WO2012169099A1 - カビの検出方法、ｐｃｒ用反応液、及びカビ検出用担体 - Google Patents

カビの検出方法、ｐｃｒ用反応液、及びカビ検出用担体 Download PDF

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淳憲 一色
卓 田辺
仁詩 竹治
真実 小梶
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東洋製罐株式会社
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting mold, and more particularly to a method for detecting mold for specifically detecting a wide variety of molds with high accuracy, a reaction solution for PCR, and a carrier for detecting molds.
  • identification methods using genes have been carried out in mold inspection. For example, after culturing a sample collected from the environment, DNA is extracted from cultured cells, the target region is amplified by PCR (polymerase chain reaction) method, and molds in the sample are analyzed by analyzing the amplification product. Identification is being conducted.
  • a method of analyzing the amplification product for example, a method of analyzing the size of the amplification product by electrophoresis, or a DNA chip on which a probe that binds complementarily to the amplification product is immobilized, the mold present in the sample is identified. Methods have been proposed (see Patent Documents 2 to 6).
  • JP 2007-195454 A JP 2008-35773 A JP 2008-278848 A JP 2008-278861 A JP, 2010-4879, A JP, 2009-284832, A
  • Patent Documents 5 and 6 disclose that the ⁇ -tubulin gene is identified as a region to be amplified. In these documents, it is shown that, by using the ⁇ -tubulin gene as a region to be amplified, a specific type of mold can be detected. However, when only the ⁇ -tubulin gene is the amplification target region, there is a problem that false positive reactions may occur as in the case where only the ITS region is the amplification target region.
  • the present inventors have found that a wide variety of fungi can be detected with high accuracy by using both the ITS region and the ⁇ -tubulin gene as an amplification target region, and the present invention has been completed.
  • Molds are divided into psychrophilic molds (preferable to dry state), dry-resistant molds (tolerable to dry), and moisturizable molds (preferred to wet state) based on the humidity suitable for growth, each of which It was necessary to culture by a suitable different culture medium.
  • first and second methods conventionally and generally performed as described above, since it is necessary to culture for each bacterial species, a plurality of fungi are mixed and cultured, and further, it is further carried out. There was no concept of detecting each mold individually. For this reason, there has not conventionally been a technique for simultaneously culturing a xerophilic mold, a xerophilic mold and a xerophilic mold to make each mold specifically detectable.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and the identification of mold is carried out by amplifying the ITS region and the ⁇ -tubulin gene in the genomic DNA of mold in the sample and confirming the presence or absence of the amplification product.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting mold, a reaction solution for PCR used therefor, and a carrier for detecting mold. Moreover, without separating and culturing multiple types of fungi, while simultaneously culturing them in the same medium, they are mixed and extracted together and genomic DNA is extracted, and each mold can be specifically detected by a DNA chip. The purpose is to provide an inspection method.
  • a method of detecting a mold of the present invention is a method of detecting a mold comprising a step of amplifying a DNA fragment containing a target region in mold DNA and confirming the presence or absence of an amplification product
  • the ITS region and the ⁇ -tubulin gene are used.
  • false positive reactions are reduced as compared with the case where only one of them is used as the target region. it can. For this reason, it becomes possible to detect a wide range of molds more accurately.
  • a primer set for amplifying the ⁇ -tubulin gene in the reaction solution for PCR and a primer set for amplifying the ITS region It is preferable to set the concentration ratio of 1: 0.9 to 1: 0.1.
  • concentration ratio of primer sets By setting the concentration ratio of primer sets in this way, both the ITS region and the ⁇ -tubulin gene can be efficiently amplified by performing PCR reaction using PCR reaction solutions containing these primer sets. be able to. For this reason, it becomes possible to perform a test
  • concentration ratio of the primer set for amplifying the ⁇ -tubulin gene and the primer set for amplifying the ITS region is 1: 0.5 to 1: 0.25, both of these amplifications are performed. It is more preferable because the efficiency can be made the most efficient.
  • the PCR reaction solution of the present invention is a PCR reaction solution for amplifying a target region, and as a primer set for amplifying an ITS region, a forward primer comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and A forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a base shown in SEQ ID NO: 4 as a primer set equipped with a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a primer set for amplifying the ⁇ -tubulin gene And a primer set provided with a reverse primer consisting of a sequence.
  • the reaction solution for PCR can amplify both the ITS region and the ⁇ -tubulin gene in various fungi. For this reason, the presence or absence of mold can be determined based on both of these amplification products, and a wider range of mold can be detected with high accuracy.
  • the reaction solution for PCR of the present invention further include a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 as a forward primer for specifically amplifying Cladosporium bacteria. If the reaction solution for PCR is used in this way, DNA fragments of cladosporium bacteria which can not be efficiently amplified can be amplified only by using the reaction solution for PCR containing the primers consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 It is possible to detect the bacteria appropriately.
  • the carrier for detecting mold of the present invention is a probe having a base sequence selected from the ITS region for each of one or more mold types and a probe having a base sequence selected from the ⁇ -tubulin gene As fixed. If a mold detection carrier is used in this way, an amplification product obtained by simultaneously amplifying the ITS region and the ⁇ -tubulin gene is dropped onto the mold detection carrier to complement the base sequence of the probe. Molds having DNA binding can be detected. On this mold detection carrier, both a probe having a base sequence selected from the ITS region and a probe having a base sequence selected from the ⁇ -tubulin gene are immobilized for each type of mold. Therefore, the presence or absence of mold can be confirmed based on both of them. Then, when there is a detection in both the ITS region and the ⁇ -tubulin gene, it is possible to reduce the determination that the mold is present based on false positives, which is higher. It becomes possible to detect mold of accuracy.
  • the method of testing a fungus of the present invention comprises culturing a plurality of types of fungi, mixing the cultured plurality of types of fungi, collectively extracting genomic DNA, and using a DNA chip to produce a plurality of types of fungi.
  • a method to simultaneously and specifically detect each of If the method of testing mold of the present invention is such a method, cultured fungus species can be specifically detected even if the fungus is cultured while being mixed without being divided individually for each fungus species. . That is, even if the extraction of the genomic DNA of each mold is collectively performed in a state in which a plurality of kinds of cultured molds are mixed, each mold can be detected by the DNA chip.
  • a general method as a method of detecting the extracted genomic DNA using a DNA chip.
  • a PCR reaction solution containing a primer set for amplifying a specific region of a mold to be detected is used to amplify a specific region of genomic DNA by the PCR method.
  • a probe previously selected from the region amplified by this primer set is immobilized on a DNA chip.
  • the primer set and the probe need to be prepared in advance for each specific region of the mold to be detected.
  • the amplification product obtained by the PCR method is dropped onto the DNA chip, and the amplification product bound to the probe is detected, whereby various fungi contained in the mixture can be specifically detected.
  • At least two kinds of molds selected from the group consisting of at least psychrophilic mold, dry-resistant mold and moisturizing mold are simultaneously cultured in a predetermined culture medium. It is also preferable to use methods for simultaneously and specifically detecting each of the cultured molds.
  • molds which require different humidity environments which are usually cultured individually, can be simultaneously cultured in a predetermined medium. And each mold can be specifically detected from these mixtures. For this reason, it is possible to simultaneously culture and detect all at once without considering the nature of the mold, etc., and it becomes possible to simplify the inspection of the mold.
  • the water activity value is less than 1.0, 0.90 or more, and the sugar concentration is 5 to 50%, and further 10%. It is preferable to set it to ⁇ 40%.
  • glucose and sucrose are suitably used as the type of sugar.
  • any of a xerophilic mold, a xerophilic mold and a xerophilic mold can be suitably cultured, and all the molds are simultaneously cultured at the same time, It becomes possible to perform the detection.
  • a plurality of cultured molds are placed in a container containing beads for physically breaking the mold cell wall, mixed, and collectively extracted genomic DNA Is also preferred. If the method of testing mold of the present invention is such a method, it is possible to extract genomic DNA collectively from a plurality of types of mold cultured at the same time.
  • the plurality of molds be mold spores and mycelium suspended or adhered in the air. If the method of testing molds of the present invention is such a method, molds in the environment can be collected and cultured, and these can be easily detected simultaneously.
  • the present invention it is possible to detect a wide variety of molds with high accuracy. Further, according to the present invention, it is possible to simultaneously culture a plurality of types of molds in the same medium, mix them together, extract genomic DNA collectively, and detect each mold specifically with a DNA chip. Become.
  • FIG. It is a figure which shows the fluorescence intensity for every primer set density
  • FIG. It is a figure which shows the fluorescence intensity for every primer set density
  • FIG. It is a figure which shows the fluorescence intensity for every primer set density
  • FIG. It is a figure which shows the fluorescence intensity for every primer set density
  • FIG. It is a figure which shows the result of test 2 for confirming the correlation of the fluorescence intensity in DNA chip analysis, and the amount of amplification products by PCR.
  • the mold detection method of the present embodiment is a mold detection method comprising a step of amplifying a DNA fragment including a target region in mold DNA and confirming the presence or absence of an amplification product, wherein the ITS region is used as a target region, , ⁇ -tubulin gene is used.
  • the type of mold is not particularly limited, but, for example, Eurotium sp., Aspergillus penicillioides, Aspergillus section restricti, Wallemia sebi (Wallemia sebi) ), Aspergillus vitricola species (Aspergillus vitricola), Penicillium sp., Aspergillus section Fumigati, Aspergillus section Flavi, Aspergillus n. Aspergillus niger (Aspergillus Section Nigri), Stativotris chartalum species (Stachybotrys chartarum), Fusarium solani species (Fusarium solani), Kladsporium spp. Molds such as Cladosporium sp.
  • Fusarium oxysporum Fusarium graminarium (Fusarium graminiarum), Fusarium verticillioides (Fusarium verticillioides), Pythium ultimum (Pythium ultimum), Coleotricium phylum ich.
  • Colletotrichum acutium inoculum Colletotrichum acutatum
  • Verticillium ariatrium Verticillium dahiae
  • Verticillium alboatrum inoculum Verticillium albo-atrum
  • Alternaria alternanata species Alternaria alternate
  • Trichophyton lubrum species Trichophyton rubrum
  • Trichophyton tonsurans Trichoderma viride (Trichoderma viride), etc. It can be.
  • the target region in the method for detecting a fungus of the present embodiment is a region to be amplified in the DNA of fungus, and a specific spacer, a gene or the like can be used as such a region.
  • ITS Internal Transcribed Spacer
  • ⁇ -tubulin gene are simultaneously used as the target region.
  • the method for amplifying the DNA fragment containing the target region is not particularly limited, but PCR (polymerase chain reaction) can be suitably used.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a PCR reaction solution containing a primer set for amplifying a target region is used to amplify a specific region in mold DNA.
  • a general thermal cycler or the like can be used, and PCR can be performed, for example, under the following reaction conditions.
  • a method by electrophoresis As a method of confirming the presence or absence of an amplification product, a method by electrophoresis, a method of detection using a DNA chip, or the like can be suitably used.
  • the electrophoresis method for example, the amplification product of PCR is migrated by microcapillary electrophoresis using MultiNA (R) (manufactured by Shimadzu Corporation), and the size is confirmed based on the position of the band. It can be determined whether the correct amplification product has been obtained.
  • MultiNA MultiNA
  • the method using a DNA chip immobilizes a probe that specifically hybridizes to a target region to a DNA chip in advance, drops the amplification product of PCR onto this DNA chip, detects the label of the amplification product, etc. It can be determined whether a product has been obtained.
  • the detection of the label can be performed using a general label detection device such as a fluorescence scanning device, and can be performed, for example, by measuring the fluorescence intensity of the amplification product using BIOSHOT of Toyo Kogyo Co., Ltd.
  • the label is not limited to fluorescence, and other labels may be used.
  • a primer set for amplifying the ITS region in mold DNA and a primer set for amplifying the ⁇ -tubulin gene are used as the primers.
  • the ITS region is a portion that is spliced to RNA after transcription. For this reason, it has low preservation compared with the coding region and is highly variable, but the similarity between mold species is high, and in many cases false positive reactions occur. For this reason, when many types of mold probes are immobilized on a DNA chip and used for mold identification, if only those selected from the ITS region are used as the probes, detection accuracy may be lowered. .
  • reaction solution for PCR The reaction solution for PCR of the present embodiment is used in the case of performing amplification of a DNA fragment containing a target region by the PCR method in the above-described mold detection method.
  • this reaction solution for PCR for example, one having the following composition is preferably used.
  • a nucleic acid synthesis substrate dNTP mixture (dCTP, dATP, dTTP, dGTP)
  • a primer set a nucleic acid synthetase (such as Nova Taq polymerase)
  • a labeling component such as Cy5-dCTP
  • genomic DNA of a sample a sample, buffer solution, and the like
  • a PCR reaction solution containing water for example, Ampdirect (R) (manufactured by Shimadzu Corporation) can be used.
  • a primer set in the reaction solution for PCR of this embodiment a primer set consisting of a forward primer and a reverse primer capable of amplifying an ITS region in mold DNA, and a ⁇ -tubulin gene in mold DNA
  • a primer set consisting of forward and reverse primers capable of amplification is used.
  • the primer set in the reaction solution for PCR of the present embodiment is not particularly limited as long as it has a primer set for ITS region amplification and a primer set for ⁇ -tubulin gene amplification as described above, but specifically, for example, Can be used. That is, as shown in FIG. 2, a primer set comprising a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is suitably used as a primer set for ITS region amplification. Can.
  • a primer set for amplification of ⁇ -tubulin gene a primer set provided with a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 can be suitably used.
  • the concentration ratio of the primer set for ⁇ -tubulin gene amplification and the primer set for ITS region amplification is preferably 1: 0.9 to 1: 0.1.
  • the ITS region is present in more than 100 copies, whereas the ⁇ -tubulin gene is present in only one copy.
  • the size of the amplification product by the former PCR method is about 250 bp, while the size of the amplification product by the latter PCR method is 350 to 550 bp. Therefore, if the concentrations of the primer set for amplification of the ⁇ -tubulin gene and the primer set for amplification of the ITS region are made the same in the reaction solution for PCR, the amplification product of the ⁇ -tubulin gene can not be obtained sufficiently and detection accuracy is lowered. There was a problem that.
  • both the ITS region and the ⁇ -tubulin gene can be suitably amplified at the above-mentioned concentration ratios.
  • concentration ratio of the primer set for amplification of the ⁇ -tubulin gene and the primer set for amplification of the ITS region is 1: 0.5 to 1: 0.25
  • the amplification product is fluorescently labeled to detect molds based on the fluorescence intensity.
  • both the ITS region and the fluorescence of the ⁇ -tubulin gene can be obtained with high intensity, which is more preferable.
  • the reaction solution for PCR of the present embodiment contains a primer for specifically amplifying Cladosporium bacteria.
  • a primer for example, a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 in FIG. 2 can be used.
  • an amplification product can be obtained by PCR for the ⁇ -tubulin gene of cladosporium sp. -The hybridization with the said amplification product and the probe selected from the sequence
  • the forward primer for specifically amplifying this cladosporium is for amplifying the ⁇ -tubulin gene, and is paired with the reverse primer shown in SEQ ID NO: The ⁇ -tubulin gene of the genus Bacillus can be amplified.
  • the final concentration of the cladosporium-specific forward primer in the reaction solution for PCR is preferably 0.5 ⁇ M or less, and more preferably 0.125 ⁇ M to 0.5 ⁇ M. This is because if the final concentration range of the cladosporium-specific forward primer is thus set, it is possible to suitably detect the cladosporium. In addition, if the final concentration of the cladosporium bacteria-specific forward primer in the reaction solution for PCR is 0.25 ⁇ M to 0.5 ⁇ M, it is possible to more suitably detect the cladosporium bacteria. In particular, the final concentration of 0.25 ⁇ M is more preferable because the influence on detection of other bacterial species can be almost minimized.
  • each primer in the above primer set is not limited to the above base sequence itself, and it is possible to use one appropriately modified within the range of performing the same function. That is, one or several bases can be deleted, substituted or added in each base sequence. In addition, it may be one that can be hybridized under stringent conditions to a nucleic acid fragment consisting of a nucleotide sequence complementary to each nucleotide sequence.
  • Stringent conditions are conditions under which a specific hybrid is formed and a nonspecific hybrid is not formed.
  • conditions under which DNA having high homology (90% or more, preferably 95% or more) with the above primer set is hybridized with DNA consisting of a base sequence complementary to the above primer set.
  • hybridization occurs at a temperature about 5 ° C. to about 30 ° C., preferably about 10 ° C. to about 25 ° C. lower than the solution temperature (Tm) of the complete hybrid.
  • Tm solution temperature
  • the carrier for detecting mold of the present embodiment comprises a probe having a base sequence selected from the ITS region and a probe having a base sequence selected from the ⁇ -tubulin gene for each of one or two or more mold types. It is characterized in that it is immobilized, and can be constructed using a DNA chip or the like. Thus, each type of mold is provided with both a probe that binds to the amplification product of the ITS region and a probe that binds to the amplification product of the ⁇ -tubulin gene, and fluorescence is detected in both of these probes. By determining mold as positive, it is possible to appropriately eliminate an erroneous determination based on a false positive reaction.
  • the following probes can be used for each type of mold. That is, as a probe for detecting Eurotium sp. (Eurotium sp.), At least one of the probes having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 7 selected from the ITS region, and ⁇ -tubulin gene selected A probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 can be used.
  • At least one of the probes having a base sequence shown in SEQ ID NOS: 9 to 11 selected from the ITS region, and ⁇ -tubulin gene are selected.
  • a probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 can be used.
  • At least one of the probes having a base sequence shown in SEQ ID NO: 13 or 14 selected from the ITS region, and ⁇ -tubulin gene A probe having the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 can be used.
  • At least one of the probes having a base sequence shown in SEQ ID NO: 16 to 20 selected from the ITS region, and ⁇ -tubulin A probe having a base sequence shown in SEQ ID NO: 21 selected from genes can be used.
  • a probe having a base sequence shown in SEQ ID NO: 22 selected from the ITS region and SEQ ID NO: 23 selected from the ⁇ -tubulin gene as a probe for detecting Aspergillus Nidulantes (Aspergillus Section Nidulantes)
  • the probe which has a base sequence shown to can be used.
  • a probe for detecting Aspergillus section Fumigati a probe having a base sequence shown in SEQ ID NO: 24 selected from the ITS region, and SEQ ID NO: 25 selected from the ⁇ -tubulin gene
  • the probe which has a base sequence shown to can be used.
  • a probe having a base sequence shown in SEQ ID NO: 26 selected from the ITS region, and SEQ ID NO: 27 selected from the ⁇ -tubulin gene, for detecting Aspergillus section Flavi A probe having a base sequence can be used.
  • the probe which has a base sequence shown to can be used.
  • the probe which has can be used.
  • a probe having a base sequence shown in SEQ ID NO: 40 selected from the ITS region and a probe having a base sequence shown in SEQ ID NO: 41 selected from the ⁇ -tubulin gene may be used as probes common to fungi. it can.
  • the carrier for detecting mold reduces the determination error based on false positive reaction by immobilizing a probe that respectively binds to the ITS region of each mold and the amplification product of the ⁇ -tubulin gene. It has become possible to detect a wide range of molds with high accuracy.
  • the mold detection carrier of the present embodiment can be used in a usual manner, and the method is not particularly limited, but can be used, for example, as follows.
  • a PCR amplification product obtained by the method for detecting mold of the present embodiment is mixed with a buffer solution (3 ⁇ SSC citric acid-saline solution) to which 0.3% SDS (sodium dodecyl sulfate) is added. It drips on the carrier for mold detection of this embodiment.
  • the mold detection carrier is allowed to stand at 45 ° C. for 1 hour, the unhybridized PCR product is washed away from the mold detection carrier using the above buffer solution. Then, it is possible to detect mold by measuring the fluorescence intensity with a labeled detection device.
  • each of the probes immobilized on the mold detection carrier of the present embodiment similarly to the case of the sequence of each primer in the above-described primer set, it is possible to use one appropriately modified within the range of performing the same function. It is. That is, one or several bases can be deleted, substituted or added in each base sequence. In addition, it may be one that can be hybridized under stringent conditions to a nucleic acid fragment consisting of a nucleotide sequence complementary to each nucleotide sequence.
  • each of the above-mentioned probes or one having one or more bases deleted, substituted or added in each base sequence, or each base sequence
  • a probe having a complementary nucleotide sequence to one that can be hybridized under stringent conditions to a nucleic acid fragment consisting of a complementary nucleotide sequence can also be used.
  • the amplification product obtained by the PCR method in the method for detecting a mold of the present embodiment also includes a nucleic acid fragment having a base sequence complementary to the nucleic acid fragment that hybridizes with the above-mentioned probe.
  • a probe consisting of a nucleotide sequence complementary to SEQ ID NO: 6 to 41 shown in FIG. 3 and a nucleotide sequence equivalent thereto is a nucleotide sequence complementary to a nucleic acid fragment hybridizing with the above-mentioned probe Can be hybridized with a nucleic acid fragment having
  • a probe consisting of a nucleotide sequence complementary to SEQ ID NO: 6 to 41 shown in FIG. 3 and a nucleotide sequence equivalent thereto, ie, one or several bases in each nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 to 41
  • a carrier for detecting mold of the present embodiment that can be hybridized under stringent conditions to a nucleic acid fragment consisting of a deletion, substitution or addition, or a nucleotide sequence complementary to each nucleotide sequence It is also possible to detect the target molds when immobilized on
  • test method of the mold of this embodiment culture cultivates multiple types of molds, mixes several types of cultured molds, extracts genomic DNA collectively, and uses DNA chip for multiple types of molds. As long as each of them is detected simultaneously and specifically, it is not limited to the specific contents of the following embodiments and examples.
  • the mold inspection method of the present embodiment can include the following steps. (1) Collection of mold First, air is collected at a food manufacturing site, a clinical site, a protected environment of a cultural property, etc. using an air sampler. Then, the collected air is blown onto a dedicated medium or the like in the form of a strip for the air sampler and cultured.
  • M40Y, MY10G medium, MY30G medium or the like which can be cultured with any of psychrophilic, dry-resistant, and moisturizing fungi.
  • M40Y medium it is particularly preferable to use the M40Y medium, because it is possible to culture a mold having any of the above-mentioned properties with high efficiency.
  • culture conditions it is preferable to stand in the dark at a temperature of 23 ° C. to 27 ° C. for about 2 to 7 days.
  • M40Y medium, MY10G medium, and MY30G medium are considered as those for psychrophilic fungi, and have not been considered suitable for moisturizing fungal culture.
  • colonies of various types of mold generated in the culture medium are collected at once without separating them individually. Then, for example, the collected sample is put in a vial containing ⁇ 0.5 mm zirconia beads, and the whole vial is immersed in liquid nitrogen to freeze the sample, and then the fungal cells are broken using a shaking device etc. Do. In addition, destruction of cells may be performed so that DNA can be extracted, and may be performed by other methods.
  • a primer set capable of amplifying the ITS1 region of rDNA of various fungi is added to the PCR reaction solution, and identification in the genomic DNA of the fungus in the above sample is performed by PCR. Amplify the area.
  • the forward primer and the reverse primer those having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 42 and 43, respectively, can be used.
  • a general thermal cycler or the like can be used as a PCR device.
  • nucleic acid synthesis substrate dNTP mixture (dCTP, dATP, dTTP, dGTP), primer set, nucleic acid synthetase (Nova Taq polymerase etc.), labeling component (Cy5-dCTP etc.), genomic DNA of sample, buffer solution, and the rest
  • a PCR reaction solution containing water for example, Ampdirect (R) (Shimadzu Corporation) can be used as a buffer solution.
  • the PCR reaction conditions in the method for testing a mold of the present embodiment are preferably as follows, for example.
  • the DNA chip of the present embodiment may be one in which a probe selected from DNA of mold to be detected is immobilized, and is not particularly limited in other points.
  • a spot-type DNA chip, a synthetic DNA chip, or the like can be used.
  • a probe that binds to the amplification region to be amplified by the primer set included in the PCR reaction solution of the method for testing a mold of the present embodiment is synthesized in advance and immobilized on the substrate of the DNA chip.
  • a probe for detecting Aspergillus vitricola one consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 44 can be used.
  • Aspergillus penicillioides one consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 45 can be used.
  • As a probe for detecting Eurotium sp. One consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 46 can be used.
  • the PCR amplification product is dropped onto the DNA chip to detect the label of the PCR amplification product hybridized to the mold detection probe.
  • a predetermined buffer solution is mixed with the PCR amplification product and dropped onto a DNA chip.
  • the DNA chip is allowed to stand at 45 ° C. for 1 hour, and then the unhybridized PCR product is washed away from the DNA chip with a predetermined buffer.
  • the DNA chip is subjected to detection by the labeled detection device to determine whether or not there is a mold to be detected.
  • marker detection apparatus general things, such as a fluorescence scanning apparatus, can be used, for example.
  • marker and its detection method are not limited to fluorescence, You may use another method.
  • a plurality of molds can be simultaneously cultured using a culture medium capable of culturing any of the psychrophilic, dry-resistant and hydrophilic molds. Can. Then, the cultured molds are mixed and the genomic DNA is extracted at once, and each of a plurality of types of molds can be detected simultaneously and specifically using a DNA chip. For this reason, it is not necessary to separate and culture the collected mold, and it is possible to quickly and easily detect plural types of mold at once.
  • Test 1 In the method for detecting mold of the present invention, a reaction solution for PCR, which enables simultaneous amplification of both the ITS region and the ⁇ -tubulin gene in detecting various fungi by DNA chip analysis using multiplex PCR Test 1 was performed to find out the concentration range of each primer set in.
  • the target fungi to be detected were wild fungi collected from the facility environment. That is, the air in the facility environment was collected using an air sampler, and this was sprayed on each culture medium of samples A to D for culture. The culture was allowed to stand for 7 days in the dark at 25 ° C.
  • colonies of various types of mold generated in the culture medium are collected at once, placed in a vial containing ⁇ 0.5 mm zirconia beads, immersed in liquid nitrogen to freeze the sample, and shaken. The device was used to disrupt mold cells.
  • genomic DNA of mold was extracted by a DNA extraction device, and the ITS region of each mold and the ⁇ -tubulin gene were simultaneously amplified by PCR.
  • a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 shown in FIG. 2 and a reverse primer (R primer) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 shown in FIG.
  • a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 shown in FIG. 2 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 were used.
  • Ampdirect (R) (manufactured by Shimadzu Corporation) was used for each of the samples A to D as a reaction solution for PCR, and 20 ⁇ l of the following composition was prepared.
  • Ampdirect (G / Crich) 4.0 ⁇ l 2.
  • Ampdirect (addition-4) 4.0 ⁇ l 3.
  • dNTPmix 1.0 ⁇ l 4.
  • Cy-5dCTP 0.2 ⁇ l 5.
  • BtR primer (10 ⁇ M) 1.0 ⁇ l 9.
  • Template DNA (each for each sample A to D) 1.0 ⁇ l 10.
  • NovaTaq polymerase 0.2 ⁇ l 11.
  • Water water is added to 20.0 ⁇ l)
  • primers for amplifying the ITS region each of the forward primer and the reverse primer was blended in the following proportions, and the other four reaction solutions for PCR similar to the above were prepared.
  • DNA was amplified under the following conditions by a nucleic acid amplification apparatus (TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (R) Gradient Takara Bio Co., Ltd.).
  • A 95 ° C. 10 minutes
  • b 95 ° C. 30 seconds
  • c 56 ° C. 30 seconds
  • d 72 ° C. 60 seconds
  • E 72 ° C for 10 minutes
  • ⁇ Probes selected from ⁇ -tubulin gene> (1) Eurotium sp. SEQ ID NO: 8 (2) Aspergillus penicillioides inoculum SEQ ID NO: 12 (3) Aspergillus vitricola species SEQ ID NO: 15 (4) Aspergillus listolyticus setarum SEQ ID NO: 21 (5) Aspergillus nidurantes Bacillus anthracis SEQ ID NO: 23 (7) Aspergillus flavibial fungus SEQ ID NO: 27 (8) Penicillium sp. SEQ ID NO: 30 (12) Mold common SEQ ID NO: 41
  • the PCR amplification product was mixed with buffer solution (3 ⁇ SSC citrate-saline + 0.3% SDS), heated at 94 ° C. for 5 minutes, and dropped onto the above-mentioned DNA chip.
  • the DNA chip was allowed to stand at 45 ° C. for 1 hour, and the unhybridized PCR product was washed away from the DNA chip using the above buffer.
  • the DNA chip is applied to a labeled detection device (GenePix 4100A Molecular Devices) to measure the fluorescence intensity of each probe, and the fluorescence intensity of the ITS region probe and the ⁇ -tubulin gene probe for each concentration ratio of the primer set The mean value of fluorescence intensity was calculated.
  • FIGS. 5 shows sample A
  • FIG. 6 shows sample B
  • FIG. 7 shows sample C
  • FIG. 8 shows sample D.
  • FIG. 8 shows fluorescence intensities at various concentration ratios of the primer set.
  • FIGS. 9 to 12 show the fluorescence intensity for each probe for various concentration ratios of the primer set when using samples A to D, respectively. Note that “N” in FIGS. 5 to 8 indicates the number of probes in FIGS. 9 to 12, respectively. The same applies to FIG.
  • Test 2 was performed to confirm the correlation between the fluorescence intensity in DNA chip analysis and the amount of amplification product by PCR. Specifically, for each of the samples B and C in Test 1, the ratio of the final concentration of the primer set for the ⁇ -tubulin gene to the final concentration of the primer set for the ITS region is the following five reactions for PCR: The solution was used to perform PCR as in Test 1.
  • (Lane 1) 0.5 ⁇ M: 0.5 ⁇ M (Lane 2) 0.5 ⁇ M: 0.25 ⁇ M (Lane 3) 0.5 ⁇ M: 0.125 ⁇ M (Lane 4) 0.5 ⁇ M: 0.0625 ⁇ M (Lane 5) 0.5 ⁇ M: 0.03125 ⁇ M
  • the obtained amplification product was analyzed using MultiNA (R) (manufactured by Shimadzu Corporation).
  • R MultiNA
  • the band in lane 1 is thin
  • the lane 2 band is slightly dark
  • the bands in lanes 3 to 5 are dark.
  • the bands in lanes 1 and 2 are dark
  • the lane 3 band is slightly dark
  • the bands in lanes 4 and 5 are light. This result corresponds to the fluorescence intensity in the DNA chip analysis of sample B shown in FIG.
  • the bands in lanes 1 and 2 are thin, and the bands in lanes 3 to 5 are relatively dark.
  • the bands in lanes 1 to 3 are dark, and the bands in lanes 4 and 5 are light.
  • Test 3 A similar test was performed again using Test 1 and a separate sample to confirm primer set concentrations that could simultaneously detect both the ITS region and the ⁇ -tubulin gene.
  • a mold to be detected was a wild mold collected from a facility environment, sprayed on each medium of samples E to H, and cultured. The colonies of various fungi generated in the culture medium of the samples E to H were separated and cultured, and each colony was subjected to DNA sequence analysis to confirm its species. The results are shown in FIG.
  • Ampdirect (R) (manufactured by Shimadzu Corporation) was used for each of the samples E to H, and 20 ⁇ l of the following composition was prepared.
  • Ampdirect (G / Crich) 4.0 ⁇ l 2.
  • Ampdirect (addition-4) 4.0 ⁇ l 3.
  • dNTPmix 1.0 ⁇ l 4.
  • Cy-5dCTP 0.2 ⁇ l 5.
  • ITS1-Fw primer (5 ⁇ M) 0.5 ⁇ l 6.
  • ITS1-Rv primer (5 ⁇ M) 0.5 ⁇ l 7.
  • BtR primer (10 ⁇ M) 1.0 ⁇ l 9.
  • Template DNA (each for each sample E to H) 1.0 ⁇ l 10.
  • NovaTaq polymerase 0.2 ⁇ l 11.
  • Water water is added to 20.0 ⁇ l)
  • an ITS region amplification primer was prepared as follows, and 20 ⁇ l of the same composition as above was prepared. ITS1-Fw primer (2.5 ⁇ M) 2.5 ⁇ M ITS1-Rv primer (2.5 ⁇ M) 2.5 ⁇ M
  • ITS1-Fw primer 2.5 ⁇ M
  • ITS1-Rv primer 2.5 ⁇ M
  • the ones on which the following probes were immobilized were used for the DNA chip. Otherwise, the fluorescence intensity in the probe is measured in the same manner as in Test 1, and the fluorescence intensity in the ITS region probe and the average of the fluorescence intensity in the ⁇ -tubulin gene probe are measured for each concentration ratio of the primer set. The value was calculated. The results are shown in FIG. In addition, "N" in the same figure has shown the number of probes x 3 times (number of tests), respectively.
  • ⁇ Probes selected from ⁇ -tubulin gene> (1) Eurotium sp. SEQ ID NO: 8 (2) Aspergillus penicillioides inoculum SEQ ID NO: 12 (4) Aspergillus listolyticus setarum SEQ ID NO: 21 (12) Mold common SEQ ID NO: 41
  • the ratio of the final concentration of the primer set for the ⁇ -tubulin gene to the final concentration of the primer set for the ITS region is 0.5 ⁇ M: 0.25 ⁇ M (1: 1/2)
  • the fluorescence intensity of both the ITS region and the ⁇ -tubulin gene probe is greater than in the case of the case. Therefore, in order to determine the presence or absence of mold based on the detection results of both of them, the ratio of the final concentration of the primer set for ⁇ -tubulin gene and the final concentration of the primer set for ITS region is set to 0.5 ⁇ M: 0.125 ⁇ M. Is considered optimal.
  • Test 4 When targeting various fungi that are not wild fungi contained in samples A to H collected from the facility environment, can they be detected by the method for detecting fungi using the ITS region and the ⁇ -tubulin gene of the present invention as a target region? Verified. As fungi to be detected, the following four strains 1 to 4 were mixed and used.
  • JCM RIKEN BioResource Center
  • Microbial Materials Development Office Japan Collection of Microorganisms
  • NBRC National Institute of Technology and Evaluation, National Institute of Technology and Evaluation, Biotech Headquarters, Biogenetic Resource Center (NITE Biological Resource Center)
  • strains are planted in a culture medium and allowed to stand and cultured in the dark at 25 ° C. for 7 days, and then mold colonies of each strain are collected at once, and the mold genomic DNA is extracted as in Test 1. Then, the ITS region of each mold and the ⁇ -tubulin gene were co-amplified by PCR. At this time, as in Test 3, the final concentration ratio of the primer set for ⁇ -tubulin gene amplification and the primer set for ITS region amplification is 0.5 ⁇ M: 0.25 ⁇ M and 0.5 ⁇ M: 0.125 ⁇ M.
  • a reaction solution for PCR was prepared. In each PCR reaction solution, 1.0 ⁇ l of each of strains 1 to 4 was added and the total amount of the sample DNA was 4.0 ⁇ l. Then, the ITS region of each mold and the ⁇ -tubulin gene were amplified by each PCR reaction solution.
  • the ones on which the following probes were immobilized were used for the DNA chip. Then, the amplification product by PCR is hybridized to the probe, the fluorescence intensity in the probe is measured, and the average of the fluorescence intensity in the ITS region probe and the fluorescence intensity in the ⁇ -tubulin gene probe are measured for each concentration ratio of the primer set. The value was calculated. The other points were the same as in Test 1. The results are shown in FIG. Further, FIG. 16 shows the fluorescence intensity for each concentration ratio of the primer set and for each probe.
  • the ratio of the concentration of the primer set for the ⁇ -tubulin gene to the final concentration of the primer set for the ITS region was 0.5 ⁇ M: 0.25 ⁇ M (1: 1/2) and 0.5 ⁇ M: 0.
  • the fluorescence intensities in both the ITS region probe and the ⁇ -tubulin gene probe show sufficient values for detection. Therefore, it was confirmed that the four strains 1 to 4 can also be detected by the method for detecting a fungus having the ITS region and the ⁇ -tubulin gene of the present invention as a target region.
  • Test 5 In Test 4, as described above, when the primer set for ⁇ -tubulin gene amplification (SEQ ID NOs: 3 and 4) is used, fluorescence is detected in the probe for ⁇ -tubulin gene for cladosporium spherosparum. It was not detected. In Test 4, a probe capable of binding complementarily to the ⁇ -tubulin gene was immobilized on the DNA chip, and it is not clear why the fluorescence was not detected in the probe.
  • SEQ ID NOs: 3 and 4 primer set for ⁇ -tubulin gene amplification
  • the same four strains 1 to 4 as in Test 4 were mixed and used.
  • the final concentration ratio of the primer set for ⁇ -tubulin gene amplification and the primer set for ITS region amplification is 0.5 ⁇ M: 0.25 ⁇ M and 0.5 ⁇ M: 0.125 ⁇ M.
  • forward primers for ⁇ -tubulin gene amplification specific to cladosporium bacteria were added to give final concentrations of 0 ⁇ M, 0.5 ⁇ M, 0.25 ⁇ M, and 0.125 ⁇ M. The solution was made.
  • ClaS-beta 2 (0 ⁇ M, 10 ⁇ M, 5 ⁇ M, 2.5 ⁇ M) 0 ⁇ l, 1.0 ⁇ l, 0.5 ⁇ l, 0.25 ⁇ l 10.
  • Template DNA (1.0 ⁇ l each of strains 1 to 4) 4.0 ⁇ l 11.
  • NovaTaq polymerase 0.2 ⁇ l 12.
  • Water (water is added to 20.0 ⁇ l)
  • the ratio of the concentration of the primer set for ⁇ -tubulin gene to the final concentration of the primer set for ITS region is 0.5 ⁇ M: 0.25 ⁇ M (1: 1/2) to 0.5 ⁇ M: 0
  • 125 ⁇ M (1: 1/4) the final concentration of the forward primer exclusively for cladosporium is 0.5 ⁇ M to 0.25 ⁇ M
  • high fluorescence intensity is obtained for cladosporium.
  • Test 6 The effect of the forward primer for cladosporium bacteria (SEQ ID NO: 5) used in Test 5 on the fluorescence intensity of probes other than the cladosporium spherospaum specific probe (SEQ ID NO: 39) was verified. As molds to be detected, the same four strains 1 to 4 as in Test 4 were mixed and used.
  • the final concentration ratio of the primer set for amplification of ⁇ -tubulin gene and the primer set for amplification of ITS region is 0.5 ⁇ M: 0.125 ⁇ M, and a ⁇ -tube dedicated to cladosporium bacteria
  • Three reaction solutions for PCR were prepared in which forward primers for phosphorus gene amplification were added to final concentrations of 0 ⁇ M, 0.5 ⁇ M, and 0.25 ⁇ M.
  • Ampdirect (R) (manufactured by Shimadzu Corporation) was used, 20 ⁇ l of the following composition was prepared, and in the same manner as in Test 1, the ITS region of each mold and the ⁇ -tubulin gene were It amplified.
  • Ampdirect (G / Crich) 4.0 ⁇ l 2.
  • Ampdirect (addition-4) 4.0 ⁇ l 3.
  • dNTPmix 1.0 ⁇ l 4.
  • ClaS-beta2 (0 ⁇ M, 10 ⁇ M, 5 ⁇ M) 0 ⁇ l, 1.0 ⁇ l, 0.5 ⁇ l 10.
  • Template DNA (1.0 ⁇ l each of strains 1 to 4) 4.0 ⁇ l 11.
  • NovaTaq polymerase 0.2 ⁇ l 12.
  • Water (water is added to 20.0 ⁇ l)
  • a forward primer for amplification of cladosporium bacteria dedicated ⁇ -tubulin gene to a reaction solution for multiplex PCR, a ⁇ -tube other than a cladospora spherospaum specific probe
  • the fluorescence intensity in the probe selected from phosphorus is reduced.
  • the degree of decrease in the fluorescence intensity is less in the case of 0.25 ⁇ M than in the case of 0.5 ⁇ M in the concentration of the forward primer for amplification of the ⁇ -tubulin gene for cladosporium genus bacteria. Therefore, it was revealed that the concentration of the forward primer for amplification of .beta.-tubulin gene exclusively for cladosporium is 0.25 .mu.M.
  • Test 7 culture test by water activity value of various medium compositions
  • Sugar and the like were added to PDA (Potato Dextrose Agar) medium and MY (Malt + Yeast) medium to prepare various mediums comprising medium compositions showing various water activity values, and lyophilizing mold, drying resistant mold and moisturizing mold Culture was performed to evaluate each culture result.
  • PDA medium Add glucose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and / or sucrose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in various proportions to PDA (DIFCO) and add 1 L of After suspending in ion exchange water and melting in an autoclave, it was dispensed into petri dishes and prepared. Prior to petri dish dispensing, chloramphenicol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to a final concentration of 50 ppm for the purpose of preventing bacterial growth. The same is true for MY medium.
  • MY medium To the following MY, at least one of sucrose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), glucose, agar (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and glycerin is added in various proportions to 100 ml of ion exchange It was suspended in water, thawed by an autoclave, and then dispensed into petri dishes.
  • sucrose Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • glucose agar
  • glycerin glycerin
  • the water activity value of a predetermined amount of culture medium actually used for culture was measured in a dedicated closed vessel using a rotonic water activity measurement device (manufactured by GSI Creos).
  • Example 1-10 when the various culture media of Example 1-10 are used, it can be seen that all of the xerophilic fungi, xerophilic fungi and xerophilic fungi grow sufficiently.
  • the various culture media of Reference Example 1-6 when the various culture media of Reference Example 1-6 are used, it can be seen that there are bacterial species which have not been sufficiently propagated. Therefore, in order to simultaneously culture a plurality of bacterial species, it is preferable that the water activity value is less than 1.0, 0.90 or more, and the sugar concentration is in the range of 5% to 50%. Recognize.
  • Test 8 culture test with various media
  • various fungi were cultured at 25 ° C. in the dark for 168 hours, and the diameter of the obtained colonies was It was measured.
  • test bacteria The following 14 types of bacteria were used as test bacteria. The results are shown in FIG. Among them, 1-4 test fungi are psychrophilic fungi, 5-10 test fungi are tolerant fungi, and 11-14 test fungi are thermophilic fungi. . In addition, these test bacterial species are uniquely obtained from the environment and obtained by identification, and the numbers are given for convenience.
  • Aspergillus penicillioides A. penicillioides, K-7-4) 2. Aspergillus listricus (A. restrictus, I-2-1) 3. Eurotium herbariorum (I 2-1) 4. Wallemia sebi (Wallemia sebi, KSS-1127) 5. Aspergillus flavas (A. flavus, B-3-3) 6. Aspergillus fumigatus (A. fumigatus, KSS-1126) 7. Aspergillus niger (A. niger, A-1-1) 8. Aspergillus Versicolor (A. versicolor, i 3-1) 9. Penicillium glabrum (Penicillium glabrum, B-4-3) 10.
  • Penicillium Rugrosum P. rugulosum, E-2-3) 11.
  • Cladosporium Safaerosperma (Cladosporium. Sphaerospermum, I-4-2) 12.
  • Cladosporium cladosporioides (C. cladosporioides, A-2-1) 13. Fusarium sp. (Fusarium sp., B5-3-C) 14.
  • Stachybotrys Stachybotrys (Stachybotrys sp., KSS-1125)
  • Test 9 culture test at various temperatures
  • the culture was performed at various temperatures using the M40Y medium used in Example 7, and the diameter of the obtained colony was measured.
  • the test fungus species was cultured in the dark for 168 hours in the same manner as in Test 1 using 14 types including a xerophilic mold, a xerophilic mold and a xerophilic mold.
  • the results are shown in FIG.
  • the photograph of a colony is shown in FIG. 22 about a 3, 8, 13 microbe species.
  • Example 11-13 of FIG. 21 it can be seen that, when the culture temperature is in the range of 23 ° C. to 27 ° C., all of the xerophilic fungi, xerophilic fungi and xerophilic fungi grow sufficiently. .
  • Reference Example 7-9 it can be seen that, at culture temperatures in the range of 30 ° C. to 35 ° C., bacterial species which can not grow exist. Therefore, it is understood that it is preferable to set the culture temperature in the range of 25 ° C. ⁇ 2 ° C. in order to culture a plurality of bacterial species simultaneously.
  • Test 10 DNA chip analysis test
  • Various fungi are cultured using the M40Y medium used in Example 7, and the obtained colonies are mixed and collectively genomic DNA is extracted, the ITS1 region is amplified by PCR method, and the detection target fungus is an amplification product. It was examined by a DNA chip whether it was contained or not. Moreover, in order to verify the test result by a DNA chip, DNA sequence analysis was performed. Specifically, it carried out as follows.
  • Example 7 As a sample using the M40Y medium used in Example 7, No. 1 1 to No. Up to 60 60 samples were prepared. Next, air was collected from the general environment using an air sampler, and sprayed and cultured on each of the above samples. The culture was allowed to stand for 7 days in the dark at 25 ° C.
  • each sample a portion of each colony is individually collected and subjected to 7-10 days in the dark at 25 ° C. in order to subject the colonies of various types generated in the medium to DNA sequence analysis. Separate culture was performed. Furthermore, for each sample, colonies of various types of mold generated in the medium are collected at once, placed in a vial containing ⁇ 0.5 mm zirconia beads, immersed in liquid nitrogen to freeze the sample, and then shaken. The device was used to disrupt mold cells.
  • Reverse primer for ITS1 region amplification (10 ⁇ M, SEQ ID NO: 43, synthesized by Sigma Aldrich) 1.0 ⁇ l 7. 1.0 ⁇ l of genomic DNA from the sample 8. NovaTaq polymerase 0.2 ⁇ l 9. Water (water is added to 20.0 ⁇ l)
  • amplification of DNA was performed under the following conditions with a nucleic acid amplification apparatus (TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice® Gradient manufactured by Takara Bio Inc.). 1.95 ° C 10 minutes 2.95 ° C 30 seconds 3.56 ° C 30 seconds 4.72 ° C 60 seconds (40 cycles of 2 to 4) 5.72 ° C 10 minutes
  • Gene Silicon (R) (made by Toyo Kogyo Co., Ltd.) was used, to which a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, and SEQ ID NO: 46 was immobilized .
  • R Gene Silicon
  • SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, and SEQ ID NO: 46 a probe for detecting Aspergillus vitricola, a probe for detecting Aspergillus penicillioides, and a probe for detecting Eurotium sp.
  • a buffer solution (3 ⁇ SSC citric acid-saline + 0.3% SDS) was mixed with the PCR amplification product and dropped onto the above-mentioned DNA chip.
  • the DNA chip was allowed to stand at 45 ° C. for 1 hour, and unhybridized PCR products were washed away from the microarray using the above buffer.
  • strength of each probe was measured with the label
  • genomic DNA was extracted from the bacterial species obtained by separating and culturing for each colony as described above, and amplification products were obtained by the PCR method.
  • primer set used what consists of a base sequence shown to sequence number 42 and 43
  • TAKARA ExTaq polymerase was used for the nucleic acid synthetase.
  • a TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (R) Gradient manufactured by Takara Bio Inc.
  • the amplification product obtained by this PCR reaction and a primer set consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 47 and 48 were consigned to Takara Bio Inc. as sequencing primers, and sequence analysis of the ITS1 region was performed by a DNA sequencer. .
  • sequence analysis of the ITS1 region was performed by a DNA sequencer. .
  • FIG. 23-25 up to four bacterial species were confirmed from each sample.
  • the present invention is not limited to the above embodiments and examples, and various modifications can be made within the scope of the present invention.
  • components other than the primer set for ITS region amplification and the primer set for ⁇ -tubulin gene amplification in the reaction liquid for PCR of the above-mentioned test can be appropriately changed.
  • fluorescence detection is not performed using a DNA chip as described above, but other detection such as detection by electrophoresis or current detection method It is possible to detect an amplification product with a DNA chip of the system.
  • M40Y or the like is used as the culture medium, but the medium is not limited thereto, and the water activity value is less than 1.0, 0.90 or more, and the sugar concentration is 5% to 50%. It is possible to change suitably, such as using other solid media of solid media.
  • the present invention can be suitably used in the case of specifically and multiply detecting a plurality of molds in environmental examination, food examination, epidemiological environmental examination, clinical examination, livestock health and the like. Moreover, it is possible to use suitably for the test

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Abstract

カビの存否を確認する検査において、広範囲の種類のカビを精度高く特異的に検出することを可能とする。カビのＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させ、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、標的領域として、ＩＴＳ領域、及び、β－チューブリン遺伝子を用いる方法とする。また、標的領域の増幅を行うためのＰＣＲ用反応液において、β－チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットの濃度比を、１：０．９～１：０．１とする。

Description

カビの検出方法、ＰＣＲ用反応液、及びカビ検出用担体
　本発明は、カビの検出方法に関し、特に広範囲の種類のカビを精度高く特異的に検出するためのカビの検出方法、ＰＣＲ用反応液、及びカビ検出用担体に関する。
　近年、食品製造現場や臨床現場、文化財保護環境等において、カビなどの微生物が存在するか否かを検査して安全性を確認するとともに、その繁殖を防止することが重要となっている。
　このようなカビの検査では、一般的に、環境中から試料を採取して前培養し、次いで菌種ごとに最適な培地で２０日程度の培養を行った後に、形態的特徴を観察することで、カビを同定する形態観察法（培養法）が行われている（特許文献１参照）。
　しかしながら、この方法では、カビ種ごとに分離培養することが必要であるため、検査工程が煩雑になるという問題があった。また、培養に長期間を要するため、例えばヒトが生活する屋内の検査や食物の検査など、迅速性が要求される検査には不適切であるという問題があった。さらに、形態的特徴を表す胞子が形成されないと同定ができず、労力が無駄になってしまう場合があるという問題もあった。
　また、最近は、カビの検査において遺伝子を用いた同定法も行われている。例えば、環境中から採取した試料を培養した後、培養細胞からＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によりターゲット領域を増幅し、その増幅産物を解析することで、試料中のカビを同定することが行われている。増幅産物を解析する方法としては、例えば電気泳動によって増幅産物のサイズを分析する方法や、増幅産物と相補的に結合するプローブを固定化したＤＮＡチップを用いて、試料中に存在するカビを同定する方法などが提案されている（特許文献２～６参照）。
特開２００７－１９５４５４号公報 特開２００８－３５７７３号公報 特開２００８－２７８８４８号公報 特開２００８－２７８８６１号公報 特開２０１０－４８７９号公報 特開２００９－２８４８３２号公報
　しかしながら、このような遺伝子を用いた同定法によっても、カビ種内の類似性が高い場合には、単一の標的遺伝子の有無やサイズだけで種を特定することは極めて困難であり、例えば種レベルの同定確度が要求される検査には適さないという問題があった。
　ここで、特許文献２～４では、各種カビの遺伝子におけるＩＴＳ（Internal　Transcribed　Spacer）領域を増幅対象領域として、同定が行われている。このようなＩＴＳ領域にもとづくカビの同定では、カビの種類が増加するにしたがって、偽陽性反応も増加し、検査精度が低下してしまうという問題があった。
　一方、特許文献５，６には、β－チューブリン遺伝子を増幅対象領域として同定を行うことが記載されている。これらの文献には、β－チューブリン遺伝子を増幅対象領域とすることで、特定の種類のカビを検出できることが示されている。
　しかしながら、β－チューブリン遺伝子のみを増幅対象領域とすると、ＩＴＳ領域のみを増幅対象領域とする場合と同様に、偽陽性反応が生じる場合があるという問題があった。
　そこで、本発明者らは鋭意研究した結果、ＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子の両方を増幅対象領域として用いることで、広範囲の種類のカビを精度高く検出することを見いだし、本発明を完成させた。また、ＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子を同時反応系で効率的に増幅させ得るための条件も見いだした。
　ところで、上記の通り、形態同定を行う方法には、形態的特徴を発現させるため、菌種ごとに最適な培地と長期間の培養が必要となり、さらに同定には熟練が必要となることから、迅速な検査や検査の簡易化に適するものではないという問題があった。
　また、ＰＣＲ及び配列解析による方法でも、菌種ごとに個別に培養するため、１４日程度の比較的長い検査期間が必要となり、また菌種ごとに個別に解析することが必要であることから、多検体処理が要求される場合に適するものではないという問題があった。
　これに対して、ＤＮＡチップによる新たな検出方法によれば、理論上、複数種類のカビを一括して検出することが可能であり、迅速かつ簡易な検査方法として期待されている。
　一方、カビは生育に適する湿度にもとづいて、好乾性カビ（乾燥状態を好む）、耐乾性カビ（乾燥に耐えうる）、及び好湿性カビ（湿潤状態を好む）に分けられ、これらはそれぞれに適した異なる培地によって培養する必要があった。また、上述した従来一般的に行われている第一及び第二の方法では、菌種ごとに培養することが必要であったことから、複数のカビを混合して培養し、さらにその上で、それぞれのカビを個別に検出するという概念は存在していなかった。このため、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを同時に培養して、それぞれのカビを特異的に検出可能にする技術は、従来は存在していなかった。
　本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、試料中のカビのゲノムＤＮＡにおけるＩＴＳ領域及びβ－チューブリン遺伝子を増幅し、その増幅産物の有無を確認することにより、カビの同定を行うカビの検出方法、並びにこれに用いるＰＣＲ用反応液、及びカビ検出用担体の提供を目的とする。
　また、複数種類のカビを分離培養することなく、同じ培地で同時に培養すると共に、これらを混合して一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップにより各カビを特異的に検出可能にするカビの検査方法の提供を目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明のカビの検出方法は、カビのＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させ、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、標的領域として、ＩＴＳ領域、及び、β－チューブリン遺伝子を用いる方法としてある。
　このように増幅の標的領域として、ＩＴＳ領域、及び、β－チューブリン遺伝子を併用すれば、これらのいずれか一方のみを標的領域として用いた場合に比較して、偽陽性反応を低減させることができる。このため、広範囲のカビをより精度高く検出することが可能となる。
　また、本発明のカビの検出方法において、標的領域の増幅をＰＣＲ法により行う場合、ＰＣＲ用反応液におけるβ－チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとの濃度比を、１：０．９～１：０．１とすることが好ましい。
　プライマーセットの濃度比をこのようにすれば、これらのプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を用いてＰＣＲ反応を行うことにより、ＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子の両方を共に効率的に増幅することができる。このため、これらを同時に検出することで、カビの検査をより高い精度で行うことが可能となる。なお、β－チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセット、及び、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットの濃度比を、１：０．５～１：０．２５とすれば、これら両方の増幅効率を最も効率的にすることができるため、より好ましい。
　また、本発明のＰＣＲ用反応液は、標的領域の増幅を行うためのＰＣＲ用反応液であって、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットと、β－チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットとを含むものとしてある。
　ＰＣＲ用反応液をこのようにすれば、各種カビにおけるＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子の両方を増幅させることができる。このため、これら両方の増幅産物にもとづきカビの有無を判定することができ、より広範囲のカビを精度高く検出することが可能となる。
　また、本発明のＰＣＲ用反応液を、クラドスポリウム属菌を特異的に増幅させるためのフォワードプライマーとして、配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーをさらに含むものとすることも好ましい。
　ＰＣＲ用反応液をこのようにすれば、配列番号１～４に示す塩基配列からなるプライマーを含むＰＣＲ用反応液を用いただけでは、効率的に増幅できないクラドスポリウム属菌のＤＮＡ断片を増幅することができ、当該菌を適切に検出することが可能となる。
　また、本発明のカビ検出用担体は、一又は二以上のカビの種類毎に、ＩＴＳ領域から選択された塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された塩基配列を有するプローブを固定化したものとしてある。
　カビ検出用担体をこのようにすれば、ＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子を同時に増幅して得られた増幅産物を、このカビ検出用担体に滴下することで、プローブの塩基配列と相補的に結合するＤＮＡを有するカビを検出することができる。このカビ検出用担体には、カビの種類毎に、ＩＴＳ領域から選択された塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された塩基配列を有するプローブの両方が固定化されているため、これらの両方にもとづきカビの存否確認を行うことができる。そして、ＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子の両方に検出があった場合にカビが存在すると判定することで、偽陽性にもとづいて存在するとの判定が行われることを低減することができ、より高い精度のカビ検出を行うことが可能となる。
　また、本発明のカビの検査方法は、複数種類のカビを培養し、この培養された複数種類のカビを混合して、一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いて複数種類のカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出する方法としてある。
　本発明のカビの検査方法をこのような方法にすれば、カビを菌種ごとに個別に分けることなく、混在したまま培養しても、培養された菌種を特異的に検出することができる。すなわち、培養された複数種類のカビが混合された状態で、それぞれのカビのゲノムＤＮＡの抽出をまとめて行っても、ＤＮＡチップにより、各カビを検出することができる。
　なお、抽出されたゲノムＤＮＡを、ＤＮＡチップを用いて検出する方法としては、一般的な手法を用いることが可能である。
　具体的には、例えば検出対象カビの特定領域を増幅するためのプライマーセットを含むＰＣＲ反応液を用いて、ＰＣＲ法によりゲノムＤＮＡの特定領域を増幅する。このプライマーセットによる増幅領域から予め選択されたプローブをＤＮＡチップに固定化しておく。このとき、プライマーセット及びプローブは、検出対象カビの特定領域ごとに予め作成しておく必要がある。そして、ＰＣＲ法により得られた増幅産物を当該ＤＮＡチップに滴下し、プローブに結合した増幅産物を検出することで、混合物に含まれる各種カビをそれぞれ特異的に検出することが可能である。
　また、上記の本発明のカビの検査方法において、少なくとも好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビからなる群から選択される２種類以上のカビを所定の一の培地で同時に培養し、この培養したカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出する方法とすることも好ましい。
　本発明のカビの検査方法をこのような方法にすれば、通常は個別に培養される、異なる湿度環境を要求するカビを所定の一の培地で同時に培養することができる。そして、これらの混合物からそれぞれのカビを特異的に検出することができる。このため、カビの性質等を考慮することなく、一括して同時に培養して検出を行うことができ、カビの検査の簡易化を図ることが可能となる。
　また、上記の本発明のカビの検査方法において、複数種類のカビを、水分活性値が１．０未満、０．９０以上で、且つ、糖濃度は、５～５０％、さらには、１０％～４０％とすることが好ましい。糖の種類として、具体的には、グルコース、シュークロースが好適に使用される。
　このような水分活性値、糖濃度の固形培地によれば、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビのいずれをも好適に培養することができ、あらゆるカビを一括して同時に培養し、その検出を行うことが可能となる。
　さらに、上記の本発明のカビの検査方法において、複数種類のカビを、２５℃±２℃の温度で培養する方法とすることも好ましい。
　このような温度範囲であれば、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビのいずれをも十分に繁殖させることが可能となる。
　また、上記の本発明のカビの検査方法において、培養した複数種類のカビを、カビの細胞壁を物理的に破砕するためのビーズを収容した容器に入れて混合し、一括してゲノムＤＮＡを抽出することも好ましい。
　本発明のカビの検査方法をこのような方法にすれば、同時に培養された複数種類のカビからまとめてゲノムＤＮＡを抽出することが可能となる。
　さらに、上記の本発明のカビの検査方法において、複数種類のカビが、大気中に浮遊もしくは付着したカビ胞子及び菌糸であることも好ましい。
　本発明のカビの検査方法をこのような方法にすれば、環境中におけるカビを採取して培養し、これらを簡易に同時に検出することが可能となる。
　本発明によれば、広範囲の種類のカビを精度高く検出することが可能となる。
　また、本発明によれば、複数種類のカビを同じ培地で同時に培養すると共に、これらを混合して一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップにより各カビを特異的に検出することが可能となる。
配列番号３と配列番号４からなるプライマーセットでＰＣＲ増幅したβ－チューブリン遺伝子内における種或いは属特異的領域及びカビ共通領域を示す図である。 本発明のカビの検出方法において用いるプライマーを示す図である。 本発明のカビの検出方法において用いるプローブを示す図である。 施設環境より採取したサンプルＡ～Ｈにそれぞれ含まれる菌種を示す図である。 同時反応系において、ＩＴＳ領域とβ-チューブリン遺伝子の両方を検出可能なプライマーセット濃度の範囲を探るための試験１の結果（サンプルＡ）を示す図である。 同時反応系において、ＩＴＳ領域とβ-チューブリン遺伝子の両方を検出可能なプライマーセット濃度の範囲を探るための試験１の結果（サンプルＢ）を示す図である。 同時反応系において、ＩＴＳ領域とβ-チューブリン遺伝子の両方を検出可能なプライマーセット濃度の範囲を探るための試験１の結果（サンプルＣ）を示す図である。 同時反応系において、ＩＴＳ領域とβ-チューブリン遺伝子の両方を検出可能なプライマーセット濃度の範囲を探るための試験１の結果（サンプルＤ）を示す図である。 試験１のサンプルＡについて、プライマーセット濃度比毎及びプローブ毎の蛍光強度を示す図である。 試験１のサンプルＢについて、プライマーセット濃度比毎及びプローブ毎の蛍光強度を示す図である。 試験１のサンプルＣについて、プライマーセット濃度比毎及びプローブ毎の蛍光強度を示す図である。 試験１のサンプルＤについて、プライマーセット濃度比毎及びプローブ毎の蛍光強度を示す図である。 ＤＮＡチップ解析における蛍光強度とＰＣＲによる増幅産物量の相関関係を確認するための試験２の結果を示す図である。 同時反応系において、ＩＴＳ領域とβ-チューブリン遺伝子の両方を検出可能なプライマーセット濃度の範囲を探るための試験３の結果を示す図である。 施設環境から採取したサンプルＡ～Ｈに含まれていなかった各種カビがマルチプレックスＰＣＲを用いたＤＮＡチップ解析で検出可能かどうかを確認するための試験４の結果を示す図である。 試験４のサンプルについて、プライマーセット濃度比毎及びプローブ毎の蛍光強度を示す図である。 クラドスポリウム属菌がマルチプレックスＰＣＲを用いたＤＮＡチップ解析で検出可能かどうかを確認するための試験５の結果を示す図である。 クラドスポリウム属菌特異的フォワードプライマーのＰＣＲ用反応液への添加が他の菌種の検出に与える影響を確認するための試験６の結果を示す図である。 各種培地組成による培養試験の培養評価を示す図である。 好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを、各種培地で培養したときのコロニーの直径を示す図である。 好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを、各種温度で培養したときのコロニーの直径を示す図である。 好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを、各種温度で培養したときのコロニーの写真を示す図である。 検体１－２０における菌種のＤＮＡチップ解析及び配列解析結果を示す図である。 検体２１－４０における菌種のＤＮＡチップ解析及び配列解析結果を示す図である。 検体４５－６０における菌種のＤＮＡチップ解析及び配列解析結果を示す図である。
　以下、本発明のカビの検出方法、ＰＣＲ用反応液、及びカビ検出用担体の一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の本実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
［カビの検出方法］
　本実施形態のカビの検出方法は、カビのＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させ、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、標的領域として、ＩＴＳ領域、及び、β－チューブリン遺伝子を用いることを特徴とする。
　カビの種類は、特に限定されるものではないが、例えばユーロチウム属菌（Eurotium　sp.），アスペルギルス　ペニシリオイデス種菌（Aspergillus　penicillioides），アスペルギルス　リストリクティ節菌（Aspergillus　Section　Restricti），ワレミア　セビ種菌（Wallemia　sebi），アスペルギルス　ヴィトリコラ種菌（Aspergillus　vitricola），ペニシリウム属菌（Penicillium　sp.），アスペルギルス　フミガティ節菌（Aspergillus　Section　Fumigati），アスペルギルス　フラヴィ節菌（Aspergillus　Section　Flavi），アスペルギルス　ニデュランテス節菌（Aspergillus　Section　Nidulantes），アスペルギルス　ニグリ節菌（Aspergillus　Section　Nigri），スタチボトリス　チャルタラム種菌（Stachybotrys　chartarum），フザリウム　ソラニ種菌（Fusarium　solani），クラドスポリウム属菌（Cladosporium　sp.）等のカビを、本発明のカビの検出方法、ＰＣＲ用反応液、及びカビ検出用担体による検出対象カビとすることができる。また、その他にもフザリウム　オキスポラム種菌（Fusarium　oxysporum），フザリウム　グラミニアラム種菌（Fusarium　graminiarum），フザリウム　バーティシリオイデス種菌（Fusarium　verticillioides），ピシウム　ウルティマム種菌（Pythium　ultimum），コレトトリカム　グロエオスポリオイデス種菌（Colletotrichum　gloeosporioides），コレトトリカム　アキュテイタム種菌（Colletotrichum　acutatum），バーティシリウム　ダリエ種菌（Verticillium　dahiae），バーティシリウム　アルボ　アトラム種菌（Verticillium　albo-atrum），アルタナリア　アルタナータ種菌（Alternaria　alternate），トリコフィトン　ルブラム種菌（Trichophyton　rubrum），トリコフィトン　トンズランス種菌（Trichophyton　tonsurans），トリコデルマ　ビリデ種菌（Trichoderma　viride）等のカビを、検出対象とすることができる。
　本実施形態のカビの検出方法における標的領域とは、カビのＤＮＡにおける増幅対象領域であり、特定のスペーサーや遺伝子などをそのような領域として用いることができる。本発明では、この標的領域として、ＩＴＳ（Internal　Transcribed　Spacer）領域とβ－チューブリン遺伝子の両方を同時に用いている。
　標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させる方法は、特に限定されないが、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を好適に用いることができる。
　ＰＣＲ法では、標的領域を増幅させるためのプライマーセットを含有するＰＣＲ反応液を用いて、カビのＤＮＡにおける特定領域を増幅する。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができ、例えば以下のような反応条件で、ＰＣＲを行うことができる。
（ａ）９５℃　１０分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程）　３０秒、（ｃ）５６℃（アニーリング工程）　３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程）　６０秒（（ｂ）～（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃　１０分
　増幅産物の有無を確認する方法としては、電気泳動による方法やＤＮＡチップを用いて検出する方法などを好適に用いることができる。
　電気泳動による方法は、例えばＭｕｌｔｉＮＡ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を用いて、マイクロキャピラリー電気泳動により、ＰＣＲの増幅産物を泳動させ、バンドの位置にもとづきその大きさを確認することで、正しい増幅産物が得られているか否かを判定することができる。
　ＤＮＡチップによる方法は、標的領域に特異的にハイブリダイズするプローブを予めＤＮＡチップに固定化し、このＤＮＡチップにＰＣＲの増幅産物を滴下して、増幅産物の標識を検出することなどにより、正しい増幅産物が得られているか否かを判定することができる。標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴを用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。
また、標識は蛍光に限定されず、その他のものを用いても良い。
　本実施形態では、プライマーとして、カビのＤＮＡにおけるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットと、β－チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを使用する。
　ＩＴＳ領域は、ＲＮＡに転写後にスプライシングされる部分である。このため、コーディング領域に比べると保存性が低く、変化に富んでいるが、カビ種間の類似性が高く、偽陽性反応が生じる場合が比較的多い。このため、ＤＮＡチップに数多くの種類のカビのプローブを固定化してカビの識別に用いる場合には、そのプローブとしてＩＴＳ領域から選択されたもののみを使用すると、検出精度の低下を招くおそれがある。
　一方、複数種類のカビにおけるβ－チューブリン遺伝子の類似性を検証すると、図１に示すように、カビ種毎にユニークな配列が比較的多く存在しており、これらの領域は特異性の高いプローブ設計に最適であると考えられる。
　そこで、ＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子の両方を標的領域として用いて、広範囲の種類のカビを対象として検証したところ、これらの領域を組み合わせて用いることにより、偽陽性反応を適切に低減できることが明らかとなった。
　本実施形態のカビの検出方法では、このように標的領域として、ＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子の両方を用いることで、広範囲の種類のカビを精度高く検出することを可能としている。
［ＰＣＲ用反応液］
　本実施形態のＰＣＲ用反応液は、上述したカビの検出方法において、標的領域を含むＤＮＡ断片の増幅をＰＣＲ法により行う場合に使用される。このＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP））、プライマーセット、核酸合成酵素（Ｎｏｖａ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、標識成分（Ｃｙ５－ｄＣＴＰなど）、試料のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの容量分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することが可能である。なお、緩衝液としては、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を用いることができる。
　本実施形態のＰＣＲ用反応液におけるプライマーセットとしては、カビのＤＮＡにおけるＩＴＳ領域を増幅させることが可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーとからなるプライマーセット、及び、カビのＤＮＡにおけるβ－チューブリン遺伝子を増幅させることが可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーとからなるプライマーセットが用いられる。
　本実施形態のＰＣＲ用反応液におけるプライマーセットは、このようにＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとβ－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとを有するものであれば特に限定されないが、具体的には例えば以下のものを用いることができる。すなわち、図２に示すように、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとして、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを好適に用いることができる。また、β－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとして、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを好適に用いることができる。
　また、β－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの濃度比を、１：０．９～１：０．１とすることが好ましい。プライマーセットの濃度比をこのようにすれば、これらの増幅対象領域を共に好適に増幅できるためである。
　ここで、カビのＤＮＡにおいて、ＩＴＳ領域は１００コピー以上存在しているのに対し、β－チューブリン遺伝子は１コピーしか存在していない。また、前者のＰＣＲ法による増幅産物のサイズは約２５０ｂｐであるのに対し、後者のＰＣＲ法による増幅産物のサイズは３５０～５５０ｂｐである。
　したがって、β－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの濃度をＰＣＲ用反応液において同じにすると、β－チューブリン遺伝子の増幅産物が十分に得られず、検出精度が低くなるという問題があった。
　これに対して、ＰＣＲ用反応液におけるＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの濃度を下げすぎると、今度はＩＴＳ領域の増幅効率が低くなってしまう。
　このため、β－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの濃度比として、最適な条件を探す必要があった。
　そこで、本発明者らは種々の濃度比を検証することで、上記の濃度比であれば、ＩＴＳ領域及びβ－チューブリン遺伝子の両方を好適に増幅できることを見いだした。特に、β－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの濃度比を１：０．５～１：０．２５とすれば、増幅産物を蛍光標識して蛍光強度にもとづきカビの検出を行う場合、ＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子の蛍光が共に大きな強度で得られるため、より好ましい。
　さらに、本実施形態のＰＣＲ用反応液に、クラドスポリウム属菌を特異的に増幅させるためのプライマーを含ませることが好ましい。このようなプライマーとしては、例えば図２の配列番号５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーを用いることができる。
　ここで、上述したＩＴＳ領域増幅用プライマーセット及びβ－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットを用いた場合、クラドスポリウム属菌のβ－チューブリン遺伝子については、ＰＣＲにより増幅産物は得られるものの、β－チューブリン遺伝子に相補的な配列から選択されたプローブと当該増幅産物とによるハイブリダイゼーションは十分に行われず、クラドスポリウム属菌は適切に検出することができなかった。
　そこで、クラドスポリウム属菌については、これを特異的に増幅可能なフォワードプライマーをＰＣＲ用反応液に追加してＰＣＲを行い、新たな増幅産物を得た。そして、実施例において後述するように、この新たな増幅産物を本実施形態のカビ検出用担体に滴下して検査したところ、当該菌種を適切に検出することができた。
　すなわち、このクラドスポリウム属菌を特異的に増幅させるためのフォワードプライマーは、β－チューブリン遺伝子を増幅するためのものであり、配列番号４に示されるリバースプライマーと対になって、クラドスポリウム属菌のβ－チューブリン遺伝子を増幅させることができる。
　ＰＣＲ用反応液におけるクラドスポリウム属菌特異的フォワードプライマーの終濃度は、０．５μＭ以下とすることが好ましく、０．１２５μＭ～０．５μＭとすることがより好ましい。クラドスポリウム属菌特異的フォワードプライマーの終濃度の範囲をこのようにすれば、クラドスポリウム属菌を好適に検出することが可能なためである。
　また、ＰＣＲ用反応液におけるクラドスポリウム属菌特異的フォワードプライマーの終濃度を０．２５μＭ～０．５μＭにすれば、クラドスポリウム属菌を一層好適に検出することが可能である。特に、この終濃度を０．２５μＭにすれば、他の菌種の検出に与える影響をほぼ最小にできるため、さらに好ましい。
　上記プライマーセットにおける各プライマーの配列は、上記の塩基配列そのものに限定されず、同一の機能を果たす範囲で適宜変更したものを用いることが可能である。すなわち、それぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたものとすることができる。また、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なものとすることもできる。
　ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、上記プライマーセットに対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、上記プライマーセットと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃～約３０℃、好ましくは約１０℃～約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
［カビ検出用担体］
　本実施形態のカビ検出用担体は、一又は二以上のカビの種類毎に、ＩＴＳ領域から選択された塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された塩基配列を有するプローブを固定化したことを特徴とし、ＤＮＡチップなどを用いて構成することができる。
　このように、カビの種類毎にＩＴＳ領域の増幅産物と結合するプローブと、β－チューブリン遺伝子の増幅産物と結合するプローブの両方を備えたものとし、これら両方のプローブにおいて蛍光が検出されるカビを陽性と判定することで、偽陽性反応にもとづく判定の誤りを適切に排除することが可能となっている。
　具体的には、例えば図３に示すように、カビの種類毎に、以下のプローブを用いることができる。
　すなわち、ユーロチウム属菌（Eurotium　sp.）を検出するためのプローブとして、ＩＴＳ領域から選択された配列番号６又は７に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
　また、アスペルギルス　ペニシリオイデス種菌（Aspergillus　penicillioides）を検出するためのプローブとして、ＩＴＳ領域から選択された配列番号９～１１に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号１２に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
　また、アスペルギルス　ヴィトリコラ種菌（Aspergillus　vitricola）を検出するためのプローブとして、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１３又は１４に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号１５に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
　また、アスペルギルス　リストリクティ節菌（Aspergillus　Section　Restricti）を検出するためのプローブとして、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１６～２０に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号２１に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
　また、アスペルギルス　ニデュランテス節菌（Aspergillus　Section　Nidulantes）を検出するためのプローブとして、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２２に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号２３に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
　また、アスペルギルス　フミガティ節菌（Aspergillus　Section　Fumigati）を検出するためのプローブとして、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２４に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号２５に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
　また、アスペルギルス　フラヴィ節菌（Aspergillus　Section　Flavi）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２６に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号２７に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
　また、ペニシリウム属菌（Penicillium　sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２８又は２９に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号３０～３２に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかを用いることができる。
　また、スタチボトリス　チャルタラム種菌（Stachybotrys　chartarum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３３に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号３４に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
　また、フザリウム　ソラニ種菌（Fusarium　solani）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３５に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号３６に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
　また、クラドスポリウム属菌（Cladosporium　sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３７に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号３８又は３９に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかを用いることができる。
　また、カビ共通のプローブとして、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号４１に示す塩基配列を有するプローブを用いることができる。
　そして、本実施形態のカビ検出用担体は、上記の各カビを検出するための各プローブ群を、それぞれ一又は二群以上固定化したものとすることができる。
　このように、本実施形態のカビ検出用担体は、各カビのＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子の増幅産物にそれぞれ結合するプローブを固定化することで、偽陽性反応にもとづく判定ミスを低下させ、広範囲のカビを高い精度で検出することが可能になっている。
　本実施形態のカビ検出用担体は、通常の方法で使用することができ、その方法は特に限定されるものではないが、例えば以下のように使用することができる。
　まず、本実施形態のカビの検出方法により得られたＰＣＲの増幅産物に、緩衝液（３×ＳＳＣ　クエン酸－生理食塩水）に０．３％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を添加したものを混合して、本実施形態のカビ検出用担体に滴下する。
　このカビ検出用担体を４５℃で１時間静置した後、ハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物を上記緩衝液を用いてカビ検出用担体から洗い流す。そして、これを標識検出装置にかけて蛍光強度を測定することで、カビの検出を行うことが可能である。
　なお、本実施形態のカビ検出用担体に固定化する上記各プローブは、上述したプライマーセットにおける各プライマーの配列の場合と同様に、同一の機能を果たす範囲で適宜変更したものを用いることが可能である。すなわち、それぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたものとすることができる。また、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なものとすることもできる。
　さらに、本実施形態のカビ検出用担体に固定化するプローブとして、上記各プローブや、それぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたもの、又は、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるものに対して、相補的な塩基配列を有するプローブを用いることもできる。
　ここで、本実施形態のカビの検出方法におけるＰＣＲ法により得られる増幅産物には、上記のプローブとハイブリダイズする核酸断片に対して相補的な塩基配列を有する核酸断片も含まれる。このため、図３に示す配列番号６～４１に対して相補的な塩基配列、及びこれらと同等の塩基配列からなるプローブは、上記のプローブとハイブリダイズする核酸断片に対して相補的な塩基配列を有する核酸断片とハイブリダイズすることができる。
　したがって、図３に示す配列番号６～４１に対して相補的な塩基配列、及びこれらと同等の塩基配列からなるプローブ、すなわち配列番号６～４１のそれぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたもの、又は、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるものを、本実施形態のカビ検出用担体に固定化した場合にも、それぞれの対象とするカビを検出することが可能である。
　次に、本発明のカビの検査方法の一実施形態について詳細に説明する。なお、本実施形態のカビの検査方法は、複数種類のカビを培養し、培養された複数種類のカビを混合して、一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いて複数種類のカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出するものであれば良く、以下の実施形態及び実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
　本実施形態のカビの検査方法は、以下の工程を含むものとすることができる。
（１）カビの採取
　まず、エアーサンプラーを用いて、食品製造現場や臨床現場、文化財の保護環境等における空気を採取する。次いで、採取した空気をエアーサンプラー用にストリップ形状にした専用培地などに吹き付けて培養する。
　その培地としては、実施例において後述するように、好乾性、耐乾性、及び好湿性のいずれのカビでも培養することができるＭ４０Ｙ、ＭＹ１０Ｇ培地、ＭＹ３０Ｇ培地等を用いることが好ましい。このうち、Ｍ４０Ｙ培地を用いると、上記のいずれの性質のカビでも高効率に培養することが可能であるため、特に好ましい。
　また、培養条件としては、２３℃～２７℃の温度の暗所に、２日～７日程度静置させることが好ましい。
　なお、一般的にＭ４０Ｙ培地、ＭＹ１０Ｇ培地、及びＭＹ３０Ｇ培地は、好乾性カビ用のものと考えられており、好湿性カビ培養には適さないと考えられてきた。
　次に、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーを、個別に分離することなく、一括して採取する。そして、採取された試料を、例えば、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶などに入れ、バイアル瓶ごと液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置等を用いて、カビの細胞を破砕する。なお、細胞の破壊は、ＤＮＡが抽出できるように行われれば良く、その他の方法により行ってもかまわない。
（２）ＤＮＡの抽出
　カビの細胞を破壊した試料から、ゲノムＤＮＡを抽出する方法としては、ＣＴＡＢ法（Cetyl　trimethyl　ammonium　bromide）やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法を用いることができる。
（３）ＰＣＲ法によるＩＴＳ領域の増幅
　次に、各種カビのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域を増幅することができるプライマーセットをＰＣＲ反応液に加えて、ＰＣＲ法により、上記試料中のカビのゲノムＤＮＡにおける特定領域を増幅する。具体的には、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして、それぞれ配列番号４２，４３に示される塩基配列のものを用いることができる。また、ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
　本実施形態のＰＣＲ反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP）、プライマーセット、核酸合成酵素（Ｎｏｖａ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、標識成分（Ｃｙ５－ｄＣＴＰなど）、試料のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの容量分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することが可能である。なお、緩衝液としては、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所）を用いることができる。
　本実施形態のカビの検査方法におけるＰＣＲ反応条件としては、例えば以下のようにすることが好ましい。
（ａ）９５℃　１０分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程）　３０秒、（ｃ）５６℃（アニーリング工程）　３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程）　６０秒（（ｂ）～（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃　１０分
（４）ＤＮＡチップによる検出
　本実施形態のＤＮＡチップは、検出対象のカビのＤＮＡから選択されたプローブを固定化したものであれば良く、その他の点では特に限定されない。例えばスポット型ＤＮＡチップ、合成型ＤＮＡチップなどを用いることが可能である。
　具体的には、本実施形態のカビの検査方法のＰＣＲ反応液に含まれるプライマーセットにより増幅される増幅領域と結合するプローブを予め合成し、ＤＮＡチップの基板上に固定化しておく。例えば、アスペルギルス　ヴィトリコラ（Aspergillus　vitricola）検出用のプローブとしては、配列番号４４に示される塩基配列からなるものを用いることができる。また、アスペルギルス　ペニシリオイデス（Aspergillus　penicillioides）検出用のプローブとしては、配列番号４５に示される塩基配列からなるものを用いることができる。さらに、ユーロチウム属菌（Eurotium　sp.）検出用のプローブとしては、配列番号４６に示される塩基配列からなるものを用いることができる。
　次に、ＰＣＲ増幅産物をＤＮＡチップ上に滴下して、上記カビ検出用プローブにハイブリダイズしたＰＣＲ増幅産物の標識を検出する。具体的には、例えば次のように行うことができる。
　まず、ＰＣＲ増幅産物に所定の緩衝液を混合して、ＤＮＡチップに滴下する。
　次に、ＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、その後、所定の緩衝液によりハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流す。
　そして、ＤＮＡチップを標識検出装置にかけて標識の検出を行い、検出対象カビが存在するか否かを判定する。なお、標識検出装置としては、例えば、蛍光スキャニング装置など一般的なものを用いることができる。なお、標識及びその検出方法は蛍光に限定されず、その他の方法を用いても良い。
　以上説明したように、本実施形態のカビの検査方法によれば、好乾性、耐乾性、及び好湿性のいずれのカビでも培養することができる培地を用いて、複数のカビを同時に培養することができる。そして、培養されたカビを混合して一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いて複数種類のカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出することができる。
　このため、採取されたカビを分離培養する必要がなく、複数種類のカビを迅速に一括して簡易に検出することが可能である。
　以下、本発明のカビの検出方法、ＰＣＲ用反応液、及びカビ検出用担体を用いて行った試験について、具体的に説明する。
（試験１）
　本発明のカビの検出方法において、マルチプレックスＰＣＲを用いたＤＮＡチップ解析により各種カビを検出するにあたり、ＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子の両方を同時に増幅することを可能にする、ＰＣＲ用反応液における各プライマーセットの濃度範囲を探るため、試験１を行った。
　検出対象カビは、施設環境から採取した野生カビを使用した。すなわち、エアーサンプラーを用いて施設環境内の空気を採取し、これをサンプルＡ～Ｄの各培地に吹き付けて培養した。培養は、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。
　次に、サンプルごとに、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーの一部を個別に採取し、それぞれ２５℃の暗所で７～１０日間分離培養を行い、各コロニーをＤＮＡ配列解析に供して、その菌種を確認した。その結果を図４に示す。なお、ＤＮＡ配列解析は、タカラバイオ株式会社に委託して、ＤＮＡシーケンサーにより行った。以下においても同様である。
　さらに、サンプルごとに、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーを一括して採取して、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて、カビの細胞を破砕した。
　次いで、サンプルごとに、ＤＮＡ抽出装置によりカビのゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子とを同時に増幅した。
　このとき、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとして、図２に示す配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマー（Ｆプライマー）及び配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー（Ｒプライマー）を用いた。また、β－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとして、図２に示す配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。なお、いずれもオペロンテクノロジー株式会社により合成したものを使用した。
　また、ＰＣＲ用反応液として、サンプルＡ～Ｄのそれぞれについて、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ampdirect(G/Crich)　4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)　4.0μl
３．dNTPmix　1.0μl
４．Cy-5dCTP　0.2μl
５．ITS1-Fw　primer(10μM)　1.0μl
６．ITS1-Rv　primer(10μM)　1.0μl
７．BtF　primer(10μM)　1.0μl
８．BtR　primer(10μM)　1.0μl
９．Template　DNA（サンプルＡ～Ｄ毎にそれぞれ）　1.0μl
１０．NovaTaq　polymerase　0.2μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
　さらに、ＩＴＳ領域増幅用プライマーとして、フォワードプライマー及びリバースプライマーのそれぞれが次の割合で配合され、その他の点は上記と同様の４通りのＰＣＲ用反応液を作成した。
primer(9μM)　0.9μl
primer(8μM)　0.8μl
primer(5μM)　0.5μl
primer(2.5μM)　0.25μl
primer(1.25μM)　0.125μl
primer(1μM)　0.1μl
primer(0.625μM)　0.0625μl
　以上の通り、β－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの終濃度比として、サンプルＡ～Ｄごとに、以下の５種類のものを作成し、それぞれについて試験を行った。
（i）０．５μＭ：０．５μＭ
（ii）０．５μＭ：０．４５μＭ
（iii）０．５μＭ：０．４０μＭ
（iv）０．５μＭ：０．２５μＭ
（v）０．５μＭ：０．１２５μＭ
（vi）０．５μＭ：０．０６２５μＭ
（vii）０．５μＭ：０．０５０μＭ
（viii）０．５μＭ：０．０３１２５μＭ
　上記各ＰＣＲ用反応液を使用して核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（Ｒ）　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃　１０分
（b）９５℃　３０秒
（c）５６℃　３０秒
（d）７２℃　６０秒（（b）～（d）を４０サイクル）
（e）７２℃　１０分
　ＤＮＡチップには、ジーンシリコン（Ｒ）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、図３に示されるプローブのうち、以下のプローブを固定化したものを使用した。
＜ＩＴＳ領域から選択されたプローブ＞
（１）ユーロチウム属菌　配列番号６，７
（２）アスペルギルス　ペニシリオイデス種菌　配列番号９～１１
（３）アスペルギルス　ヴィトリコラ種菌　配列番号１３
（４）アスペルギルス　リストリクティ節菌　配列番号１６～２０
（５）アスペルギルス　ニデュランテス節菌　配列番号２２
（７）アスペルギルス　フラヴィ節菌　配列番号２６
（８）ペニシリウム属菌　配列番号２８
（１１）クラドスポリウム属菌　配列番号３７
（１２）カビ共通　配列番号４０
＜β－チューブリン遺伝子から選択されたプローブ＞
（１）ユーロチウム属菌　配列番号８
（２）アスペルギルス　ペニシリオイデス種菌　配列番号１２
（３）アスペルギルス　ヴィトリコラ種菌　配列番号１５
（４）アスペルギルス　リストリクティ節菌　配列番号２１
（５）アスペルギルス　ニデュランテス節菌　配列番号２３
（７）アスペルギルス　フラヴィ節菌　配列番号２７
（８）ペニシリウム属菌　配列番号３０
（１２）カビ共通　配列番号４１
　次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸－生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、上記ＤＮＡチップに滴下した。
　このＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。
　次いで、ＤＮＡチップを標識検出装置（GenePix4100A　Molecular　Devices社製）にかけて、各プローブにおける蛍光強度を測定し、プライマーセットの濃度比毎にＩＴＳ領域用プローブにおける蛍光強度、及びβ－チューブリン遺伝子用プローブにおける蛍光強度の平均値を算出した。その結果を図５～図８に示す。図５はサンプルＡ、図６はサンプルＢ、図７はサンプルＣ、図８はサンプルＤを用いた場合の、プライマーセットの各種濃度比についての蛍光強度を示している。
　また、図９～図１２は、それぞれサンプルＡ～Ｄを用いた場合のプライマーセットの各種濃度比についてのプローブ毎の蛍光強度を示している。なお、図５～図８における「Ｎ」は、図９～図１２におけるプローブ数をそれぞれ示している。図１５においても同様である。
（試験２）
　ＤＮＡチップ解析における蛍光強度と、ＰＣＲによる増幅産物量との相関関係を確認するために試験２を行った。
　具体的には、試験１のサンプルＢ，Ｃのそれぞれについて、β－チューブリン遺伝子用プライマーセットの終濃度とＩＴＳ領域用プライマーセットの終濃度の比が、以下のような５種類のＰＣＲ用反応液を用いて、試験１と同様にＰＣＲを行った。
（レーン１）０．５μＭ：０．５μＭ
（レーン２）０．５μＭ：０．２５μＭ
（レーン３）０．５μＭ：０．１２５μＭ
（レーン４）０．５μＭ：０．０６２５μＭ
（レーン５）０．５μＭ：０．０３１２５μＭ
　そして、得られた増幅産物を、ＭｕｌｔｉＮＡ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を用いて解析した。その結果を図１３に示す。
　同図に示されるように、サンプルＢにおいて、β－チューブリン遺伝子については、レーン１のバンドが薄く、レーン２バンドがやや濃く、レーン３～５のバンドが濃く表示されている。また、ＩＴＳ領域については、レーン１，２のバンドが濃く、レーン３バンドがやや濃く、レーン４，５のバンドが薄く表示されている。この結果は、図６に示されるサンプルＢのＤＮＡチップ解析における蛍光強度と対応している。
　また、サンプルＣにおいて、β－チューブリン遺伝子については、レーン１，２のバンドが薄く、レーン３～５のバンドが相対的に濃く表示されている。また、ＩＴＳ領域については、レーン１～３のバンドが濃く、レーン４，５のバンドが薄く表示されている。この結果は、図７に示されるサンプルＣのＤＮＡチップ解析における蛍光強度と対応している。
　以上のことから、ＤＮＡチップ解析における蛍光強度と、ＰＣＲによる増幅産物量との間には、相関関係があることが確認された。
（試験３）
　ＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子の両方を同時に検出可能なプライマーセット濃度を確認するため、試験１と別個のサンプルを用いて、同様の試験を再度行った。
　検出対象カビは、試験１と同様に、施設環境から採取した野生カビをサンプルＥ～Ｈの各培地に吹き付けて培養したものを使用した。このサンプルＥ～Ｈの培地に生じた各種カビのコロニーを分離培養し、各コロニーをＤＮＡ配列解析に供して、その菌種を確認した。その結果を図４に示す。
　そして、サンプルごとに、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーを一括して採取し、カビの細胞を破砕してゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により各カビのＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子とを増幅した。
　このとき、プライマーには試験１と同様に、図２に示す配列番号１及び配列番号２の塩基配列からなるＩＴＳ領域増幅用プライマーセットと、配列番号３及び配列番号４の塩基配列からなるβ－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットを用いた。
　また、ＰＣＲ用反応液として、サンプルＥ～Ｈのそれぞれについて、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ampdirect(G/Crich)　4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)　4.0μl
３．dNTPmix　1.0μl
４．Cy-5dCTP　0.2μl
５．ITS1-Fw　primer(5μM)　0.5μl
６．ITS1-Rv　primer(5μM)　0.5μl
７．BtF　primer(10μM)　1.0μl
８．BtR　primer(10μM)　1.0μl
９．Template　DNA（サンプルＥ～Ｈ毎にそれぞれ）　1.0μl
１０．NovaTaq　polymerase　0.2μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
　また、ＰＣＲ用反応液として、サンプルＥ～Ｈのそれぞれについて、ＩＴＳ領域増幅用プライマーを次のようにし、その他の組成は上記と同じのものを２０μｌ作成した。
ITS1-Fw　primer(2.5μM)　2.5μM
ITS1-Rv　primer(2.5μM)　2.5μM
　このように、β－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの終濃度比として、サンプル毎に、０．５μＭ：０．２５μＭと、０．５μＭ：０．１２５μＭの２通りのＰＣＲ用反応液を作成し、それぞれについて試験を行った。ＰＣＲの反応条件は、試験１と同様である。
　また、ＤＮＡチップには、図３に示されるプローブのうち、以下のプローブを固定化したものを使用した。その他の点については、試験１と同様にして、プローブにおける蛍光強度を測定し、プライマーセットの濃度比毎に、ＩＴＳ領域用プローブにおける蛍光強度、及びβ－チューブリン遺伝子用プローブにおける蛍光強度の平均値を算出した。その結果を図１４に示す。なお、同図における「Ｎ」は、プローブ数×３回（試験回数）をそれぞれ示している。
＜ＩＴＳ領域から選択されたプローブ＞
（１）ユーロチウム属菌　配列番号６
（２）アスペルギルス　ペニシリオイデス種菌　配列番号９
（８）ペニシリウム属菌　配列番号２９
（１１）クラドスポリウム属菌　配列番号３７
（１２）カビ共通　配列番号４０
＜β－チューブリン遺伝子から選択されたプローブ＞
（１）ユーロチウム属菌　配列番号８
（２）アスペルギルス　ペニシリオイデス種菌　配列番号１２
（４）アスペルギルス　リストリクティ節菌　配列番号２１
（１２）カビ共通　配列番号４１
　図１４におけるサンプルＥ～Ｈを参照すると、β－チューブリン遺伝子用プライマーセットの終濃度とＩＴＳ領域用プライマーセットの終濃度の比が、０．５μＭ：０．２５μＭ（１：１／２）の場合よりも０．５μＭ：０．１２５μＭ（１：１／４）の場合の方が、ＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子の両方のプローブの蛍光強度が共に大きくなっている。
　したがって、これら両方の検出結果にもとづいてカビの存否を判定するためには、β－チューブリン遺伝子用プライマーセット終濃度とＩＴＳ領域用プライマーセット終濃度の比を０．５μＭ：０．１２５μＭとすることが最適であると考えられる。
（試験４）
　施設環境から採取したサンプルＡ～Ｈに含まれる野生カビではない各種カビを対象とした場合にも、本発明のＩＴＳ領域及びβ－チューブリン遺伝子を標的領域とするカビの検出方法により検出できるかを検証した。
　検出対象カビとしては、以下の４種類の菌株１～４を混合して使用した。
１．アスペルギルス　フミガタス（Aspergillus　fumigatus）菌株No.JCM10253
２．フザリウム　ソラニ（Fusarium　solani）菌株No.NBRC5232
３．スタキボトリス　チャータラム（Stachybotrys　chartarum）菌株No.NBRC5369
４．クラドスポリウム　スフェロスパーマム（Cladsoporium　sphaerospermum）菌株No.JCM11787
　なお、上記菌株は、以下の機関から入手したものである。
　JCM：独立行政法人理化学研究所　バイオリソースセンター　微生物材料開発室（Japan　Collection　of　Microorganisms）
　NBRC：独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジー本部　生物遺伝資源部門（NITE　Biological　Resource　Center）
　これらの菌株を培地に植えて、２５℃の暗所で７日間静置させて培養した後、各菌株のカビのコロニーを一括して採取し、試験１と同様にカビのゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子とを同時増幅した。
　このとき、試験３と同様に、β－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの終濃度比として、０．５μＭ：０．２５μＭと、０．５μＭ：０．１２５μＭの２通りのＰＣＲ用反応液を作成した。また、各ＰＣＲ用反応液において、試料のＤＮＡは、菌株１～４をそれぞれ１．０μｌずつ合計４．０μｌ含有させた。そして、それぞれのＰＣＲ用反応液により各カビのＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子とを増幅した。
　また、ＤＮＡチップには、図３に示されるプローブのうち、以下のプローブを固定化したものを使用した。
　そして、ＰＣＲによる増幅産物をプローブにハイブリダイズさせ、プローブにおける蛍光強度を測定し、プライマーセットの濃度比毎に、ＩＴＳ領域用プローブにおける蛍光強度、及びβ－チューブリン遺伝子用プローブにおける蛍光強度の平均値を算出した。その他の点については、試験１と同様にして行った。その結果を図１５に示す。また、図１６に、プライマーセットの濃度比毎及びプローブ毎の蛍光強度を示す。
＜ＩＴＳ領域から選択されたプローブ＞
（６）アスペルギルス　フミガティ節菌　配列番号２４
（９）スタキボトリス　チャータラム種菌　配列番号３３
（１０）フザリウム　ソラニ種菌　配列番号３５
（１１）クラドスポリウム属菌　配列番号３７
（１２）カビ共通　配列番号４０
＜β－チューブリン遺伝子から選択されたプローブ＞
（６）アスペルギルス　フミガティ節菌　配列番号２５
（９）スタキボトリス　チャータラム種菌　配列番号３４
（１０）フザリウム　ソラニ種菌　配列番号３６
（１２）カビ共通　配列番号４１
　図１５を参照すると、β－チューブリン遺伝子用プライマーセットの濃度とＩＴＳ領域用プライマーセットの終濃度の比が、０．５μＭ：０．２５μＭ（１：１／２）及び０．５μＭ：０．１２５μＭ（１：１／４）のいずれの場合についても、ＩＴＳ領域用プローブとβ－チューブリン遺伝子用プローブの両方における蛍光強度が、検出に十分な値を示している。
　したがって、上記４種類の菌株１～４についても、本発明のＩＴＳ領域及びβ－チューブリン遺伝子を標的領域とするカビの検出方法により検出できることが確認された。
　なお、クラドスポリウム　スフェロスパーマムについては、β－チューブリン遺伝子用プローブにおいて蛍光が検出できなかった。そこで、クラドスポリウム属菌の検出を可能にする方法を検討し、以下の試験５，６を行った。
（試験５）
　試験４では、上記の通り、β－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセット（配列番号３，４）を用いた場合に、クラドスポリウム　スフェロスパーマムについては、β－チューブリン遺伝子用プローブにおいて蛍光が検出されなかった。
　また、試験４において、ＤＮＡチップにはβ－チューブリン遺伝子に相補的に結合し得るプローブが固定化されており、当該プローブにおいて蛍光が検出されなかった理由は明らかではない。
　そこで、クラドスポリウム属菌専用の新たなβ－チューブリン遺伝子増幅用フォワードプライマー（配列番号５）を設計し、このプライマーと上記のリバースプライマー（配列番号４）からなるプライマーセットを用いて、クラドスポリウム　スフェロスパーマムのβ－チューブリン遺伝子を増幅し、β－チューブリン遺伝子用プローブにおいて蛍光が検出されるか否かを確認するための試験を行った。
　検出対象カビとしては、試験４と同じ４種類の菌株１～４を混合して使用した。
　また、ＰＣＲ用反応液としては、β－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの終濃度比が、０．５μＭ：０．２５μＭと０．５μＭ：０．１２５μＭのものを作成し、かつそれぞれについてクラドスポリウム属菌専用のβ－チューブリン遺伝子増幅用フォワードプライマーが終濃度として０μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭ、０．１２５μＭとなるように添加した８通りのＰＣＲ用反応液を作成した。
　具体的には、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用して、次の組成のものを２０μｌ作成し、試験１と同様にして、各カビのＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子とを増幅した。
１．Ampdirect(G/Crich)　4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)　4.0μl
３．dNTPmix　1.0μl
４．Cy-5dCTP　0.2μl
５．ITS1-Fw　primer(5μM,2.5μM)　0.5μl,0.25μl
６．ITS1-Rv　primer(5μM,2.5μM)　0.5μl,0.25μl
７．BtF　primer(10μM)　1.0μl
８．BtR　primer(10μM)　1.0μl
９．ClaS-beta2(0μM,10μM,5μM,2.5μM)　0μl,1.0μl,0.5μl,0.25μl
１０．Template　DNA（菌株１～４各々1.0μl）　4.0μl
１１．NovaTaq　polymerase　0.2μl
１２．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
　ＤＮＡチップには、図３に示されるプローブのうち、クラドスポリウム　スフェロスパーマム特異的プローブ（配列番号３９）のみを固定化したものを使用した。そして、その他の点については、試験１と同様にして、ＰＣＲによる増幅産物をプローブにハイブリダイズさせ、当該プローブにおける蛍光強度を測定した。その結果を図１７に示す。
　図１７に示される通り、β－チューブリン遺伝子用プライマーセットの濃度とＩＴＳ領域用プライマーセットの終濃度の比が、０．５μＭ：０．２５μＭ（１：１／２）～０．５μＭ：０．１２５μＭ（１：１／４）の場合であって、かつ特にクラドスポリウム属菌専用フォワードプライマーの終濃度を０．５μＭ～０．２５μＭとした場合に、クラドスポリウム属菌について高い蛍光強度が得られることがわかった。
（試験６）
　試験５で用いたクラドスポリウム属菌専用フォワードプライマー（配列番号５）が、クラドスポリウム　スフェロスパーマム特異的プローブ（配列番号３９）以外のプローブにおける蛍光強度に与える影響について検証した。
　検出対象カビとしては、試験４と同じ４種類の菌株１～４を混合して使用した。
　また、ＰＣＲ用反応液としては、β－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとＩＴＳ領域増幅用プライマーセットの終濃度比を０．５μＭ：０．１２５μＭとし、かつクラドスポリウム属菌専用のβ－チューブリン遺伝子増幅用フォワードプライマーを終濃度が０μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭとなるように添加した３通りのＰＣＲ用反応液を作成した。
　具体的には、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のものを２０μｌ作成し、試験１と同様にして、各カビのＩＴＳ領域とβ－チューブリン遺伝子とを増幅した。
１．Ampdirect(G/Crich)　4.0μl
２．Ampdirect(addition-4)　4.0μl
３．dNTPmix　1.0μl
４．Cy-5dCTP　0.2μl
５．ITS1-Fw　primer(2.5μM)　0.25μl
６．ITS1-Rv　primer(2.5μM)　0.25μl
７．BtF　primer(10μM)　1.0μl
８．BtR　primer(10μM)　1.0μl
９．ClaS-beta2(0μM,10μM,5μM)　0μl,1.0μl,0.5μl
１０．Template　DNA（菌株１～４各々1.0μl）　4.0μl
１１．NovaTaq　polymerase　0.2μl
１２．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
　また、ＤＮＡチップには、図３に示されるプローブのうち、試験４と同じ菌株１～４のプローブを固定化したものを使用した。その他の点については、試験１と同様にして、ＰＣＲによる増幅産物をプローブにハイブリダイズさせた。
　そして、各プローブにおける蛍光強度を測定し、クラドスポリウム属菌専用のβ－チューブリン遺伝子増幅用フォワードプライマーの濃度毎に、ＩＴＳ領域用プローブにおける蛍光強度、及びβ－チューブリン遺伝子用プローブにおける蛍光強度の平均値を算出した。その結果を図１８に示す。
　図１８に示されるように、クラドスポリウム属菌専用β－チューブリン遺伝子増幅用フォワードプライマーをマルチプレックスＰＣＲ用反応液に加えることによって、クラドスポリウム　スフェロスパーマム特異的プローブ以外のβ－チューブリンから選択されたプローブにおける蛍光強度は低下している。その蛍光強度の低下の程度は、クラドスポリウム属菌専用β－チューブリン遺伝子増幅用フォワードプライマーの濃度が０．５μＭのものよりも０．２５μＭのものの方が軽微である。したがって、クラドスポリウム属菌専用β－チューブリン遺伝子増幅用フォワードプライマーの濃度は、０．２５μＭの方が適切であることが明らかとなった。
　次に、本発明のカビの検査方法によるカビ検出の試験結果について、具体的に説明する。
（試験７：各種培地組成の水分活性値による培養試験）
　ＰＤＡ（Ｐｏｔａｔｏ　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　Ａｇａｒ）培地とＭＹ（Ｍａｌｔ＋Ｙｅａｓｔ）培地に糖などを添加して種々の水分活性値を示す培地組成からなる各種培地を作製し、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを培養して、それぞれの培養結果を評価した。
１．培地の作製方法
（１）ＰＤＡ培地
　ＰＤＡ（ＤＩＦＣＯ社製）に、グルコース（和光純薬工業株式会社）、及び／又は、シュークロース（和光純薬工業株式会社）を各種割合で添加し、１Ｌのイオン交換水に懸濁してオートクレーブで融解後、シャーレに分注して作製した。なお、シャーレ分注前に、細菌増殖を防止する目的で、クロラムフェニコール（和光純薬工業株式会社）を最終濃度５０ｐｐｍとなるように加えた。ＭＹ培地についても同様である。
（２）ＭＹ培地
　以下のＭＹに、シュークロース（和光純薬工業株式会社）、グルコース、寒天（和光純薬工業株式会社）、及びグリセリンの少なくともいずれかを各種割合で添加し、１００ｍｌのイオン交換水に懸濁し、オートクレーブで融解後、シャーレに分注して作製した。
　ＭＹ：麦芽（Ｍａｌｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ，ＤＩＦＣＯ社製）＋酵母（Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ，ＤＩＦＣＯ社製）
２．培地の水分活性値の測定
　実際に培養に使用した培地の所定量について、ロトロニック水分活性測定装置（ＧＳＩクレオス社製）を使用して、その水分活性値を専用密閉容器内で測定した。
３．培養評価
　上記作製方法に従って作成した各種培地（図１９の実施例１－１０，参考例１－６）を用いて、好乾性カビ（Eurotium　herbariorum）、耐乾性カビ（A.niger）、好湿性カビ（Fusarium　sp.）を２５℃で暗所にて７２時間培養し、得られたコロニーの直径を測定した。培養後のコロニーの直径が１０ｍｍ以上を○、１０ｍｍ未満を×とした。その結果を図１９に示す。
　同図に示されている通り、実施例１－１０の各種培地を用いた場合は、好乾性カビ、耐乾性カビ及び好湿性カビのいずれもが十分に繁殖していることがわかる。一方、参考例１－６の各種培地を用いた場合は、十分に繁殖していない菌種が存在していることがわかる。このため、複数の菌種を同時に培養するためには、水分活性値が１．０未満、０．９０以上で、且つ、糖濃度５％～５０％の範囲とすることが好適であることがわかる。
（試験８：各種培地による培養試験）
　図１９に示す参考例１，２，４－６、及び実施例７の６種類の培地を用いて、各種のカビを２５℃で暗所にて１６８時間培養し、得られたコロニーの直径を測定した。
　供試菌種としては、以下の１４種類のものを使用した。結果を図２０に示す。このうち、１－４の供試菌種は好乾性のカビであり、５－１０の供試菌種は耐乾性のカビであり、１１－１４の供試菌種は好湿性のカビである。なお、これらの供試菌種は環境中から独自に採取し、同定して得たものであり、その番号は便宜上付したものである。
１．アスペルギルス　ペニシリオイデス（A.penicillioides，K-7-4）
２．アスペルギルス　リストリクタス（A.restrictus，I-2-1）
３．ユーロチウム　ヘルバリオルム（Eurotium　herbariorum，イ2-1）
４．ワレミア　セビ（Wallemia　sebi，KSS-1127）
５．アスペルギルス　フラバス（A.flavus，B-3-3）
６．アスペルギルス　フミガタス（A.fumigatus，KSS-1126）
７．アスペルギルス　ニガー（A.niger，A-1-1）
８．アスペルギルス　バーシカラー（A.versicolor，イ3-1）
９．ペニシリウム　グラブラム（Penicillium　glabrum，B-4-3）
１０．ペニシリウム　ルグロサム（P.rugulosum，E-2-3）
１１．クラドスポリウム　サファエロスペルマ（Cladosporium.sphaerospermum，I-4-2）
１２．クラドスポリウム　クラドスポリオイデス（C.cladosporioides，A-2-1）
１３．フザリウム属菌（Fusarium　sp.，Ｂ５－３－Ｃ）
１４．スタキボトリス属菌（Stachybotrys　sp.，KSS-1125）
　図２０に示される通り、実施例７の培地（Ｍ４０Ｙ）によれば、生育に適する湿度が異なる複数の種類のカビのコロニーができ、上記１－１４の全ての菌種が、十分に繁殖していることがわかる。
　このように、実施例７の培地を用いれば、最適湿度についての性質が異なる複数のカビを、同じ培地で同時に培養可能であることが明らかとなった。
（試験９：各種温度による培養試験）
　実施例７で使用したＭ４０Ｙ培地を用いて、各種温度で培養を行い、得られたコロニーの直径を測定した。供試菌種は、試験１と同様に好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを含む１４種類を用い、暗所にて１６８時間培養を行った。その結果を図２１に示す。また、３，８，１３の菌種について、図２２にコロニーの写真を示す。
　図２１の実施例１１－１３に示される通り、培養温度が２３℃～２７℃の範囲では、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビのいずれもが十分に繁殖していることがわかる。一方、参考例７－９に示される通り、培養温度が３０℃～３５℃の範囲では、生育できない菌種が存在することがわかる。このため、複数の菌種を同時に培養するためには、培養温度を２５℃±２℃の範囲とすることが好適であることがわかる。
（試験１０：ＤＮＡチップ解析試験）
　実施例７で使用したＭ４０Ｙ培地を用いて各種カビを培養し、得られたコロニーを混合して一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＩＴＳ１領域をＰＣＲ法により増幅して検出対象カビが増幅産物に含まれているか否かをＤＮＡチップにより検査した。また、ＤＮＡチップによる検査結果を検証するために、ＤＮＡ配列解析を行った。具体的には、以下のようにして行った。
　まず、実施例７で使用したＭ４０Ｙ培地を用いた検体として、Ｎｏ．１からＮｏ．６０までの６０個の検体を準備した。次に、エアーサンプラーを用いて、一般環境中から空気を採取し、上記各検体に吹き付けて培養した。培養は、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。
　次に、検体ごとに、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーを、ＤＮＡ配列解析に供するために、各コロニーの一部を個別に採取し、それぞれ２５℃の暗所で７－１０日間分離培養を行った。
　さらに、検体ごとに、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーを一括して採取して、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて、カビの細胞を破砕した。
　次いで、検体ごとに、ＤＮＡ抽出装置によりカビのゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域を増幅した。
　具体的には、ＰＣＲ反応液として、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ　ａｄｄｉｔｉｏｎ（Ｇ／Ｃｒｉｃｈ）　４．０μｌ
２．Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（ａｄｄｉｔｉｏｎ－４）　４．０μｌ
３．ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ　１．０μｌ
４．Ｃｙ５－ｄＣＴＰ　０．２μｌ
５．ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー（１０μＭ，配列番号４２，シグマアルドリッチ社により合成）　１．０μｌ
６．ＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマー（１０μＭ，配列番号４３，シグマアルドリッチ社により合成）　１．０μｌ
７．試料のゲノムＤＮＡ　１．０μｌ
８．ＮｏｖａＴａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　０．２μｌ
９．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
　このＰＣＲ反応液を使用して核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（Ｒ）　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
１．９５℃　１０分
２．９５℃　３０秒
３．５６℃　３０秒
４．７２℃　６０秒（２～４を４０サイクル）
５．７２℃　１０分
　ＤＮＡチップには、ジーンシリコン（Ｒ）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、これに配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６に示される塩基配列からなるプローブを固定化したものを使用した。これらは、それぞれアスペルギルス　ヴィトリコラ（Aspergillus　vitricola）検出用のプローブ、アスペルギルス　ペニシリオイデス（Aspergillus　penicillioides）検出用のプローブ、及びユーロチウム属菌（Eurotium　sp.）検出用のプローブである。
　次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸－生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、上記ＤＮＡチップに滴下した。
　このＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をマイクロアレイから洗い流した。
　次いで、ＤＮＡチップを標識検出装置（ジーンシリコン専用スキャナー　BIOSHOT東洋鋼鈑株式会社製）にかけて、各プローブの蛍光強度を測定した。その結果を図２３－２５に示す。
　また、検体ごとに含まれる菌種のＤＮＡ配列解析を行うため、上記のようにコロニーごとに分離培養して得られた菌種からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により増幅産物を得た。
　このとき、プライマーセットは、配列番号４２及び４３に示される塩基配列からなるものを用いるとともに、核酸合成酵素には、TAKARA　ExTaq　ポリメラーゼを使用した。また、核酸増幅装置には、ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（Ｒ）　Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、その他は上記と同様にしてＰＣＲ反応を行った。
　このＰＣＲ反応により得られた増幅産物と、配列番号４７及び４８に示される塩基配列からなるプライマーセットをシーケンス用プライマーとして、タカラバイオ株式会社に委託し、ＤＮＡシーケンサーによりＩＴＳ１領域の配列解析を行った。その結果、図２３－２５に示すように、各検体から最大で４菌種が確認された。
　図２３－２５の「ＤＮＡチップ解析（プローブ蛍光強度）」において、陽性と考えられる部分を太枠で囲っている。これらは、それぞれ「ＩＴＳ配列解析により確認された検体中に含まれる菌種」において、同じ菌種が示されている。
　なお、ＩＴＳ配列解析により耐乾性カビ（Penicillium　sp.）、及び好湿性カビ（Cladosporium　sp.）が含まれていることが判明した検体Ｎｏ．３につき、Penicillium　sp検出用プローブ及びCladosporium　sp検出用プローブを固定化したＤＮＡチップを用いて、上記と同様にして、標識検出装置により蛍光強度を測定したところ、これらの菌種（Penicillium　sp.，Cladosporium　sp.）の検出が確認された。
　したがって、本発明のカビの検査方法により、複数種類のカビを同じ培地で同時に培養した場合に、各カビを特異的に検出できることが分かった。
　本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
　例えば、上記の試験のＰＣＲ用反応液におけるＩＴＳ領域増幅用プライマーセット及びβ－チューブリン遺伝子増幅用プライマーセット以外の成分については、適宜変更することができる。また、これらの増幅産物を用いて対象カビの検出を行う方法であれば、上記のようなＤＮＡチップを用いて蛍光検出を行うのではなく、電気泳動による検出や、電流検出方式など他の検出方式のＤＮＡチップにより増幅産物を検出することなどが可能である。
　また、上記実施例では、培地としてＭ４０Ｙなどを用いているがこれらに限定されるものではなく、水分活性値が１．０未満、０．９０以上で、且つ、糖濃度５％～５０％の固形培地のその他の固形培地を用いるなど適宜変更することが可能である。
　本発明は、環境検査、食品検査、疫学的環境検査、臨床試験、家畜衛生等において、複数のカビを特異的且つ多重に検出する場合に好適に利用することが可能である。また、食品製造現場や臨床現場、文化財の保護環境等におけるカビの検査に好適に利用することが可能である。

Claims (10)

  1. 　カビのＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させ、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、
    　前記標的領域として、ＩＴＳ領域、及び、β－チューブリン遺伝子を用いる
    　ことを特徴とするカビの検出方法。
  2. 　前記標的領域の増幅を行うためのＰＣＲ用反応液において、β－チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットの濃度比が、１：０．９～１：０．１である
    　ことを特徴とする請求項１記載のカビの検出方法。
  3. 　前記標的領域の増幅を行うためのＰＣＲ用反応液において、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用い、かつ、β－チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いる
    　ことを特徴とする請求項１又は２記載のカビの検出方法。
  4. 　前記標的領域の増幅を行うための前記ＰＣＲ用反応液に、クラドスポリウム属菌を特異的に増幅させるためのフォワードプライマーとして、配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーを用いる
    　ことを特徴とする請求項３記載のカビの検出方法。
  5. 　前記カビが、ユーロチウム属菌（Eurotium　sp.）、アスペルギルス　ペニシリオイデス種菌（Aspergillus　penicillioides）、アスペルギルス　ヴィトリコラ種菌（Aspergillus　vitricola）、アスペルギルス　リストリクティ節菌（Aspergillus　Section　Restricti）、アスペルギルス　ニデュランテス節菌（Aspergillus　Section　Nidulantes）、アスペルギルス　フミガティ節菌（Aspergillus　Section　Fumigati）、アスペルギルス　フラヴィ節菌（Aspergillus　Section　Flavi）、ペニシリウム属菌（Penicillium　sp.）、スタチボトリス　チャルタラム種菌（Stachybotrys　chartarum）、フザリウム　ソラニ種菌（Fusarium　solani）、クラドスポリウム属菌（Cladosporium　sp.）の少なくともいずれかである
    　ことを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載のカビの検出方法。
  6. 　カビのＤＮＡにおける標的領域の増幅を行うために用いられるＰＣＲ用反応液であって、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットと、β－チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとして、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットと、を含む
    　ことを特徴とするＰＣＲ用反応液。
  7. 　クラドスポリウム属菌を特異的に増幅させるためのフォワードプライマーとして、配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーをさらに含む
    　ことを特徴とする請求項６記載のＰＣＲ用反応液。
  8. 　一又は二以上のカビの種類毎に、ＩＴＳ領域から選択された塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された塩基配列を有するプローブを固定化した
    　ことを特徴とするカビ検出用担体。
  9. 　ユーロチウム属菌（Eurotium　sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号６又は７に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号８に示す塩基配列を有するプローブからなる第一のプローブ群、
    　アスペルギルス　ペニシリオイデス種菌（Aspergillus　penicillioides）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号９～１１に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号１２に示す塩基配列を有するプローブからなる第二のプローブ群、
    　アスペルギルス　ヴィトリコラ種菌（Aspergillus　vitricola）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１３又は１４に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号１５に示す塩基配列を有するプローブからなる第三のプローブ群、
    　アスペルギルス　リストリクティ節菌（Aspergillus　Section　Restricti）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１６～２０に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号２１に示す塩基配列を有するプローブからなる第四のプローブ群、
    　アスペルギルス　ニデュランテス節菌（Aspergillus　Section　Nidulantes）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２２に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号２３に示す塩基配列を有するプローブからなる第五のプローブ群、
    　アスペルギルス　フミガティ節菌（Aspergillus　Section　Fumigati）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２４に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号２５に示す塩基配列を有するプローブからなる第六のプローブ群、
    　アスペルギルス　フラヴィ節菌（Aspergillus　Section　Flavi）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２６に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号２７に示す塩基配列を有するプローブからなる第七のプローブ群、
    　ペニシリウム属菌（Penicillium　sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２８又は２９に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれか、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号３０～３２に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群、
    　スタチボトリス　チャルタラム種菌（Stachybotrys　chartarum）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３３に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号３４に示す塩基配列を有するプローブからなる第九のプローブ群、
    　フザリウム　ソラニ種菌（Fusarium　solani）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３５に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号３６に示す塩基配列を有するプローブからなる第十のプローブ群、
    　クラドスポリウム属菌（Cladosporium　sp.）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号３７に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号３８又は３９に示す塩基配列を有するプローブの少なくともいずれかからなる第十一のプローブ群、及び、
    　カビ共通の、ＩＴＳ領域から選択された配列番号４０に示す塩基配列を有するプローブ、及び、β－チューブリン遺伝子から選択された配列番号４１に示す塩基配列を有するプローブからなる第十二のプローブ群から選択された一又は二群以上のプローブを固定化した
    　ことを特徴とする請求項８記載のカビ検出用担体。
  10. 　前記第一から第十二のプローブ群における少なくともいずれかのプローブが、以下の（１）～（３）のいずれかであることを特徴とする請求項９記載のカビ検出用担体。
    （１）配列番号に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
    （２）配列番号に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
    （３）（１）又は（２）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
PCT/JP2012/001991 2011-06-09 2012-03-22 カビの検出方法、ｐｃｒ用反応液、及びカビ検出用担体 WO2012169099A1 (ja)

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