬가지로 β-튜불린 유전자 증폭용 프라이머 세트와 ITS영역 증폭용 프라이머 세트의 마지막 농도비으로서 0.5μM:0.25μM과 0.5μM:0.125μM의 2가지 PCR용 반응액을 작성하였다. 또한 각 PCR용 반응액에서 시료의 DNA는 금실 1~4를 각각 1.0μl씩 합계 4.0μl함유시켰다. 그리고 각각의 PCR용 반응액에 의해서 각 곰팡이의 ITS영역과 β-튜불린 유전자를 증폭하였다.

또한 DNA칩에는, 도 3에 도시된 프로브 중, 아래의 프로브를 고정화한 것을 사용하였다.

그리고 PCR에 의한 증폭 산물을 프로브에 하이브리다이즈 시켜서 프로브에서의 형광 강도를 측정하고 프라이머 세트의 농도비 마다 ITS영역용 프로브에서의 형광 강도 및 β-튜불린 유전자용 프로브에서의 형광 강도의 평균치를 산출하였다. 기타의 점에 대해서는 시험 1과 마찬가지로 실시하였다. 그 결과를 도 15에 나타낸다. 또한 도 16에 프라이머 세트의 농도비마다 및 프로브마다의 형광 강도를 나타낸다.

<ITS영역에서 선택된 프로브>

(6)아스페르길루스 후미가티절균 서열번호 24

(9)스타키보토리스 차타람종균 서열 번호 33

(10)후사리움 소라니종균 서열번호 35

(11)클라도스포륨속균 서열번호 37

(12)곰팡이 공통서열번호 40

<β-튜불린 유전자에서 선택된 프로브>

(6)아스페르길루스 후미가티절균 서열번호 25

(9)스타키보토리스 차타람종균 서열번호 34

(10)후사리움 소라니종균 서열번호 36

(12)곰팡이 공통서열번호 41

도 15를 참조하면, β-튜불린 유전자용 프라이머 세트의 농도와 ITS영역용 프라이머 세트의 마지막 농도의 비율이 0.5μM:0.25μM(1:1/2)및 0.5μM:0.125μM(1:1/4)의 어느 경우에 대해서도 ITS영역용 프로브와 β-튜불린 유전자용 프로브의 양쪽에서의 형광 강도가 검출에 충분한 값을 나타내고 있다.

따라서 상기 4종류의 균주 1~4에 대해서도 본 발명의 ITS영역 및 β-튜불린 유전자를 표적 영역으로 하는 곰팡이의 검출 방법에 의해 검출하는 것이 확인되었다.

또한 크라도스포리움 스페로스파맘에 대해서는 β-튜불린 유전자용 프로브에서 형광을 검출할 수 없었다. 그래서, 클라도스포륨속균 검출을 가능하게 하는 방법을 검토하고 이하의 시험 5,6을 실시하였다.

(시험 5)

시험 4에서는, 상기와 같이, β-튜불린 유전자 증폭용 프라이머 세트(서열 번호 3,4)를 사용했을 경우에, 크라도스포리움 스페로스파맘에 대해서는 β-튜불린 유전자용 프로브에서 형광이 검출되지 않았다.

또한 시험 4에서 DNA칩에는 β-튜불린 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 고정화되어 있어서 해당 프로브에서 형광이 검출되지 않았던 이유는 분명치 않다.

그래서, 클라도스포륨속균 전용의 새로운 β-튜불린 유전자 증폭용 포워드 프라이머(서열 번호 5)를 설계하고, 이 프라이머와 상기 리버스 프라이머(서열 번호 4)로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여 크라도스포리움 스페로스파맘의 β-튜불린 유전자를 증폭하고 β-튜불린 유전자용 프로브에서 형광이 검출되는지의 여부를 확인하기 위한 시험을 하였다.

검출 대상 곰팡이로서는 시험 4와 같은 4종류의 균주 1~4를 혼합하여 사용하였다.

또한 PCR용 반응액으로서는 β-튜불린 유전자 증폭용 프라이머 세트와 ITS영역 증폭용 프라이머 세트의 마지막 농도 비율이, 0.5μM:0.25μM과 0.5μM:0.125μM의 것을 작성하고, 또한, 각각에 대해서 클라도스포륨속균 전용 β-튜불린 유전자 증폭용 포워드 프라이머가 마지막 농도로서 0μM, 0.5μM, 0.25μM, 0.125μM이 되도록 첨가한 8가지 PCR용 반응액을 작성하였다.

구체적으로는 Ampdirect(R)(주식회사 시마즈제작소제)를 사용하여 다음의 조성의 것을 20μl작성해서 시험 1과 마찬가지로 각 곰팡이의 ITS영역과 β-튜불린 유전자를 증폭하였다.

1.Ampdirect(G/Crich)4.0μl

2.Ampdirect(addition-4)4.0μl

3.dNTPmix 1.0μl

4.Cy-5dCTP 0.2μl

5.ITS1-Fw primer(5μM, 2.5μM)0.5μl, 0.25μl

6.ITS1-Rv primer(5μM, 2.5μM)0.5μl, 0.25μl

7.BtF primer(10μM)1.0μl

8.BtR primer(10μM)1.0μl

9.ClaS-beta2(0μM, 10μM, 5μM, 2.5μM)0μl, 1.0μl, 0.5μl, 0.25μl)

10.Template DNA(균주 1~4각각 1.0μl)4.0μl

11.NovaTaq polymerase 0.2μl

12.물(전체가 20.0μl이 될 때까지 물첨가)

DNA칩에는, 도 3에 도시된 프로브 중 크라도스포리움 스페로스파맘 특이적 프로브(서열 번호 39)만을 고착화한 것을 사용하였다. 그리고 기타의 점에 대해서는 시험 1와 마찬가지로 PCR에 의한 증폭 산물을 프르브에 하이 브리다이즈 시켜서 해당 프로브에서의 형광 강도를 측정하였다. 그 결과를 도 17에 도시한다.

도 17에 도시된 바와 같이 β-튜불린 유전자용 프라이머 세트의 농도와 ITS영역용 프라이머 세트의 마지막 농도의 비율이 0.5μM:0.25μM(1:1/2)~0.5μM:0.125μM(1:1/4)인 경우라도, 특히 클라도스포륨속균 전용 포워드 프라이머의 마지막 농도를 0.5μM~0.25μM으로 한 경우 클라도스포륨속균에 대해서 높은 형광 강도를 얻을 수 있음을 알았다.

(시험 6)

시험 5에서 사용한 클라도스포륨속균 전용 포워드 프라이머(서열 번호 5)가 크라도스포리움 스페로스파맘 특이적 프로브(서열 번호 39)이외의 프로브에서의 형광 강도에 미치는 영향에 대해서 검증하였다.

검출 대상 곰팡이로서는 시험 4와 같은 4종류의 균주 1~4를 혼합하여 사용하였다.

또한 PCR용 반응액으로서는 β-튜불린 유전자 증폭용 프라이머 세트와 ITS영역 증폭용 프라이머 세트의 마지막 농도 비율을 0.5μM:0.125μM으로 하고 클라도스포륨속균 전용 β-튜불린 유전자 증폭용 포워드 프라이머를 마지막 농도가 0μM, 0.5μM, 0.25μM이 되도록 첨가한 3가지 PCR용 반응액을 작성하였다.

구체적으로는 Ampdirect(R)(주식회사 시마즈제작소 제품)을 사용하고 다음의 조성의 것을 20μl작성하여 시험 1과 마찬가지로 각 곰팡이의 ITS영역과 β-튜불린 유전자를 증폭하였다.

1.Ampdirect(G/Crich)4.0μl

2.Ampdirect(addition-4)4.0μl

3.dNTPmix 1.0μl

4.Cy-5dCTP 0.2μl

5.ITS1-Fw primer(2.5μ M)0.25μl

6.ITS1-Rv primer(2.5μ M)0.25μl

7.BtF primer(10μ M)1.0μl

8.BtR primer(10μ M)1.0μl

9.ClaS-beta2(0μM, 10μM, 5μM)0μl, 1.0μl, 0.5μl

10.Template DNA(균주 1~4각각 1.0μl)4.0μl

11.NovaTaq polymerase 0.2μl

12.물(전체가 20.0μl이 될 때까지 물첨가)

또한 DNA칩에는, 도 3에 도시되는 프로브 중 시험 4와 같이 균주 1~4의 프로브를 고정화한 것을 사용하였다. 기타의 점에 대해서는 시험 1과 마찬가지로 PCR에 의한 증폭 산물을 프로브에 하이 브리다이즈시켰다.

그리고 각 프로브에서의 형광 강도를 측정해서 클라도스포륨속균 전용 β-튜불린 유전자 증폭용 포워드 프라이머의 농도마다, ITS영역용 프로브에서의 형광 강도 및 β-튜불린 유전자용 프로브에서의 형광 강도의 평균치를 산출하였다. 그 결과를 도 18에 나타낸다.

도 18에 나타내듯이, 클라도스포륨속균 전용 β-튜불린 유전자 증폭용 포워드 프라이머를 멀티 플렉스 PCR용 반응액에 더함으로써 크라도스포리움 스페로스파맘 특이적 프로브 이외의 β-튜불린에서 선택된 프로브에서의 형광 강도는 저하되어 있다. 그 형광 강도의 저하의 정도는 클라도스포륨속균 전용 β-튜불린 유전자 증폭용 포워드 프라이머의 농도가 0.5μM의 것보다 0.25μM의 것이 경미하다. 따라서 클라도스포륨속균 전용 β-튜불린 유전자 증폭용 포워드 프라이머의 농도는 0.25μM쪽이 적절한 것으로 밝혀졌다.

다음에, 본 발명의 곰팡이의 검사 방법에 의한 곰팡이 검출 시험 결과에 대해서 구체적으로 설명한다.

(시험 7:각종 배지 조성의 수분 활성 치에 의한 배양 시험)

PDA(Potato Dextrose Agar)배지와 MY(Malt+Yeast)배지에 당 등을 첨가하여 다양한 수분 활성치를 나타내는 배지 조성으로 이루어지는 각종 배지를 제작해서, 호 건성 곰팡이, 내 건성 곰팡이 및 호 습성 곰팡이를 배양해서, 각각의 배양 결과를 평가하였다.

1. 배지의 제작 방법

(1)PDA배지

PDA(DIFCO사제)에 포도당(와코순약공업 주식회사)및/또는 슈클로스(와코순약공업 주식회사)를 각종 비율로 첨가하여 1L의 이온 교환수에 현탁하여 오토 클레이브로 융해 후, 샬레에 분주하여 제작하였다. 또한 샬레 분 주 전에 세균증식을 방지할 목적으로, 클로람페니콜(와코순약공업 주식회사)을 최종 농도 50ppm이 되게 첨가하였다. MY배지에 대해서도 마찬가지이다.

(2)MY배지

이하의 MY에 슈클로스(와코순약공업 주식회사), 포도당, 한천(와코순약공업 주식회사)및 글리세린 중 적어도 하나를 각종 비율로 첨가하여 100ml의 이온 교환수에 현탁하여, 오토 클레이브로 융해 후, 샬레에 분주하여 제작하였다.

MY:엿기름(Malt Extract, DIFCO사제)+효모(Yeast Extract, DIFCO사제)

2. 배지의 수분 활성치의 측정

실제로 배양에 사용한 배지의 소정량에 대해서 로토로니크 수분 활성 측정 장치(GSI클레 오스 사제)를 사용하여 그 수분 활성치를 전용 밀폐 용기 내에서 측정하였다.

3. 배양 평가

상기 제작 방법에 따라 작성한 각종 배지(도 19의 실시예 1-10, 참고 예 1-6)을 사용해서 호 건성 곰팡이( Eurotium herbariorum ), 내 건성 곰팡이(A. niger ), 호 습성 곰팡이( Fusarium sp .)를 25℃의 어두운 곳에서 72시간 배양해서 얻어진 콜로니의 지름을 측정하였다. 배양 후의 콜로니의 지름이 10mm이상을 ○, 10mm미만을 x로 하였다. 그 결과를 도 19에 나타낸다.

이 도면에 도시한 바와 같이, 실시 예 1-10의 각종 배지를 사용했을 경우에는 호 건성 곰팡이, 내 건성 곰팡이 및 호 습성 곰팡이가 모두 충분하게 번식하고 있음을 알았다. 한편, 참고 예 1-6의 각종 배지를 사용한 경우에는 충분히 번식하지 않은 균종이 존재하고 있음을 알았다. 이 때문에, 복수의 균종을 동시에 배양하기 위해서는 수분 활성치가 1.0미만, 0.90이상인 동시에 당 농도 5%~50%의 범위로 하는 것이 적당하다.

(시험 8:각종 배지에 의한 배양 시험)

도 19에 나타낸 참고 예 1,2,4-6및 실시 예 7의 6종류의 배지를 사용하여 각종의 곰팡이를 25℃의 어두운 곳에서 168시간 배양해서 얻어진 콜로니의 지름을 측정하였다.

공시 균 종으로서는, 이하의 14종류의 것을 사용하였다. 결과를 도 20에 나타낸다. 이들 중 1-4의 공시 균 종은 호 건성의 곰팡이이며, 5-10의 공시 균 종은 내 건성 곰팡이이며, 11-14의 공시 균 종은 호 습성 곰팡이이다. 또한 이들의 공시 균 종은 환경 중에서 독자적으로 채취해서 동정하여 얻은 것이며, 그 번호는 편의상 붙인 것이다.

1. 아스페르길루스 페니시리오이데스(A. penicillioides, K-7-4)

2. 아스페르길루스 리스트릭타스(A. restrictus, I-2-1)

3. 유로치움 해루바리오루무(Eurotium herbariorum, 이 2-1)

4. 와레미아 세비(Wallemia sebi, KSS-1127)

5. 아스페르길루스 훌라 버스(A. flavus, B-3-3)

6. 아스페르길루스 후미가타스(A. fumigatus, KSS-1126)

7. 아스페르길루스 니가(A. niger, A-1-1)

8. 아스페르길루스 바시칼라(A. versicolor, 이 3-1)

9. 페니실리움 글러브럼(Penicillium glabrum, B-4-3)

10. 페니실리움 루그로삼(P. rugulosum, E-2-3)

11. 크라도스포리움 서퍼에스페루멈(Cladosporium . sphaerospermum, I-4-2)

12. 크라도스포리움 크라도스포리오이데스(C. cladosporioides, A-2-1)

13. 후사륨속균(Fusarium sp ., B5-3-C)

14. 스타키보토리스속균(Stachybotrys sp., KSS-1125)

도 20에 도시된 바와 같이 실시 예 7의 배지(M40Y)에 따르면 생육에 적합한 습도가 다른 복수 종류의 곰팡이의 콜로니가 생기고 상기 1-14의 모든 균종이 충분히 번식하고 있음을 알았다.

이와 같이 실시 예 7의 배지를 사용하면 최적 습도에 대한 성질이 다른 복수의 곰팡이를 같은 배지에서 동시에 배양 가능하다는 것이 명백해졌다.

(시험 9:각종 온도에 의한 배양 시험)

실시 예 7에서 사용한 M40Y배지를 사용하여 각종 온도로 배양을 통해서 얻어진 콜로니의 지름을 측정하였다. 공시 균 종은, 시험 1과 마찬가지로 호 건성 곰팡이, 내 건성 곰팡이 및 호 습성 곰팡이를 포함한 14종류를 사용해서 어두운 곳에서 168시간 배양하였다. 그 결과를 도 21에 나타낸다. 또한 3,8,13의 종균에 대해서 도 22에 콜로니의 사진을 나타낸다.

도 21의 실시 예 11-13에 나타내는 바와 같이, 배양 온도가 23℃~27℃의 범위에서는 호 건성 곰팡이, 내 건성 곰팡이 및 호 습성 곰팡이가 모두 충분하게 번식하고 있음을 알 수 있다. 한편, 참고 예 7-9에 나타내는 바와 같이, 배양 온도가 30℃~35℃의 범위에서는 생육할 수 없는 균 종이 존재하는 것을 알 수 있다. 이 때문에, 복수의 균종을 동시에 배양하기 위해서는 배양 온도를 25℃±2℃의 범위로 하는 것이 적당하다는 것을 알 수 있다.

(시험 10:DNA칩 해석 시험)

실시 예 7에서 사용한 M40Y배지를 사용하여 각종 곰팡이를 배양해서 얻어진 콜로니를 혼합하여 일괄해서 게놈 DNA를 추출하고 ITS1영역을 PCR법에 의해서 증폭해서 검출 대상 곰팡이가 증폭 산물에 포함되어 있는지 여부를 DNA칩에 의해서 검사하였다. 또한, DNA칩에 의한 검사 결과를 검증하기 위해서 DNA 서열 해석을 실시하였다. 구체적으로는 다음과 같이 실시하였다.

우선 실시 예 7에서 사용한 M40Y배지를 사용한 검체로서, No.1에서 No.60까지의 60개의 샘플을 준비하였다. 다음에, 에어 샘플러를 사용하여 일반 환경 중에서 공기를 채취하고, 상기 각 검체에 분사하여 배양하였다. 배양은 25℃의 어두운 곳에서 7일 간 정치해서 실시하였다.

다음에 검체마다, 배지에 생긴 다양한 종류의 곰팡이의 콜로니를 DNA 서열 해석에 제공하기 위해서 각 콜로니의 일부를 개별적으로 채취하여 각각 25℃의 어두운 곳에서 7-10일 간 분리 배양을 하였다.

또한 검체마다, 배지에 생긴 다양한 종류의 곰팡이의 콜로니를 일괄하여 채취해서 φ 0.5mm지르코니아 비즈를 넣은 바이알 병에 넣어 액체 질소에 담가 서 시료를 동결한 후 진탕 장치를 사용해서, 곰팡이의 세포를 파쇄하였다.

이어서 검체마다, DNA추출 장치에 의해서 곰팡이의 게놈 DNA를 추출하여 PCR법에 의해서 각 곰팡이의 ITS영역을 증폭하였다.

구체적으로는 PCR 반응액으로서 Ampdirect(R)(주식회사 시마즈제작소 제품)을 사용하고 다음의 조성의 것을 20μl작성하였다.

1.Ampdirect addition(G/Crich)4.0μl

2.Ampdirect(addition-4)4.0μl

3.dNTPmixture 1.0μl

4.Cy5-dCTP 0.2μl

5.ITS1영역 증폭용 포워드 프라이머(10μM, 서열 번호 42, 시그마-알드리치사에 의해 합성)1.0μl

6.ITS1영역 증폭용 리버스 프라이머(10μM, 서열 번호 43, 시그마-알드리치사에 의해 합성)1.0μl

7.시료의 게놈 DNA 1.0μl

8.NovaTaq polymerase 0.2μl

9.물(전체가 20.0μl이 될 때까지 물첨가)

이 PCR 반응액을 사용해서 핵산 증폭 장치(TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(R)Gradient다카라바이오 주식회사제)에 의해서 다음의 조건으로 DNA증폭을 하였다.

1.95℃ 10분

2.95℃ 30초

3.56℃ 30초

4.72℃ 60초(2~4를 40사이클)

5.72℃ 10분

DNA칩에는 진실리콘(R)(동양강판 주식회사제)을 사용하고 이에 서열 번호 44서열 번호 45서열 번호 46에 표시되는 염기 서열로 이루어진 프로브를 고정화한 것을 사용하였다. 이들은 각각 아스페르길루스 비토리코라(Aspergillus vitricola)검출용 프로브, 아스페르길루스 페니시리오이데스(Aspergillus penicillioides )검출용 프로브 및 유로치움속균(Eurotium sp.)검출용 프로브이다.

다음에, PCR증폭 산물에 완충액(3×SSC 구연산-생리 식염수+0.3%SDS)을 혼합하여, 상기 DNA칩에 적하하였다.

이 DNA칩을 45℃에서 1시간 정치하고 상기 완충액을 사용해서 하이브리다이즈 하지 않은 PCR산물을 마이크로 어레이에서 씻어 냈다.

이어서 DNA칩을 표지 검출 장치(진실리콘 전용 스캐너 BIOSHOT동양강판 주식회사제)에 의해서 각 프로브의 형광 강도를 측정하였다. 그 결과를 도 23-25에 나타낸다.

또한 검체마다 포함되는 균종의 DNA서열 해석을 위해 상기와 같이 콜로니마다 분리 배양 해서 얻어진 균종에서 게놈 DNA를 추출하여 PCR법에 의해서 증폭 산물을 얻었다.

이때 프라이머 세트는 서열 번호 42 및 43에 표시된 염기 서열로 이루어진 것을 사용하는 동시에, 핵산 합성 효소에는 TAKARA ExTaq폴리메라제를 사용하였다. 또한 핵산 증폭 장치에는 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(R)Gradient(다카라바이오 주식회사제)을 사용하고 기타는 상기와 마찬가지로 PCR 반응하였다.

이 PCR반응에 의해서 얻어진 증폭 산물과 서열 번호 47및 48에 표시된 염기 서열로 이루어진 프라이머 세트를 시퀀스용 프라이머로서, 다카라 바이오 주식 회사에 위탁하여, DNA시퀀서에 의해서 ITS1영역의 서열 해석을 실시하였다. 그 결과, 도 23-25와 같이 각 검체에서 최대 4균 종이 확인되었다.

도 23-25의 "DNA칩 해석(프로브 형광 강도)"에서 양성으로 생각되는 부분을 굵은 테두리로 둘러싸고 있다. 이들은 각각"ITS서열 해석에 의해서 확인된 검체 중에 포함되는 균종"에서 같은 균 종이 표시되어 있다.

또한 ITS서열 해석에 의해서 내 건성 곰팡이( Penicillium sp .) 및 호 습성 곰팡이( Cladosporium sp .)가 포함되어 있는 것이 판명된 검체 No.3에 대해서 Penicillium sp검출용 프로브 및 Cladosporium sp검출용 프로브를 고정화한 DNA칩을 사용해서 상기와 마찬가지로 표지 검출 장치에 의해서 형광 강도를 측정한바, 이들 균종( Penicillium sp ., Cladosporium sp .)의 검출이 확인되었다.

따라서 본 발명의 곰팡이의 검사 방법으로 복수 종류의 곰팡이를 같은 배지에서 동시에 배양한 경우에 각 곰팡이를 특이적으로 검출할 수 있음을 알았다.

본 발명은 이상의 실시 형태나 실시 예에 한정되는 것이 아니고 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경 실시가 가능함은 물론이다.

예를 들면, 상기의 시험 PCR용 반응액에서의 ITS영역 증폭용 프라이머 세트 및 β-튜불린 유전자 증폭용 프라이머 세트 외의 성분에 대해서는 적절히 변경할 수 있다. 또한, 이들의 증폭 산물을 사용해서 대상 곰팡이의 검출을 실시하는 방법이라면 상기와 같은 DNA칩을 사용해서 형광 검출을 하는 것이 아니라 전기 영동에 의한 검출이나 전류 검출 방식 등 다른 검출 방식의 DNA칩에 의해서 증폭 산물을 검출하는 것 등이 가능하다.

또한, 상기 실시예에서는 배지로서 M40Y등을 사용하고 있으나 이들에 한정되는 것이 아니고 수분 활성 치가 1.0미만, 0.90이상이며 당 농도 5%~50%의 고형 배지의 기타의 고형 배지를 사용하는 등 적절히 변경할 수 있다.

본 발명은 환경 검사, 식품 검사, 역학적 환경 검사, 임상 시험, 가축 위생 등에서 복수의 곰팡이를 특이적이고 다중으로 검출하는 경우에 적절히 사용할 수 있다. 또한 식품 제조 현장이나 임상 현장, 문화재 보호 환경 등에서의 곰팡이의 검사에 적절하게 이용할 수 있다.

<110> TOYO SEIKAN KAISHA,LTD <120> Method for detecting fungus, Reaction liquid for PCR and Carrier for detecting fungus <130> IP13-0018 <150> JP 2011-129632 <151> 2011-06-09 <160> 48 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 1 ttggtcattt agaggaagta aaagtc 26 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 2 ctgcgttctt catcgatgc 19 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 3 ggtaaccaaa tcggtgctgc tttc 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 4 accctcagtg tagtgaccct tggc 24 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 5 aagtgaactt tcaggcaccc g 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Eurotium sp. <400> 6 gtctgagttt ttagttaaac aat 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Eurotium sp. <400> 7 gaagactaac atttgaacac 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Eurotium sp. <400> 8 aggcctccaa caacaaatat gtc 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Aspergillus penicillioides <400> 9 gagacctcaa ccatgaacac t 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Aspergillus penicillioides <400> 10 gagacctcaa ccattgaaca ct 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Aspergillus penicillioides <400> 11 gagacctctc aaccattgaa ca 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Aspergillus penicillioides <400> 12 catcgtcagc atgtcacacc gc 22 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Aspergillus vitricola <400> 13 ctgagttttc ataaaagaaa aatcg 25 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Aspergillus vitricola <400> 14 ctgagttttc ataaagaaaa attg 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Aspergillus vitricola <400> 15 ccaaagtcca attggcatca aact 24 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Aspergillus Section Restricti <400> 16 gagttttcat ataagaaaaa tcg 23 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Aspergillus Section Restricti <400> 17 ttgccgtctg agttgtcata tacgaaa 27 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Aspergillus Section Restricti <400> 18 ccggagactc caacattgaa ca 22 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Aspergillus Section Restricti <400> 19 gtctgagttt tcatatacga aaaat 25 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Aspergillus Section Restricti <400> 20 ctgagttttc atatacgaaa aat 23 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Aspergillus Section Restricti <400> 21 atcaattagt atgccacgca c 21 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Aspergillus Section Nidulantes <400> 22 actactgaac ttcatgcctg agagt 25 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Aspergillus Section Nidulantes <400> 23 tttgatcgag tcttggacgg gt 22 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Aspergillus Section Fumigati <400> 24 gaacgctgtt ctgaaagtat 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Aspergillus Section Fumigati <400> 25 aacatctcac gatctgactc g 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Aspergillus Section Flavi <400> 26 gcaactaagg tacagtaaac a 21 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Aspergillus Section Flavi <400> 27 tgaaaacgct ttgcaactcc 20 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Penicillium sp. <400> 28 agtctgagtg aaaatataaa ttattta 27 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Penicillium sp. <400> 29 ttgcagtctg agcgaaaacg ca 22 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Penicillium sp. <400> 30 tgtcaattga tacccaacgc g 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium sp. <400> 31 gatctttcag gatttgcagc 20 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Penicillium sp. <400> 32 gtataaaggc ttctctaatg tt 22 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Stachybotrys chartarum <400> 33 accccaaact cttgtgtttt tttcag 26 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Stachybotrys chartarum <400> 34 ctcggctcac aatttcccca 20 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Fusarium solani <400> 35 ctgagtaaaa caagcaaata aat 23 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Fusarium solani <400> 36 tagatttggt ataggcttcg gg 22 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Cladosporium sp. <400> 37 actcttgcgt aactttgcag tct 23 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Cladosporium sp. <400> 38 ggtgttgtca gtgtgtggac gtgga 25 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Cladosporium sp. <400> 39 tgaggctctt gggacgtgcg 20 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 40 gcatcgatga agaacgcag 19 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 41 gagcccggta ccatggacgc 20 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> Aspergillus sp., Eurotium sp. <400> 42 ttggtcattt agaggaagta aaagtc 26 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Aspergillus sp., Eurotium sp. <400> 43 ctgcgttctt catcgatgc 19 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Aspergillus vitricola <400> 44 ctgagttttc ataaagaaaa attg 24 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Aspergillus penicillioides <400> 45 gagacctcaa ccatgaacac t 21 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Eurotium sp. <400> 46 gaagactaac atttgaacac 20 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Penicillium sp., Cladosporium sp. <400> 47 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Penicillium sp., Cladosporium sp. <400> 48 tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (10)

1. 곰팡이의 DNA에서의 표적 영역을 포함한 DNA단편을 증폭시켜서 증폭 산물의 유무를 확인하는 공정을 포함한 곰팡이의 검출 방법이며,
   상기 표적 영역으로서, ITS영역 및 β-튜불린 유전자의 양쪽을 사용해서
   상기 표적 영역의 증폭을 실시하기 위한 PCR용 반응액에서 ITS영역을 증폭시키기 위한 프라이머 셋트로서 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열로 이루어진 포워드 프라이머 및 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열로 이루어진 리버스 프라이머를 갖춘 프라이머 세트를 사용하고 β-튜불린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 셋트로서 서열 번호 3에 나타내는 염기 서열로 이루어진 포워드 프라이머 및 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 리버스 프라이머를 갖춘 프라이머 세트를 사용하고
   이들의 β-튜불린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트와 ITS영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 사용하여, 하나 또는 둘이상의 곰팡이의 종류마다, 상기 표적 영역의 양쪽을 동시에 증폭시키는 것을 특징으로 하는 곰팡이의 검출 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 표적 영역의 증폭을 실시하기 위한 PCR용 반응액에서 상기 β-튜불린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트와 상기 ITS영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트의 농도비가 1:0.9~1:0.1인 것을 특징으로 하는 곰팡이의 검출 방법.
   
3. 삭제
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표적 영역의 증폭을 하기위한 상기 PCR용 반응액에 클라도스포륨속균을 특이적으로 증폭시키기 위한 포워드 프라이머로서 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 곰팡이의 검출 방법.
   
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 곰팡이가 유로치움속균(Eurotium sp.), 아스페르길루스 페니시리오이데스종균(Aspergillus penicillioides), 아스페르길루스 비토리코라종균(Aspergillus vitricola), 아스페르길루스 리스트릭티절균(Aspergillus Section Restricti), 아스페르길루스 니듀랑테스절균(Aspergillus Section Nidulantes), 아스페르길루스 후미가티 절균(Aspergillus Section Fumigati), 아스페르길루스 후라비절균(Aspergillus Section Flavi), 페니실륨속균(Penicillium sp.), 스타치보토리스 챠타람종균(Stachybotrys chartarum), 푸사리움 소라니종균(Fusarium solani), 클라도스포륨속균(Cladosporium sp.)중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 곰팡이의 검출 방법.
   
6. 하나 또는 둘이상의 곰팡이의 종류마다, DNA에서의 ITS영역 및 β-튜불린 유전자의 표적 영역 양쪽을 동시에 증폭시키기 위해서 사용되는 PCR용 반응액이며, ITS영역을 증폭시키기 위한 프라이머 셋트로서 서열 번호 1에 나타내는 염기 서열로 이루어진 포워드 프라이머 및 서열 번호 2에 나타내는 염기 서열로 이루어진 리버스 프라이머를 갖춘 프라이머 세트와 β-튜불린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 셋트로서 서열 번호 3에 나타내는 염기 서열로 이루어진 포워드 프라이머 및 서열 번호 4에 나타내는 염기 서열로 이루어진 리버스 프라이머를 갖춘 프라이머 세트를 포함하고, 상기 β-튜불린 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트와 상기 ITS영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트의 농도비가 1:0.9~1:0.1인 것을 특징으로 하는 PCR용 반응액.
   
7. 제6항에 있어서, 클라도스포륨속균을 특이적으로 증폭시키기 위한 포워드 프라이머로서 서열 번호 5에 나타내는 염기 서열로 이루어진 프라이머를 추가로 포함한 것을 특징으로 하는 PCR용 반응액.
   
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