JP2008035773A - ハウスダストアレルギーの原因となるダニ・カビ類の検出・識別用マイクロアレイ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、検査対象から採取したダニ類及びカビ類由来のゲノムDNA又はRNAを鋳型とし、ダニ遺伝子特異的プライマーセット及びカビ遺伝子特異的プライマーセットを用いて増幅された検出対象領域に対してハイブリダイズ可能である核酸プローブが担体に固定化されてなるダニ類又はカビ類の検出又は識別用マイクロアレイに関する。
【選択図】なし
Description
(1)検査対象から採取したダニ類又はカビ類由来のゲノムDNA又はRNAを鋳型として増幅された検出対象領域に対してハイブリダイズ可能である核酸プローブが担体に固定化されてなるダニ類又はカビ類の検出又は識別用マイクロアレイ。
(2)核酸プローブが、前記ダニ類としてDermatophagoides farinae(コナヒョウヒダニ)、Dermatophagoides pteronyssinus(ヤケヒョウヒダニ)又はTyrophagus pterescentiae(ケナガコナダニ)に由来し、前記カビ類としてAlternaria alternata、Aspergills restrictus、Aspergills versicolor、Candida albicans、Cladosporium sphaerosporum、Eurotium herboriorum、Aspergillus nigar、Penicillium chrysogenum、Fusarium sp.又はWallemia sebiに由来するゲノムDNA又はRNAを鋳型として増幅された検出対象領域に対してハイブリダイズ可能である、(1)記載のマイクロアレイ。
(4)ダニ遺伝子特異的プライマーセット又はカビ遺伝子特異的プライマーセットが連続した15〜30塩基の配列を有する、(1)〜(3)のいずれかに記載のマイクロアレイ。
(a)配列番号56に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号57に示す塩基配列からなるプライマーとのセット
(b)配列番号56に示す塩基配列において1〜5個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるプライマーと配列番号57塩基配列において1〜5個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるからなるプライマーとからなり、前記(a)のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
(c)配列番号56に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーと配列番号57に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーとからなり、前記(a)のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
である、(3)記載のマイクロアレイ。
(a)配列番号58に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号59に示す塩基配列からなるプライマーとのセット
(b)配列番号58に示す塩基配列において1〜5個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるプライマーと配列番号59塩基配列において1〜5個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるからなるプライマーとからなり、前記(a)のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
(c)配列番号58に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーと配列番号59に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーとからなり、前記(a)のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
である、(3)記載のマイクロアレイ。
(8)核酸プローブが、配列番号24、28、32、36、40、44、48〜53及び114〜121からなる群より選ばれる少なくとも1の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列の一部又は全部を含む、(1)又は(2)記載のマイクロアレイ。
(10)前記担体が、表面にカーボン層と化学修飾基とを有するものである(1)〜(9)のいずれかに記載のマイクロアレイ。
(11)カーボン層がダイヤモンドライクカーボン層であり、化学修飾基が活性エステル基である、(10)記載のマイクロアレイ。
採取した塵芥からダニ類及びカビ類を分離し、分離されたダニ類及びカビ類からゲノムDNA又はRNAを抽出する工程と、
抽出したゲノムDNA又はRNAを鋳型とし、検出対象領域を増幅する工程と、
(1)〜(11)いずれかに記載のマイクロアレイを用いて検出対象領域を検出する工程と
を含む、ダニ類又はカビ類の検出又は識別方法。
本発明に係るダニ・カビ類の検出・識別システムは、ハウスダストアレルギーの原因となるダニ類及びカビ類を検出又は識別できるシステムである。本システムにおいて検出又は識別対象のダニ類としては、Dermatophagoides farinae(コナヒョウヒダニ)、Dermatophagoides pteronyssinus(ヤケヒョウヒダニ)、Tyrophagus pterescentiae(ケナガコナダニ)、Hirstia domicola(イエチリダニ)、Malayoglyphus intermedius(ニセチリダニ)、Euroglyphus maynei(シワダニ)、Acarus siro(アシブトコナダニ)、Acarus immobilis(オソアシブトコナダニ)、Aleuroglyphus ovatus(ムギコナダニ)、Lardoglyphus konoi(コウノホシカダニ)、Suidasia nesbitti(チビコナダニ)、Calvolia domicola(ゴミウスケダニ)、Carpoglyphus lactis(サトウダニ)、Chortoglyphus domicola(イエマルニクダニ)、Glycyphagus destructor(サヤアシニクダニ)、Glycyphagus domesticus( イエニクダニ)、Glycyphagus privates(チリニクダニ)、Gohieria fusca(キナコダニ)、Sarcoptes scabiei (ヒゼンダニ)、Notoedres cati(ネコショウヒゼンダニ)、Dermanyssus hirundinis(スズメサシダニ)、Ornithonyssus sylviarum(トリサシダニ)、Ornithonyssus bacoti(イエダニ)、Cheyletus eruditus(ホソツメダニ)、Cheyletus malaccensis(フトツメダニ)、Chelacaropsis moorei(ミナミツメダニ)、Cheyletus malaccensis(クワガタツメダニ)、Chelatomorpha lepidopterorum(アシナガツメダニ)、Demodex folliculorum(ニキビダニ)、Pyemotes tritici(ムギシラミダニ)、Tarsonemus granaries(ナミホコリダニ)、Haplochthonius simplex(イエササラダニ)、Cosmochthonius reticulates(カザリヒワダニ)等を挙げることができる。本システムにおいて検出又は識別対象のカビ類としては、Alternaria alternata、Aspergills restrictus、Aspergills versicolor、Candida albicans、Cladosporium sphaerosporum、Eurotium herboriorum、Wallemia sebi、Botrytis cinerea、Mucor racemosus、Rhizopus stolonifer、Stachybotrys chartarum、Trichoderma viride Fusarium solani、Aspergillus fumigatus、Aspergillus niger、Aureobasidium pullulans、Cladosporium cladosporioides、Cladosporium herbarum、Epicoccum nigrum、Paecilomyces variotii、Penicillium chrysogenum、Penicillium citrinum、Ulocladium chartarum、Penicillium brevi-compactum、Penicillium aurantiogriseum、Aspergillus amstelodami(Eurotium amstelodami)、Aspergillus chevalieri(Eurotium chevalieri)、Acremonium strictum、Phoma glomerata、Scopulariopsis brevicaulis、Chaetomium globosum等を挙げることができる。
本発明のマイクロアレイには、通常1〜100種、好ましくは5〜50種、より好ましくは10〜30種の核酸プローブが固定化される。
本実施例では、Dermatophagoides farinae(コナヒョウヒダニ)、Dermatophagoides pteronyssinus(ヤケヒョウヒダニ)、Tyrophagus pterescentiae(ケナガコナダニ)の3種のダニを識別できるPCR条件について検討した。
DP-ITS1F:5'- TTC TTg AgC ATT TAT TTg C -3'(配列番号10)
DP-ITS1R:5'- TTT gTA TCA ATg TTT ATg g -3'(配列番号11)
DP-ITS2F:5'- TAT CAA ATT ATg ACC AAA C -3'(配列番号14)
DP-ITS2R:5'- TAC ATT gAT TTg TCA ACC -3'(配列番号15)
前記プライマーを用いて表1及び2に示す条件でPCRを行った。
DF-ITS1F:5'- TTg AAC AAT gAA ACA CTT g -3'(配列番号2)
DF-ITS1R:5'- TTg TTT CAA TgA TAC Tgg C -3'(配列番号3)
TP-ITS2F:5'- ATA TgC CAA ACA CCA TgC -3'(配列番号22)
TP-ITS2R:5'- gAA AgT TAA CAA CAA CTg C -3'(配列番号23)
前記プライマーを用いて表3及び4に示す条件でPCRを行った。
本実施例では、検出及び標識対象のダニ類からのゲノムDNAを抽出する方法について検討した。また、カビ類からのゲノムDNAを抽出する方法についても検討した。本実施例では、供試ダニとしてアレルゲンの原因ダニとして知られるコナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)を用いた。虫体の破砕には、ホモジナイゼーションペッスル(フナコシ株式会社)もしくは乳鉢・乳棒を用いた。Proteinase KはMERCK社の製品を用い、酵素反応は定法に従い0.5% SDSの存在下37℃で1時間行った。全ての手法において最終的にCTAB処理を行い、イソプロパノールにてDNAを沈殿させた。遠心分離を行い、上清を除去した後、10μLの滅菌水に溶解した。そのうち4μLを用いてrDNA ITS領域のPCRにより増幅を行った。
Arthro-ITSF:5'- TAg Agg AAg TAA Aag TCG-3'(配列番号60)
Inaect-ITSR:5'- CCT TAg Atg gAg TTT ACC-3'(配列番号61)
本実施例では、ダニ遺伝子特異的プライマー又はカビ遺伝子特異的プライマーを使用した、いわゆる1-tube PCRについて検討した。
Acari ITS1:5'- CAA ggT TTC CgT Agg TgA AC -3' (Tm: 55.4 ℃)(配列番号56)
Acari ITS2 R:5'- gCT TgA TCT gAg gTC gA -3' (Tm: 52.2 ℃)(配列番号57)
ITS1-F:5'- CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A -3' (Tm: 53.0 ℃)(配列番号58)
FO514:5'- TAT GCT TAA GTT CAG CGG GTA GTC C -3' (Tm: 60.5 ℃)(配列番号59)
これらプライマーセットにより増幅される領域はITS1〜5.8S〜ITS2である。
1:Alternaria alternata+Dermatophagoides farinae
2:Cladsporium sphaerospermum+Dermatophagoide pteronyssinus
3:Eurotium herbariorum +Tyrophagus putrescentiae
3mm角のシリコン基板にイオン化蒸着法を用いて、下記の条件で2層のDLC層の製膜を行った。
ダニ種(Dermatophagoides farinae、Dermatophagoides pteronyssinus、Tyrophagus putrescentiae)及びカビ種(Alternaria alternata、Cladosporium sphaerospermum、Eurochium harbariorum、Candida albicans、Aspergillus versicolor)のゲノムDNAを鋳型とし、ダニ遺伝子特異的プライマーセット又はカビ遺伝子特異的プライマーセットを用いてそれぞれPCRを行い、ターゲット溶液を調製した。標識は、Cy dyeを用いて行った。PCR溶液の組成は以下のとおりとした。
FLA 8000(富士写真フィルム株式会社)で蛍光画像を撮影した(20merの核酸プローブのみ)。
Claims (12)
- 検査対象から採取したダニ類又はカビ類由来のゲノムDNA又はRNAを鋳型として増幅された検出対象領域に対してハイブリダイズ可能である核酸プローブが担体に固定化されてなるダニ類又はカビ類の検出又は識別用マイクロアレイ。
- 核酸プローブが、前記ダニ類としてDermatophagoides farinae(コナヒョウヒダニ)、Dermatophagoides pteronyssinus(ヤケヒョウヒダニ)又はTyrophagus pterescentiae(ケナガコナダニ)に由来し、前記カビ類としてAlternaria alternata、Aspergills restrictus、Aspergills versicolor、Candida albicans、Cladosporium sphaerosporum、Eurotium herboriorum、Aspergillus nigar、Penicillium chrysogenum、Fusarium sp.又はWallemia sebiに由来するゲノムDNA又はRNAを鋳型として増幅された検出対象領域に対してハイブリダイズ可能である、請求項1記載のマイクロアレイ。
- 検出対象領域が、ダニ遺伝子特異的プライマーセット又はカビ遺伝子特異的プライマーセットを用いて増幅されるものである、請求項1又は2記載のマイクロアレイ。
- ダニ遺伝子特異的プライマーセット又はカビ遺伝子特異的プライマーセットが連続した15〜30塩基の配列を有する、請求項1〜3のいずれか1項記載のマイクロアレイ。
- 前記ダニ遺伝子特異的プライマーセットが以下の(a)、(b)又は(c):
(a)配列番号56に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号57に示す塩基配列からなるプライマーとのセット
(b)配列番号56に示す塩基配列において1〜5個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるプライマーと配列番号57塩基配列において1〜5個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるからなるプライマーとからなり、前記(a)のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
(c)配列番号56に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーと配列番号57に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーとからなり、前記(a)のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
である、請求項3記載のマイクロアレイ。 - 前記カビ遺伝子特異的プライマーセットが以下の(a)、(b)又は(c):
(a)配列番号58に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号59に示す塩基配列からなるプライマーとのセット
(b)配列番号58に示す塩基配列において1〜5個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるプライマーと配列番号59塩基配列において1〜5個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるからなるプライマーとからなり、前記(a)のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
(c)配列番号58に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーと配列番号59に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーとからなり、前記(a)のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
である、請求項3記載のマイクロアレイ。 - 核酸プローブが、配列番号1、5、9、13、17及び21からなる群より選ばれる少なくとも1の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列の一部又は全部を含む、請求項1又は2記載のマイクロアレイ。
- 核酸プローブが、配列番号24、28、32、36、40、44、48〜53及び114〜121からなる群より選ばれる少なくとも1の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列の一部又は全部を含む、請求項1又は2記載のマイクロアレイ。
- 少なくとも1の塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列の一部が、連続した10〜30塩基の配列である請求項7又は8記載のマイクロアレイ。
- 前記担体が、表面にカーボン層と化学修飾基とを有するものである請求項1〜9のいずれか1項記載のマイクロアレイ。
- カーボン層がダイヤモンドライクカーボン層であり、化学修飾基が活性エステル基である、請求項10記載のマイクロアレイ。
- 検査対象から塵芥を採取する工程と、
採取した塵芥からダニ類及びカビ類を分離し、分離されたダニ類及びカビ類からゲノムDNA又はRNAを抽出する工程と、
抽出したゲノムDNA又はRNAを鋳型とし、検出対象領域を増幅する工程と、
請求項1〜11いずれか1項記載のマイクロアレイを用いて検出対象領域を検出する工程と
を含む、ダニ類又はカビ類の検出又は識別方法。
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