KR101719792B1 - 인삼의 푸사리움 솔라니 진단용 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents
인삼의 푸사리움 솔라니 진단용 프라이머 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101719792B1 KR101719792B1 KR1020140093041A KR20140093041A KR101719792B1 KR 101719792 B1 KR101719792 B1 KR 101719792B1 KR 1020140093041 A KR1020140093041 A KR 1020140093041A KR 20140093041 A KR20140093041 A KR 20140093041A KR 101719792 B1 KR101719792 B1 KR 101719792B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- ginseng
- fusarium solani
- primer
- fusarium
- pcr
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)을 검출하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)을 진단하기 위한 프라이머에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유전체를 추출하는 과정을 거치지 않고 직접 핵산 증폭 과정을 통해 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)을 진단할 수 있는 프라이머 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
식물의 병을 일으키는 균은 대부분 사상균으로, 토양병해도 마찬가지여서 주요 토양병원균의 토양 속에 서식하는 곰팡이의 일종이다. 푸사리움(Fusarium)균 역시 토양 속에서 서식하는 사상균의 일종으로 대부분이 토양 속의 유기물을 부식시키면서 부생생활을 한다. 푸사리움(Fusarium)균은 거의 대부분의 채소류에 기생하며 심한 피해를 준다. 다만 그 병원성(작물에 병해를 일으키게 하는 성질)은 각 작물에 일종의 칸막이 역할을 하여 보통조건, 즉 작물의 병에 대한 감수성이 특별히 높아지거나 균의 밀도나 활성이 비정상으로 높아지지 않는 조건에서는 다른 작물을 침해하는 일이 별로 없다.
푸사리움 솔라니(Fusarium solani)는 콩과, 감자과, 박과 등 다양한 채소와 인삼 등에서 주로 뿌리썩음병과, 과일썩음병 등과 같은 소위 푸사리움(Fusarium)병을 일으킨다. 푸사리움(Fusarium)병은, 전염원인 푸사리움(Fusarium)의 후막포자가 토양 속에 생존하여 전염하는 토양전염성 병해인데, 경우에 따라서는 이병주로부터 발생하는 런너를 통해 자묘로 침입하여 발병시키는 영양번식전염도 한다.
푸사리움(Fusarium)의 후막포자는 토양에서 생존능력이 우수하기 때문에 토양 병 방제를 위해 토양 훈증이나 약제 살포 방법을 사용하더라도 방제효과가 크지 않고, 토양 미생물상의 파괴와 환경에 큰 영향을 주기 때문에 이의 방제가 용이하지 않은 것이 현실이다. 한편, 뿌리썩음병에 대한 생물학적 방제 연구가 많이 이루어져, 길항 미생물, 중복기생균, 비병원성 푸사리움(Fusarium)균, Bacillus spp.균을 이용한 생물학적 방제가 시도되고 있다. 그러나 실용화된 생물학적 방제방법들이 효과적이지 않거나, 처리하기 쉽지 않은 문제점이 있다.
결과적으로, 인삼에의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)에 의한 감염후에 치료하는 것보다 사전에 방지할 수 있는 것이 더욱 효과적이며 이를 빠르고 정확하게 진단해내는 것이 인삼재배의 효율을 높인다는 측면에서 시급하게 요구되는 실정이다.
학술논문(Korean J. Ginseng Sci Vol.10, No.1(1986)) _ Influences of Fusarium solani and Phytophthora cactorum on the Changes in Saponin Components of Korean Ginseng(Panax ginseng C.A. Meyer)
본 발명은 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)의 유전체를 추출하지 않고 직접 핵산 증폭에 의해 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)을 진단할 수 있는 프라이머 및 이의 용도를 제공함으로써, 보다 신속하고 정확하게 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)을 진단할 수 있도록 하고자 한다.
본 발명의 일측면은 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 검출용 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
또한, 상기 프라이머 세트는 direct PCR(polymerase chain reaction)에 사용하기 위한 것인 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 진단용 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 상기 검출용 조성물을 포함하는 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 검출용 키트를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 일측면은 인삼 재배 토양 시료로부터 유래한 주형 DNA와 상기 프라이머 세트를 혼합하는 단계 및 상기 혼합 결과물을 PCR(polymerase chain reaction) 증폭시키는 단계를 포함하는 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)을 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
또한, 상기 PCR(polymerase chain reaction) 방법은 Direct PCR(polymerase chain reaction) 방법인 것인 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)을 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
또한, 상기 주형 DNA는 DNA 추출(extraction) 및 정제(purification) 과정 없이, 인삼 재배 토양을 용해 완충액(Lysis buffer)로 용해하여 준비한 것인 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)을 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 진단용 프라이머는 genomic DNA 추출에 필요한 시간과 비용이 필요하지 않고, 핵산증폭과정이 고속의 빠른 주기로 신속하게 실험할 수 있기 때문에 분석 시간을 크게 단축시킬 수 있으며, 상기의 프라이머의 개발을 통하여 토양에서 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.
도 1은 인삼 모잘록병 및 뿌리썩음병 유사 병징 프라이머의 특이성을 검정한 결과를 나타낸 것이다.
본 명세서에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 하기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
서열번호 1 내지 2로 표시되는 염기서열은 본 발명의 일측면에 따른 실시예로서 제시되는 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)을 진단할 수 있는 프라이머의 염기서열을 나타낸다. 서열번호 1은 정방향(forward) 프라이머를 나타내며, 서열번호 2는 역방향(reverse) 프라이머를 나타낸다.
본 발명에 따른 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 특이 프라이머는 종자, 식물체, 토양으로부터 genomic DNA 추출 과정을 거치지 않는 직접핵산증폭과정(direct polymerase chain reaction)을 통하여 고속의 온도 변화 주기에서 유전자 연쇄 증폭 반응이 안정적으로 이루어진다. 직접핵산증폭과정의 반응을 위해서는 98℃의 초기 고온과 64℃의 Tm 반응을 고속의 온도 변화 주기를 거치는 핵산증폭과정하에서 over heating이나 유전자 간섭없이 안정적으로 반응할 수 있는 프라이머 세트이다.
이하 본 발명의 일측면에 따른 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)의 진단을 할 수 있는 프라이머를 제작하기 위한 구체적인 실시예를 서술한다.
실시예 1. 프라이머의 제작
인삼에서 발생하는 뿌리썩음병 유사 병징(Fusarium solani)에 대하여 NCBI에서 Fusarium solani strain GL09415의 염기서열을 수집하여 beta-tubulin 유전자 염기 서열에서 프라이머를 총 1세트를 제작하였다. 프라이머에 대한 정보는 하기 표 1에 나타내었다. 2종의 프라이머를 조합하여 PCR을 수행한 결과, Fusarium solani 특이적인 밴드 양상을 보였고, 다른 토양 병원균에는 증폭되지 않았다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1을 참고하면, Lane 1은 100bp marker, Lane 2와 3은 Fusarium solani, Lane 4는 Cylindrocarpon destructance, Lane 5는 Cylindrocarpon discores, Lane 6은 Cladosporium sp., Lane 7은 Phytophthora capsici, Lane 8은 Acidovorax avenea, Lane 9는 Clavibacter michiganensis, Lane 10은 Psudomonas sp., Lane 11과 12는 Fusarium oxysporum, Lane 13은 Verticillium sp., Lane 14는 Pythium sp., Lane 15는 Rhizoctonia sp., Lane 16은 Ralstonia sp.을 각각 나타낸다.
| 프라이어명 | 프라이머의 염기서열(5'-3') | 서열번호 |
| Fsbt2F | agcttgtgcccctgattcta | 1 |
| Fsbt2R | gagatggtctgccagaaagc | 2 |
상기 각각의 프라이머쌍은 단독 또는 둘의 조합으로 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)을 진단할 수 있는 마커로 사용될 수 있다.
각 프라이머 또는 이들을 이용해 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)을 진단해내는 방법은 다음과 같다.
먼저 인삼을 재배하는 토양 시료로부터 주형 DNA를 제작한다. 이러한 주형 DNA에 본 발명의 일측면에 따른 프라이머 세트를 혼합한다. 이렇게 혼합한 결과물을 PCR 증폭시키는 단계를 거치면 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)에 특이성을 보이지 여부를 진단할 수 있다.
이때, 주형 DNA는 추출(extraction) 및 정제(purification) 과정 없이 인삼 종자 또는 인삼 식물체를 용해 완충액(Lysis buffer)로 용해하여 준비할 수 있다. 또한, PCR 증폭 시키는 단계는 direct PCR 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일측면에 따른 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)의 진단용 프라이머 조합과 그에 따른 PCR 산물의 크기를 아래 표 2에 나타내었다.
| 프라이머명 | 프라이머1 염기서열(5) | 프라이머명 | 프라이머2 염기서열(5) | PCR산물 크기(bp) |
| Fsbt2F | agcttgtgcccctgattcta | Fsbt2R | gagatggtctgccagaaagc | 211 |
PCR 결과, 토양 전염성 병원균인 Fusarium solani 2종, Cylindrocarpon destructance 1종, Cylindrocarpon discores 1종, Cladosporium sp. 1종, Phytophthora capsici 1종, Acidovorax avenea 1종, Clavibacter michiganensis 1종, Psudomonas sp. 1종, Fusarium oxysporum 2종, Verticillium sp. 1종, Pythium sp. 1종, Rhizoctonia sp. 1종, Ralstonia sp. 1종에서는 전혀 반응이 일어나지 않았고, Fusarium solani에 대하여만 특이적으로 반응하는 것을 확인하였다. 그 결과를 도 1에서 확인할 수 있다.
실시예 2. 인삼 뿌리썩음병 유사 병징 진단용 프라이머를 이용한 Direct PCR 반응
상기 실시예 1에서 제작한 2종의 프라이머 1 세트를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 조성은 하기 표 3에 기재한 바와 같으며, 98℃ 3분 → 95℃ 30초 → 95℃ 5초 → 62℃ 5초 → 72℃ 10초(35 사이클) → 72℃ 5분의 조건으로 진행하였다.
| Template DNA | 40ng |
| 2x Direct PCR buffer (includes dNTPs and MgCl2) |
1x |
| Direct Taq DNA polymerase | 0.4uM |
| Primer 1 | 0.4uM |
| Primer 2 | 0.4uM |
| Distilled water | 전체 부피를 20㎕에 맞춤 |
<110> Republic of Korea
<120> Primer for diagnosis of Fusarium solani and uses thereof
<130> PAA14-0092-KR0
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fsbt2F
<400> 1
agcttgtgcc cctgattcta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fsbt2R
<400> 2
gagatggtct gccagaaagc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fsbt2F(PCR)
<400> 3
agcttgtgcc cctgattcta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fsbt2R(PCR)
<400> 4
gagatggtct gccagaaagc 20
Claims (7)
- direct PCR(polymerase chain reaction)에 사용하기 위한 것인 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 검출용 프라이머 세트.
- 삭제
- 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 검출용 조성물.
- 제3항의 검출용 조성물을 포함하는 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 검출용 키트.
- 인삼 재배 토양 시료로부터 유래한 주형 DNA와 상기 제1항의 프라이머 세트를 혼합하는 단계; 및
상기 혼합 결과물을 PCR(polymerase chain reaction) 증폭시키는 단계;를 포함하는 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)을 검출하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 PCR(polymerase chain reaction) 방법은 Direct PCR(polymerase chain reaction) 방법인 것인 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)을 검출하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 주형 DNA는 DNA 추출(extraction) 및 정제(purification) 과정 없이, 인삼 재배 토양을 용해 완충액(Lysis buffer)로 용해하여 준비한 것인 인삼의 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)을 검출하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140093041A KR101719792B1 (ko) | 2014-07-23 | 2014-07-23 | 인삼의 푸사리움 솔라니 진단용 프라이머 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140093041A KR101719792B1 (ko) | 2014-07-23 | 2014-07-23 | 인삼의 푸사리움 솔라니 진단용 프라이머 및 이의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20160011855A KR20160011855A (ko) | 2016-02-02 |
| KR101719792B1 true KR101719792B1 (ko) | 2017-03-28 |
Family
ID=55354378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020140093041A KR101719792B1 (ko) | 2014-07-23 | 2014-07-23 | 인삼의 푸사리움 솔라니 진단용 프라이머 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101719792B1 (ko) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012169099A1 (ja) * | 2011-06-09 | 2012-12-13 | 東洋製罐株式会社 | カビの検出方法、ｐｃｒ用反応液、及びカビ検出用担体 |
-
2014
- 2014-07-23 KR KR1020140093041A patent/KR101719792B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 이현주, "Fusarium 속의 β-tubulin gene의 RFLP 및 partial DNA sequence analysis", 상명대학교 석사학위 논문 (2006) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20160011855A (ko) | 2016-02-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Prigigallo et al. | Molecular analysis of Phytophthora diversity in nursery‐grown ornamental and fruit plants | |
| Studholme et al. | Application of high-throughput DNA sequencing in phytopathology | |
| Alvarez et al. | Characterization of a phytoplasma associated with frogskin disease in cassava | |
| KR101719794B1 (ko) | 인삼의 피시움 울티뭄 진단용 프라이머 및 이의 용도 | |
| KR101483595B1 (ko) | 양배추 뿌리혹병 저항성 품종을 식별하기 위한 snp 마커 및 그의 용도 | |
| Li et al. | Specific and sensitive detection of Phytophthora nicotianae by nested PCR and loop‐mediated isothermal amplification assays | |
| Chen et al. | Root exudates of potato onion are involved in the suppression of clubroot in a Chinese cabbage-potato onion-Chinese cabbage crop rotation | |
| Meyer et al. | Molecular survey of endosymbionts in Florida populations of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) and its parasitoids Tamarixia radiata (Hymenoptera: Eulophidae) and Diaphorencyrtus aligarhensis (Hymenoptera: Encyrtidae) | |
| Urashima et al. | Application of PCR-denaturing-gradient gel electrophoresis (DGGE) method to examine microbial community structure in asparagus fields with growth inhibition due to continuous cropping | |
| Fei et al. | Infection and gene expression of the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae in resistant and susceptible canola cultivars | |
| Tipu et al. | Citrus greening disease (HLB) on Citrus reticulata (Mandarin) caused by Candidatus Liberibacter asiaticus in Bangladesh | |
| KR101560736B1 (ko) | 배추 뿌리혹병 진단용 프라이머 및 이의 용도 | |
| Brylińska et al. | Evaluation of PCR markers for Phytophthora infestans mating type determination | |
| Kunta et al. | Diverse DNA extraction methods and PCR primers for detection of Huanglongbing-associated bacteria from roots of ‘Valencia’sweet orange on sour orange rootstock | |
| CN104745698A (zh) | 瓜类蔓枯病菌的环介导等温扩增引物组合物 | |
| Oksal | Natural phytoplasma infections on fruit, vegetable and weed plants at the same agroecosystem and their molecular properties | |
| CN101113467A (zh) | 香蕉枯萎病菌4号生理小种的检测引物及其检测方法 | |
| KR101719792B1 (ko) | 인삼의 푸사리움 솔라니 진단용 프라이머 및 이의 용도 | |
| Chow et al. | Evaluating the host defense responses in oil palm to complex biocontrol endophyte–pathogen–host plant interaction via Fluidigm® real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) | |
| Aravind et al. | Single tube duplex PCR for simultaneous detection of Phytophthora capsici and Radopholus similis infecting black pepper (Piper nigrum) | |
| Arif et al. | Highly sensitive end-point PCR and SYBR green qPCR detection of Phymatotrichopsis omnivora, causal fungus of cotton root rot | |
| KR20130077298A (ko) | 고추 역병 종 구분 프라이머 및 이를 이용한 검출 방법 | |
| KR101704399B1 (ko) | 토마토 궤양병원균 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| KR101909786B1 (ko) | 로젤리니아 네카트릭스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 | |
| Kim et al. | Evaluation of viroid extraction methods and application of a one-step reverse transcription real-time polymerase chain reaction assay (RT-qPCR) for the rapid detection of Chrysanthemum stunt viroid (CSVd) infection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |