JP5750369B2 - マイコバクテリアの迅速な検出 - Google Patents
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Description
(a)試料を一対の順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
前記順方向プライマーがマイコバクテリア散在性反復単位(MIRU)反復エレメント内に位置する標的核酸配列とハイブリダイズし、
前記逆方向プライマーがマイコバクテリア散在性反復単位(MIRU)反復エレメント内に位置する標的核酸配列とハイブリダイズするステップと、
(b)前記順方向及び逆方向のプライマーを伸長させて増幅産物を得るステップと、
(c)増幅産物を検出するステップと
を含む方法を提供することによって、この必要性を満たす。
MIRU2反復エレメント1、2及び3;
MIRU10反復エレメント1、2、3、4及び5;
MIRU16反復エレメント1、2及び3;
MIRU23反復エレメント1、2、3、4及び5;
MIRU24反復エレメント1;
MIRU26反復エレメント1、2、3、4及び5;
MIRU27/QUB5反復エレメント1、2、3及び4(好ましくはMIRU27/QUB5のタンデム反復エレメント2、3及び4);
MIRU31/ETRE反復エレメント1、2及び3(好ましくはMIRU31/ETREの反復エレメント2及び3);並びに
MIRU39反復エレメント1及び2。
MIRU2反復エレメント1、2及び3;
MIRU10反復エレメント1、2、3、4及び5;
MIRU16反復エレメント1、2及び3;
MIRU23反復エレメント1、2、3、4及び5;
MIRU24反復エレメント1;
MIRU26反復エレメント1、2、3、4及び5;
MIRU27/QUB5反復エレメント1、2、3及び4(好ましくはMIRU27/QUB5のタンデム反復エレメント2、3及び4);
MIRU31/ETRE反復エレメント1、2及び3(好ましくはMIRU31/ETREの反復エレメント2及び3);並びに
MIRU39反復エレメント1及び2。
痰試料は、英国のニューカスル地域HPA研究所(Newcastle Regional HPA laboratory)、王立ロンドン病院(Royal London Hospital)の両方から寄付されたものである。
Mtb det逆方向:5' CGC CGG CGA CGA TGC AGA GC 3'
Mtb det順方向:5' GGC GCC GCT CCT CCT CAT CGC T 3'
PCR反応混合物は、25μlのReadyMix(商標)(最終濃度:1.5UのTaqポリメラーゼ、10mMのトリス−HCl、50mMのKCl、1.5mMのMgCl2、0.2mMのdNTP)(Sigma社製、英国)、5pmolの逆方向プライマー、5pmolの順方向プライマー(MWGEurofins社製、英国)、200ngの鋳型DNA又は1μlの失活痰、及び合計50μlまでのヌクレアーゼ非含有水からなっていた。
PCR反応混合物は、10μlの2×Lightcycler 480(登録商標)SYBR green Iマスターミックス(FastStartTaqポリメラーゼ、dNTP混合物、SYBR green I色素、及び3.5mMのMgCl2を含有)、0.5μMの順方向及び逆方向のプライマーを両方、5μlの鋳型DNA及び並びに合計20μlまでのヌクレアーゼ非含有水からなっていた。
遮断に基づいた分析
PCR産物は、1.5%(w/v)のアガロースゲル(Invitrogen社製、英国)中の電気泳動(65Vで120分間)によって分析した。ゲルを200mlの1×TBE緩衝液(Invitrogen社製)中の20μlのSYBR green I核酸ゲル染色(10,000×;Sigma Aldrich社製、英国)で30分間染色し、紫外線照射(BioRad社製)によって可視化した。
増幅曲線は、LC480ソフトウェアから導いたAbsolute Quantification/2nd Derivative Maxの方法によって分析した。融解曲線の分析は、LC480ソフトウェア内のNegative first derivative(−dF/dT)の方法を用いて自動的に行った。
約200ngの抽出したウシ型結核菌のDNAを、以下のリアルタイムPCRにおいて鋳型として使用した。
Mtb det逆方向:5' CGC CGG CGA CGA TGC AGA GC 3'
Mtb det順方向:5' GGC GCC GCT CCT CCT CAT CGC T 3'
PCR反応混合物は、10μlの2×Lightcycler 480(登録商標)SYBR green Iマスターミックス(FastStartTaqポリメラーゼ、dNTP混合物、SYBR green I色素、及び3.5mMのMgCl2を含有)、0.5μMの順方向及び逆方向のプライマーを両方、200ngの鋳型DNA並びに合計20μlまでのヌクレアーゼ非含有水からなっていた。
PCR産物は、2.0%のEGel(Invitrogen社製、英国)中の電気泳動(65Vで30分間)によって分析した。ゲルは、紫外線照射(BioRad社製)によって可視化した。
増幅曲線は、LC480ソフトウェアから導いたAbsolute Quantification/2nd Derivative Maxの方法によって分析した。融解曲線の分析は、LC480ソフトウェア内のNegative first derivative(−dF/dT)方法を用いて自動的に行った。
位置 名称 Tm1 Tm2
A1 ウシ型結核菌 62 93.74
A2 ウシ型結核菌 62 94.23
A3 ウシ型結核菌 64 93.63
A4 ウシ型結核菌 65 93.65
A5 ウシ型結核菌 65ニート 93.10
A6 Mtb陽性対照 93.11
B1 ウシ型結核菌 62 93.58
B2 ウシ型結核菌 62 93.47
B3 ウシ型結核菌 64 93.57
B4 ウシ型結核菌 65 93.45
B5 陰性対照 85.96
B6 Mtb陽性対照 93.79
C1 ウシ型結核菌 62 93.63
C2 ウシ型結核菌 64 93.62
C3 ウシ型結核菌 64 93.24
C4 ウシ型結核菌 65 93.51
C5 陰性対照 85.76
D1 ウシ型結核菌 62 93.69
D2 ウシ型結核菌 64 93.23
D3 ウシ型結核菌 64 86.19
D4 ウシ型結核菌 65 93.54
D5 陰性対照 85.92
E1 ウシ型結核菌 62 93.59
E2 ウシ型結核菌 64 93.97
E3 ウシ型結核菌 65 93.72
E4 ウシ型結核菌 65 93.85
E5 陰性対照 85.89
F1 ウシ型結核菌 62 93.56
F2 ウシ型結核菌 64 93.20
F3 ウシ型結核菌 65 93.48
F4 ウシ型結核菌 65 93.44
F5 陰性対照 85.85
G1 ウシ型結核菌 62 93.63
G2 ウシ型結核菌 64 93.10
G3 ウシ型結核菌 65 93.36
G4 ウシ型結核菌 62ニート 92.94
G5 陰性対照 85.76
H1 ウシ型結核菌 62 93.76
H2 ウシ型結核菌 64 93.18
H3 ウシ型結核菌 65 93.93
H4 ウシ型結核菌 64ニート N/A
H5 陰性対照 86.10
(参考文献)
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Claims (42)
- 試料中の結核菌群に属するマイコバクテリアの核酸を検出する方法であって、
(a)試料を一対の順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、
前記順方向プライマーがマイコバクテリア散在性反復単位(MIRU)反復エレメント内に位置し、配列番号25〜39から選択されるヌクレオチド配列の相補体である標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、
前記逆方向プライマーがマイコバクテリア散在性反復単位(MIRU)反復エレメント内に位置し、配列番号40〜46から選択される標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、
前記順方向プライマーが、配列番号47若しくは48のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなり、又は前記順方向プライマーが、配列番号47若しくは48のヌクレオチド配列における少なくとも20個の連続したヌクレオチドを含有する断片からなり、かつ、
前記逆方向プライマーが、配列番号49〜51のいずれかのヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなり、又は前記逆方向プライマーが、配列番号49〜51のいずれかのヌクレオチド配列における少なくとも18個の連続したヌクレオチドを含有する断片からなる、ステップと、
(b)前記順方向及び逆方向のプライマーを伸長させて増幅産物を得るステップと、
(c)前記増幅産物を検出するステップと
を含む、方法。 - 標的ヌクレオチド配列が、MIRU2反復エレメント、MIRU10反復エレメント、MIRU16反復エレメント、MIRU23反復エレメント、MIRU24反復エレメント、MIRU26反復エレメント、MIRU27反復エレメント、MIRU31反復エレメント及びMIRU39反復エレメントから選択されるMIRU反復エレメント内に位置する、請求項1に記載の方法。
- 順方向のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号47若しくは48のヌクレオチド配列における少なくとも20個の連続したヌクレオチドを含有する断片からなり、かつ、逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号49〜51のいずれかのヌクレオチド配列における少なくとも18個の連続したヌクレオチドを含有する断片からなる、請求項1又は2に記載の方法。
- 順方向プライマーが、配列番号47若しくは48のヌクレオチド配列における少なくとも20個の連続したヌクレオチドを含有する断片からなる、請求項1又は2に記載の方法。
- 順方向プライマーが、配列番号47又は48のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項1又は2に記載の方法。
- 順方向プライマーが、配列番号47又は48のヌクレオチド配列からなる、請求項5に記載の方法。
- 順方向プライマーが、配列番号47に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項1又は2に記載の方法。
- 順方向のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号47のヌクレオチド配列、又は配列番号47における少なくとも20個の連続したヌクレオチドを含有する断片からなる、請求項1又は2に記載の方法。
- 順方向のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号47のヌクレオチド配列からなる、請求項7又は8に記載の方法。
- 逆方向プライマーが、配列番号49〜51のいずれかのヌクレオチド配列における少なくとも18個の連続したヌクレオチドを含有する断片からなる、請求項1、2、及び4〜9のいずれかに記載の方法。
- 逆方向プライマーが、配列番号49〜51のいずれかのヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項1、2、及び4〜9のいずれかに記載の方法。
- 逆方向プライマーが、配列番号49〜51のいずれかのヌクレオチド配列からなる、請求項11に記載の方法。
- 逆方向プライマーが、配列番号49に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項1、2、及び4〜9のいずれかに記載の方法。
- 逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号49のヌクレオチド配列、又は配列番号49における少なくとも18個の連続したヌクレオチドを含有する断片からなる、請求項1、2、及び4〜9のいずれかに記載の方法。
- 逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号49のヌクレオチド配列からなる、請求項13又は14に記載の方法。
- 順方向プライマーが、配列番号47若しくは48のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、逆方向プライマーが、配列番号49〜51のいずれかのヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項1又は2に記載の方法。
- 順方向のオリゴヌクレオチドプライマーが配列番号47のヌクレオチド配列からなり、逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーが配列番号49のヌクレオチド配列からなる、請求項1又は2に記載の方法。
- 順方向及び逆方向のプライマーが、同じマイコバクテリア散在性反復単位(MIRU)反復エレメント内に位置する標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする場合、前記プライマーを伸長させることにより、30〜55個のヌクレオチドの長さである増幅産物を得る、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- 増幅産物が、43〜45個のヌクレオチドの長さである、請求項18に記載の方法。
- 順方向及び逆方向のプライマーが、同じマイコバクテリア散在性反復単位(MIRU)座位内の異なるMIRU反復エレメント内に位置する標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする場合、前記プライマーを伸長させることにより、前記同じMIRU座位内の2個以上の隣接するMIRU反復エレメントからのヌクレオチド配列を含む増幅産物を得る、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- 順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーが、異なるMIRU座位内に位置する標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする場合、前記プライマーを伸長させることにより、前記異なるMIRU座位からの2個以上のMIRU反復エレメントからのヌクレオチド配列を含む増幅産物を得る、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- 順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させることにより、同じ又は異なるMIRU座位からの複数のMIRU反復エレメントのコンカテマー形成を含むコンカテマー増幅産物を得、検出ステップが前記コンカテマー増幅産物を検出することを含む、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- コンカテマー増幅産物が2kbを超える長さである、請求項22に記載の方法。
- コンカテマー増幅産物が11kbを超える長さである、請求項22に記載の方法。
- コンカテマー増幅産物の検出が、前記コンカテマー増幅産物を制限エンドヌクレアーゼで消化し、消化産物を検出することを含む、請求項22〜24のいずれかに記載の方法。
- 順方向プライマー及び/又は逆方向のプライマーが、タグ又は標識を含む、請求項1〜25のいずれかに記載の方法。
- 増幅産物が、
(i)試料を、存在する場合は増幅産物とハイブリダイゼーション複合体を形成するオリゴヌクレオチドプローブと接触させるステップと、
(ii)ハイブリダイゼーション複合体を検出するステップと
を含む方法によって検出される、請求項1〜26のいずれかに記載の方法。 - オリゴヌクレオチドプローブが、5〜30個のヌクレオチドの長さである、請求項27に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドプローブが、
(i)配列番号52〜57から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は
(ii)配列番号52〜57から選択されるヌクレオチド配列における少なくとも8個の連続したヌクレオチドを有する断片
を含む、請求項27又は28に記載の方法。 - 試料が臨床試料である、請求項1〜29のいずれかに記載の方法。
- 試料が痰試料である、請求項30に記載の方法。
- 所望の試料中の結核菌群マイコバクテリア量を定量するためのインビトロの方法であって、
(a)請求項1〜31のいずれかに記載の検出方法を、所望の試料に対して実施するステップと、
(b)前記方法を、予め定められた既知の結核菌マイコバクテリア量の試験試料に対して実施するステップと、
(c)前記所望の試料から検出された増幅産物の量を、前記試験試料から検出された増幅産物の量と比較するステップとを含み、
それにより、所望の試料中の結核菌群マイコバクテリア量を定量する方法。 - 薬物療法の期間中の抗結核菌群マイコバクテリア薬の有効性を決定するためのインビトロの方法であって、
(a)請求項1〜31のいずれかに記載の検出方法を、薬物療法の期間内又は期間前の第1の時点に得られた第1の試料に対して実施するステップと、
(b)前記方法を、薬物療法の期間内又は期間後の1又は複数の後の時点に得られた1又は複数の試料に対して実施するステップと、
(c)第1の試料から検出された増幅産物の量を、1又は複数の後の試料から検出された増幅産物の量と比較するステップとを含み、
それにより、薬物療法の期間中の薬物有効性を決定する方法であって、1又は複数の後の試料から検出された増幅産物の量が、第1の試料から検出された増幅産物の量と比較して減少していることにより、結核菌群マイコバクテリアに対する薬物の有効性が示される方法。 - 結核菌群マイコバクテリア感染症に対するワクチンの有効性を決定するためのインビトロの方法であって、
(a)請求項1〜31のいずれかに記載の検出方法を、ワクチン接種前の第1の時点に患者から得た第1の試料に対して実施するステップと、
(b)前記方法を、結核菌群マイコバクテリアを用いたワクチン接種及び追加接種後の1又は複数の後の時点に患者から得た試料に対して実施するステップと、
(c)第1の試料から検出された増幅産物の量を、1又は複数の後の試料から検出された増幅産物の量と比較するステップとを含み、
それにより、ワクチンの有効性を決定する方法であって、1又は複数の後の試料から検出された増幅産物の量が、第1の試料から検出された増幅産物の量と比較して減少していることにより、結核菌群マイコバクテリア感染症に対するワクチンの有効性が示される方法。 - 18〜30個のヌクレオチドの長さであり、配列番号25〜39から選択されるヌクレオチド配列の相補体である標的ヌクレオチド配列と特異性の高い結合条件下でハイブリダイズする、順方向オリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号47若しくは配列番号48のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号47若しくは配列番号48のヌクレオチド配列における少なくとも20個の連続したヌクレオチドを含有する断片を含む順方向オリゴヌクレオチドプライマー。
- 18〜30個のヌクレオチドの長さであり、配列番号40〜46から選択される標的ヌクレオチド配列と高い特異性の結合条件下でハイブリダイズする、逆方向オリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号49〜51から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号49〜51から選択されるヌクレオチド配列における少なくとも18個の連続したヌクレオチドを含有する断片を含む逆方向オリゴヌクレオチドプライマー。
- 請求項35に記載の順方向プライマーと請求項36に記載の逆方向プライマーとを含む、一対の順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマー。
- 順方向プライマーが配列番号47のヌクレオチド配列を含み、逆方向プライマーが配列番号49のヌクレオチド配列を含む、請求項37に記載の一対の順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマー。
- 試料中の結核菌群に属するマイコバクテリアを検出するためのキットであって、請求項37又は38に記載の一対の順方向及び逆方向のオリゴヌクレオチドプライマー、結核菌群に特異的なヌクレオチド配列を増幅するための試薬及び/又は増幅産物を検出するための試薬を含むキット。
- 増幅産物を検出するための試薬が、前記増幅産物とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項39に記載のキット。
- プローブが、
(i)配列番号52〜57から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又は
(ii)配列番号52〜57から選択されるヌクレオチド配列における少なくとも8個の連続したヌクレオチドを有する断片
を含む、請求項40に記載のキット。 - 増幅産物を検出するための試薬が、前記増幅産物を消化する酵素を含む、請求項39〜41のいずれかに記載のキット。
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