KR100830623B1 - 핵산의 프라이머 기초 멀티플렉스 증폭을 위한 방법 및 키트 - Google Patents

핵산의 프라이머 기초 멀티플렉스 증폭을 위한 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

질병 인자 및 이차 질병 인자의 진단 또는 감별 진단을 위한 새로운 방법이 개시된다. 개시된 방법은 TemPCR이라 칭하여지는 새로운 증폭 전략을 사용하여 핵산 서열이 알려져 있는 어느 질병 인자 및/또는 이차 질병 인자로부터 표적 서열의 민감하고 특이적인 증폭을 가능케 한다. 상기 TemPCR 방법은 (저농도로 존재하는) 검출되어지는 질병 인자 또는 이차 질병 인자에 특이적인 적어도 한 세트의 표적 엔리치먼트 프라이머 및 (고농도로 존재하는) 적어도 한 쌍의 공유 표적 증폭 프라이머를 사용한다. 적어도 한 쌍의 상기 표적 엔리치먼트 프라이머는 상기 표적 증폭 프라이머에 대한 바인딩 서열을 포함한다. 따라서, 상기 TemPCR 방법의 사용은 멀티플렉스 증폭 반응이 멀티플렉스 증폭 파라미터의 실험적인 최적화가 필요없이 수행되도록 한다. 상기 TemPCR 방법과 함께 사용되는 핵산 분리 및 표적 서열의 검출 방법이 또한 개시된다.
감별 진단, 중합효소 연쇄 반응, 증폭, 프라이머, 검출

Description

핵산의 프라이머 기초 멀티플렉스 증폭을 위한 방법 및 키트{METHOD AND KIT FOR PRIMER BASED MULTIPLEX AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACIDS}
본 출원은 2004년 10월 13일에 제출된 국제출원 PCT/US2004/33818의 국내 단계 출원으로, 2003년 10월 13일에 제출된 미국 임시 특허 출원 60/510,762의 우선권을 주장한다.
어떠한 인자의 효과적인 봉쇄 및 조절을 위한 중요한 한 이슈는 그 인자로 감염된 환자의 적시 정밀한 진단이다. 이러한 진단의 일 견지는 감별진단(differential diagnosis)을 포함한다. 감별진단이란 관심대상의 질병 인자에 의해 야기된 질병 상태 또는 컨디션을 갖는 환자, 및 유사한 임상적 징후를 일으키는 하나이상의 2차 인자에 의해 야기된 질병 상태 또는 컨디션을 갖는 환자를 측정하고 확인하는 것을 의미한다. 관심대상의 질병 인자에 의해 야기된 컨디션에서 관찰되는 증상/임상적 징후가 또한 2차 인자에 의해 야기되는 컨디션에서 관찰될 수 있기 때문에 감별진단이 중요하다. 따라서, 오진 가능성은 의미 있는 이슈이다. 이러한 오진은 위양성(false positive), 및 위음성(false negative)을 일으킬 수 있다. 이러한 타입의 각 오진은 질병 인자의 봉쇄 및 조절의 유해한 영향을 갖는다. 예를 들어, 위음성은 감염된 개체가 일반 집단에 질병 인자를 계속해서 퍼뜨리도록 한다. 위음성은 건강관리 시스템 및 불필요한 치료를 받는 것이 요구되는 개체에 증가된 부담을 일으킬 것이다.
위양성 및 위음성은 봉쇄, 조절 및 효과적인 공중 건강 대응을 위해 원인 인 자의 정밀하고 신속한 확인이 요구되는 생물테러의 경우와 특별한 관련이 있을 수 있다. 이러한 위험으로부터 대중을 보호하기 위한 조처를 촉진하기 위해 생물테러의 사용과 관련되어 증가 되는 중요성이 연방 보건국에 촉구되어 왔다. 2002년 2월에, 미국 국립 알레르기-전염병연구소(NIAID)는 CDC 카테고리 A, B 및 C 인자에 대한 바이오디펜스 리서치 아젠다를 발표하였다. 이러한 리서치 아젠다의 목적중 하나는 생물테러에 사용될 수 있는 인자에 대해 적용가능한 진단 시험의 개발이었다. 상기 아젠다에는 "생물테러리스트 위협에 대한 성공적인 대응은 관련된 병원체를 확인할 수 있는 진단법을 필요로 한다. 그러나, 생물 위협으로 간주되는 다수 인자의 초기 임상 신호 및 증상은 비특이적이며 일반 감염과 유사하다. 생물 테러 유기체 또는 독소의 도입을 신속히 확인하는 능력은 고 민감성, 특이성, 저비용성, 사용 간편성 및 일차 의료 세팅에 위치한 진단 도구를 필요로 할 것이다."라고 언급되어 있다.
상술한 문제 및 이슈의 예로 최근의 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)을 들 수있다. SARS의 임상적 증상, 특히 초기 단계는 열, 한기 및 가벼운 내지 심한 기침을 포함한다. 분명히, 이러한 증상은 다른 인자에 의해 야기되는 다수의 컨디션에서 관찰된다. SARS와 유사한 증상을 갖는 컨디션을 일으킬 수 있는 다른 인자는 이에 한정하는 것은 아니나, RSV(호흡기 세포융합 바이러스: respiratory syncytial virus), 파라인플루엔자바이러스 타입 1 및 타입 3, 인플루엔자 A 및 B 바이러스, 엔테로바이러스, 아데노바이러스, 마이코플라즈마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 및 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae)를 포함한다.
질병 인자의 검출에 일반적으로 사용되는 3 종류의 진단 시험이 있다: i) ELISA 시험; ii) 세포 배양법; 및 iii) 분자 시험. 이러한 각 시험은 이들의 고유한 장점 및 단점을 갖는다. ELISA(Enzyme Linked Immunoabsorbant Assay)는 항체 시험이다. 이는 임상적 징후의 시작후 21일까지 환자의 혈청에서 질병 인자에 대한 항체를 신뢰성있게 검출한다. ELISA는 특이적이지만, 그 검출은 질병 관리에 유용하도록 검출하기에는 너무 늦다. 이는 질병 인자의 봉쇄 및 조절에 필요한 상당히 많이 요구되는 초기 정보를 제공할 수 없다.
세포 배양법은 살아있는 인자의 존재를 검출한다. 시료는 질병 인자로 감염된 것으로 의심되는 개체로부터 취해지고 질병 인자는 배양된 세포에서 증식되거나 또는 선별 배지상에서 규정된 조건에 따라 배양된다. 이 방법은 시간-소모적이고, 비용적이고 위험한 작업이나, 단지 이는 살아있는 인자의 존재를 보여주기 위한 수단일 뿐이다. ELISA와 마찬가지로, 상기 시험은 상대적으로 특이적이나 그 검출은 질병 관리에 유용하도록 검출하기에는 너무 늦다.
분자 시험은 일반적으로 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 다수의 변이중 어느 하나를 이용한다. PCR은 질병 인자에 의해 감염된 것으로 의심되는 개체로부터 여러가지 시료(혈액, 대변, 호흡기 분비물 또는 체 조직)에서 인자의 유전 물질을 검출할 수 있다. PCR 시험은 매우 특이적이나, 민감도가 부족하다. 왜냐하면 환자 시료에 인자가 존재하지 않거나, 증폭 및 검출 스킴이 유전 물질을 동정하는데 실패할 수 있기 때문이다. 따라서, 음성 시험은 개체에서 질병 인자의 존재를 배체할 수 없다.
멀티플렉스 PCR은 위치 특이 프라이머 다중 세트를 이용하여 한 반응에서 다중 유기체로부터 표적 서열의 증폭을 가능케 한다. 따라서, 멀티플렉스 PCR은 감별진단에 적합하다. 그러나, 멀티플렉스 PCR법은 제약을 갖는다. 멀티플렉스 PCR법과 관련되어 두가지 주요 문제가 있다. 하나는 증폭되는 각 표적 서열(또는 위치)이 고유의 증폭 효율을 갖는 것이다. 위치 특이 증폭 효율은 프라이머 표적의 조성, 이들의 표적에 대한 프라이머의 결합 친화도, 프라이머의 프라이밍 효율 및 반응 성분의 유용성을 포함하는 다중 인자에 의해 결정된다. 한 반응에서 다중 표적을 결합시키는 것은 여러가지 프라이머 세트간의 불화합성을 일으킬 수 있으며, 이는 일부 증폭 반응의 우선적인 증폭 또는 방해를 일으킨다. 두번째 이슈는 최적 프라이머 대 위치 비율의 확인이다. 만일 프라이머 농도가 너무 높게 설정된 경우, 프라이머 다이머 및 백그라운드 증폭이 일어난다. 하지만, 만일 프라이머 농도가 너무 낮은 경우에는 표적 서열의 원하는 지수적 증폭이 일어나지 않는다.
멀티플렉스 PCR을 최적화하기 위해, 프라이머, 버퍼, dNTPs, 효소, 및 MgCl2의 농도가 각 프라이머 콤비네이션 세트에 실험적으로 결정되는데 필요하다. 이는 각 생성된 분석물에 대해 수행되어야 하는 것이 요구되는 시간 소모적인 공정이다. 완전한 최적화 실험후에도 성공적인 멀티플렉스 PCR은 보장되지 않는다.
본 명세서는 질병 인자의 진단 및/또는 하나이상의 이차 질병인자의 존재하에서 질병 인자의 감별진단을 위한 신속하고, 정밀한 분자 진단법을 제공한다. 간략히 핵산 시료는 질병 인자 및/또는 이차 질병 인자를 함유하고 있는 것으로 의심 되는 시료로부터 얻어지고; 상기 핵산 시료는 DNA 또는 RNA(파지티브 스트랜드 또는 네가티브 스트랜드)이거나 이의 조합일 수 있다. 멀티플렉스 증폭 반응은 한 바이얼에서 한 증폭 반응을 통해 핵산으로부터 미리-결정된 표적 서열을 증폭하는데 사용된다. 표적 서열을 함유하는 증폭 산물은 멀티플렉스 검출 스트레터지를 이용하여 검출 및 구별된다. 질병 인자 또는 이차 질병 인자로부터 표적 서열의 검출은 그 시료내에 존재함을 표시한다. 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여, 질병 인자의 진단 또는 감별 진단이 3시간 정도로 짧은 시간내에 이루어질 수 있다. 고 처리 능력은 각 프라이머 조합에 대해 복잡하고 시간 소모적인 최적화 방법을 필요로 하지 않고 하루에 수백 시료를 분석가능하게 한다. 이러한 방법은 당해 기술분야에 부재한다.
멀티플렉스 분석 시스템(MAS)라고 칭하여지는 본 명세서에 기술된 방법은 질병 인자의 진단 및/또는 질병 인자와 이차 질병인자의 감별진단을 위한 신속하고 편리한 포맷을 제공한다. 본 명세서에 사용된, "인자"는 핵산을 포함하며, 이에 한정하는 것은 아니나 박테리아(리스트 클래스), 바이러스(바이러스는 DNA 게놈, 네가티브 스트랜드 RNA 게놈 또는 파지티브 스트랜드 RNA 게놈을 가질 수 있다) 또는 기생체를 포함하는 감염, 증상 또는 컨디션을 일으키거나 기여하는 형태에 상관없이 어느 유기체를 의미한다. 진단되어지는 것으로 조사되는 질병 인자에 의해 야기된거나 이와 관련된 감염, 증상 또는 컨디션은 본 명세서에서 "질병 상태"로 간주된다. 일 구현으로, 진단되어지기 위해 조사되는 질병 인자 및/또는 질병 상태는 건강 관리 프로바이더 또는 기타 다른 사람에 의해 미리 검출될 것이다. 일 구현으로, NIAID 바이오디펜스 리서치 아젠다에 기술된 잠재적 생물 위협으로 평가되는 유기체와 같이 질병 인자는 생물 무기 프로그램에 포함될 수 있다. 본 명세서에 언급된 바와 같이, MAS가 감별 진단에 사용될 수 있다. 감별 진단이 논의되는 경우, 질병 인자 및 하나 이상의 이차 질병 인자에 대해 레퍼런스가 만들어질 것이다. 본 명세서에 사용된, "이차 질병 인자(들)"는 질병 인자에 의해 야기되거나 기여되는 질병 상태와 유사한 임상적 증상을 나타내는 어느 인자를 의미한다. 결과적으로, MAS를 이용한 감별 진단은 만일 질병 인자가 존재하는 경우 질병 인자의 존재 뿐만 아니라 존재할 수 있는 어느 이차 질병 인자의 존재도 정밀하게 검출할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된, 용어 "핵산 분자(들)", "올리고뉴클레오타이드(들)", 및 "폴리뉴클레오타이드(들)"은 (각각의 종이 특별히 명시될 수 있으나) RNA 또는 DNA(단일 또는 이중 스트랜드, 코딩, 상보적 또는 안티센스), 또는 단일 사슬 또는 듀플렉스 형태의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 RNA/DNA 하이브리드 서열을 포함한다. 용어 "뉴클레오타이드"는 본 명세서에서 단일 스트랜드 또는 듀플렉스 형태의 어느 길이의 RNA, DNA, 또는 RNA/DNA 하이브리드 서열을 포함하는 분자를 설명하는 형용사로 사용된다. 보다 정확하게, 표현 "뉴클레오타이드 서열"은 뉴클레익 물질 자체를 포함하며 이에 따라 특정 DNA 또는 RNA 분자를 생물학적으로 특징짓는 서열 정보(즉, 4 염기 문자중에서 선택된 문자의 연속)에 한정되는 것은 아니다. 용어 "뉴클레오타이드"는 또한 퓨린 또는 피리미딘, 리보스 또는 디옥시리보스 당 부, 및 포스페이트기 또는 올리고뉴클레오타이드나 폴리뉴클레오타이드내에 있는 뉴클레오타이드의 경우 포스포디에스테르 결합을 포함하는 보다 큰 핵산 분자내에서 분자, 또는 개별 유니트를 의미하는 각각의 뉴클레오타이드 또는 여러가지의 뉴클레오타이드를 가리키는 명사로서 본 명세서에 사용된다. 용어 "뉴클레오타이드"는 또한 본 명세서에서 (a) 택일적인 연결기, (b) 유사한 형태의 퓨린, (c) 유사한 형태의 피리미딘, 또는 (d) 유사한 당과 같은 적어도 하나의 변형을 포함하는 "변형 뉴클레오타이드"를 포함하는 것으로 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 합성, 재조합, 생체외 생성, 또는 이의 조합을 포함하는 어느 공지 방법 뿐만 아니라 당해 기술분야에 알려진 어느 정제 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
본 명세서에 기술된 MAS는 여러가지 질병 상태를 일으키거나 기여하는 질병 인자를 검출할 수 있다. 상기 MAS는 만일 특정 질병 인자가 존재하는 경우 이를 검출하고 만일 이차 질병 인자가 존재하는 경우 이를 검출하기위한 감별 진단에 사용될 수 있다. 그러나, MAS는 감별 진단용으로 사용될 필요는 없다. 상기 MAS는 또한 질병 상태와 관련된 유전적 돌연변이의 존재 또는 부재, 단일 뉴클레오타이드 폴리모피즘(SNPs)의 존재 또는 부재를 진단하기위해, 유전자 발현 프로파일링을 측정하기위해 그리고 유전자 투여 돌연변이를 측정하기위해 사용될 수 있다. 상기 MAS의 이러한 택일적인 사용의 적용은 동시 계류중인 미국 특허출원 일련번호 10/284,656에 기재되어 있다. 상기 MAS의 다른 용도는 당해 기술분야의 숙련자에게 인식될 것이다.
상기 MAS는 3 단계를 포함한다: i) 핵산 분리; ii) 표적 서열(들)을 함유하는 질병 인자 또는 이차 질병 인자로부터 핵산 서열을 증폭시키는 멀티플렉스 증폭; 및 iii) 단계 (ii)에서 증폭된 표적 서열의 멀티플렉스 검출. 상기 MAS의 구현으로, RNA(파지티브 및 네가티브 스트랜드 모두) 및 DNA 모두의 연속 분리가 제공된다. RNA 및 DNA 모두의 연속 분리는 질병 인자 및 이차 인자가 다른 핵산 게놈을 가질 수 있기때문에 유리하다. DNA 및 RNA의 이중 증폭없이, 다중 시료가 시험되는데 필요로 할 수 있다. 택일적인 구현으로, 질병 인자 및 이차 질병 인자 각각이 동일한 타입의 핵산 게놈을 갖는 경우, 핵산 분리 단계는 한 타입의 핵산만 분리할 수 있다. 상기 MAS는 상당히 적응적이어서, 멀티플렉스 증폭 단계에 사용되는 적절한 디자인의 프라이머 서열을 통해 새로운 인자와 공지 및 새로운 인자의 돌연변이가 알려지게되는 경우 새로운 인자와 공지 및 새로운 인자의 돌연변이가 포함되는 것을 허용한다. 하기에 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 일 구현으로 MAS에 사용되는 멀티플렉스 증폭 스트레터지는 현재 이용가능한 방법에 비해 여러가지 프라이머간의 불화합성을 감소시키고 멀티플렉스 증폭 반응의 민감도 및 특이성을 증가시키기 위해 독특하고 지금까지 예측하지 못한 방법을 사용한다. 전체 MAS 공정은 3시간정도로 단시간내에 완수될 수 있다.
상기 MAS는 그 적용이 이해될 수 있도록 일반적으로 설명된다. 상기 MAS 방법은 질병 인자를 보유하는 것으로 의심되는 개체로부터 획득된 시료로부터 질병 인자의 존재를 검출하고, 이에 따라 상기 질병 인자에 의해 야기되거나 기여된 질병 상태를 갖는 개체를 확인 및 진단하는데 사용될 수 있다. 상기 MAS는 질병 인자 및 하나이상의 이차 질병 인자를 포함하는 감별 진단에 사용될 수 있다. 상기 MAS는 어느 질병 제제의 존재를 검출하는데 사용될 수 있으나, SARS가 질병 인자인 경우, 및 호흡기 세포융합 바이러스 A 및 B, HPIV 1 및 3, 인플루엔자 A 및 B, 엔테로바이러스, 아데노바이러스 4 및 21, C.뉴모니아에(C. pneumoniae) 및 M.뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)가 이차 질병 인자인 경우 감별 진단을 설명하는 예가 제공된다. 그러나, MAS는 멀티플렉스 증폭의 적절한 디자인을 통해 어느 질병 제제 및 이차 질병 제제의 존재를 검출하는데 이용될 수 있다.
상기 MAS의 여러가지 성분은 이하 보다 상세히 설명된다. 특정 구현은 이러한 성분에 대해 설명되나 동일한 목적을 수행하기위해 당해 기술분야에 알려진 다른 방법은 본 명세서의 견지내에 포함되는 것으로 간주되어야 한다는 것이 인정되어야 한다. 또한, 상기 MAS의 여러가지 구현은 MAS의 목적, 질병 상태의 특성, 및 질병 인자 및 하나이상의 이차 질병 인자의 특성에 따라 아래에 기술된 단계를 수행하는 다른 방법을 이용할 수 있다.
핵산 분리
MAS의 일 구현으로, 한 반응에서 RNA 및 DNA를 모두 분리하는 핵산 분리 단계가 사용된다. 택일적인 구현으로, RNA 및 DNA는 독립적으로 분리된 다음 MAS에 사용되기 위해 혼합될 수 있다. 다른 택일적인 구현으로, 단지 일 타입의 핵산이 분리하는데 필요한 경우(질병 인자 및 관심대상의 이차 질병 인자 모두 동일한 타입의 핵산 게놈을 갖는 것과 같이), RNA 또는 DNA만 분리하는 핵산 분리 방법이 이용될 수 있다. RNA 및 DNA 동시 분리에 대해 여러가지의 기술 및 프로토콜이 알려져 있으며, 각 별도의 분리 및 이러한 기술 및 프로토콜이 이용될 수 있다. 기술된 핵산 분리는 여러가지의 환자 시료 또는 공급원으로부터 핵산을 분리하는데 사용될 수 있다. 환자 시료/공급원의 타입은 이에 한정하는 것은 아니나 비강/인두 면봉, 타액, 가래, 혈청, 전혈 및 대변을 포함한다.
상기 핵산 분리 방법은 하나이상의 다음 요구사항을 만족시킬 수 있다. 우선, 상기 핵산 분리 방법은 환자 시료내에 존재할 수 있는 어느 질병 인자 및 어느 이차 질병 인자를 불활성화시킬 수 있다. 결과적으로, 실험실 및 건강관리에 대한 개인의 위험이 감소된다. 또한, MAS의 나머지 단계는 필요에 따라 엄격한 생물-봉쇄 공정에 대한 요건없이 완수될 수 있다. 또한, 상기 방법은 PCR 및 RT-PCR 저해제 및 분리된 핵산으로부터 다른 원치않는 화합물의 제거를 가능케 한다.
일 구현으로, 환자 시료로부터 RNA 및 DNA의 초기 분리를 위해 트리졸계 시약을 이용한 이중 RNA/DNA 분리 방법이 사용된다. 환자 시료와 접촉시, 페놀 및 트리졸내에 용해된 고염 시약은 환자 시료내에 존재할 수 있는 어느 질병 인자 또는 이차 질병 인자를 효과적으로 불활성화시킨다. 단일 단계로 같은 단계에서 RNA와 DNA의 이중 분리를 가능하게 하기 위해서, 트리졸 용액의 pH는 중성(산성 대신)으로 적정될 수 있다. RNA 및 DNA가 환자 시료로부터 분리된 후, 실리카계 컬럼을 사용하여 RNA 및 DNA를 추가로 분리할 수 있다. 실리카계 컬럼의 사용은 오염 가능성을 최소화하면서 세척 단계가 신속하고 효과적으로 수행되도록 한다. 세척 단계는 PCR 및 RT-PCR 저해제를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 핵산 정제를 위한 컬럼 방법은 이것이 다른 타입의 환자 시료와 사용될 수 있으며 스핀 및 세척 단계는 PCR 또는 RT-PCR 저해제를 효과적으로 제거하기 때문에 유리하다.
일 구현으로, 핵산 분리는 제조자의 지시에 따라 Omega Bio-Tek에 의해 제공되는 이중 RNA/DNA 분리 키트를 이용하여 수행된다. 간략히, 대상 시료 250㎕를 핵산 분리 시약(트리졸 시약) 1ml에 첨가한 다음 클로로포름 250㎕를 첨가한다. 그 혼합물을 보텍싱에 의한 것과 같이 완전히 혼합한다. 시료를 12,000 x g에서 10분간 원심분리하여 수성상과 유기상을 분리한다. 상위의 수성상은 조심스럽게 새로운 1.5ml 원심분리 튜브에 옮겨 담는다. 동등한 볼륨의 70% 에탄올을 첨가하고 그 시료를 보텍싱에 의한 것과 같이 혼합한다. 그 시료를 수집 튜브내 HiBind 스핀 컬럼 세트상에 적용하고 10,000 x g에서 15초간 원심분리한다. 통과물은 버린다. Wash Buffer I 500㎕을 상기 컬럼에 첨가하고 그 컬럼을 15초간 원심분리한다. 상기 컬럼을 Wash Buffer II 500㎕로 2회 각각 15초씩 세척한다. RNase가 없는 물 50㎕을 첨가하고 1분간 최대 속도로 원심분리하여 RNA/DNA를 용출시킨다. 그 다음 상기 핵산 시료는 아래에 기재한 바와 같은 증폭 단계에 사용될 수 있다.
상기 트리졸 방법에 부가적으로, 다른 방법이 RNA 및/또는 DNA를 분리하는데 사용될 수 있다. 택일적인 구현으로, LNA-접합 마그네틱 바가 사용된다. LNA(Locked Nucleic Acids)는 변환된 뉴클레오사이드를 함유하는 핵산류이며, 이의 주요 구별되는 특성은 리보스 고리의 2'-O 와 4'C 원자간에 메틸렌 결합이 존재하는 것이다. DNA 및 RNA(A,T,U,C,G)에서 나타나는 5가지 일반 뉴클레오베이스를 함유하는 LNA 뉴클레오사이드는 왓슨-크릭 룰에 따라 이들의 상보적 뉴클레오사이드와 베이스-페어를 형성할 수 있다. 일반적인 뉴클레오사이드와 LNAs간의 분자적 차이는 LNA 함유 핵산과 LNA를 함유하지 않는 핵산간에 형성된 핵산 듀플렉스의 안정성에 차이를 일으킨다. 전형적으로, 편입된 각 LNA 뉴클레오타이드는 이에 상응하는 DNA/DNA 복합체에 비교하여 2-6℃까지 LNA/DNA 뉴클레오타이드 복합체의 Tm을 증가시킨다. 질병 인자 및 이차 질병 인자의 핵산에 (특이적이거나 비특이적 상호작용을 통해)바인딩할 수 있는 LNA 함유 올리고뉴클레오타이드는 상기 핵산을 분리하기위해 마그네틱 비드에 연결될 수 있다. 상기 LNA-함유 올리고뉴클레오타이드는 질병 인자 또는 이차 질병 인자의 핵산에 바인딩할 것이며; 그 다음은 단순 마그네틱 분리 및 세척 단계에 의해 분리가 이루어질 수 있다. 상기 방법은 또한 PCR 저해제의 제거를 가능케 한다. LNA-함유 올리고뉴클레오타이드/마그네틱 비드 접합체는 멀티플렉스 증폭 단계에 사용하기 위해 PCR 또는 RT-PCR 시약과 직접 혼합될 수 있다. LNA-함유 올리고뉴클레오타이드 마그네틱 비드를 이용하여, 고 체적을 갖는 환자 시료가 효율적으로 프로세싱될 수 있다. 상기 LNA 방법은 상기한 트리아졸 이중 추출법과 함께 사용되거나 혹은 당해 기술분야에 알려진 어느 다른 방법이나 DNA 및/또는 RNA를 분리하는데 있어 본 명세서에 기술된 방법과 함께 사용될 수 있다.
멀티플렉스 증폭
여러가지 멀티플렉스 증폭방법이 MAS와 함께 사용될 수 있다. 다수의 이와 같은 증폭 방법은 당 기술분야에 알려져 있다. 멀티플렉스 증폭 방법은 질병 인자 및 이차 질병 인자에 함유된 핵산 타입에 따라 PCR, RT-PCR 또는 이의 조합을 이용할 수 있다. 예를 들어, 만일 RNA 게놈이 존재하는 경우, RT-PCR이 이용될 수 있다. PCR 및 RT-PCR의 방법론은 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 일 구현으로, 상기 MAS에 사용되는 상기 멀티플렉스 증폭 방법은 독특한 것이다. 이러한 독특한 멀티플렉스 증폭 방법은 표적 엔리치드 멀티플렉스 PCR(Tem-PCR)로 칭하여지며 당 기술분야에 알려진 다른 멀티플렉스 증폭 방법에 요구되는 프라이머 조합 및 증폭 조건의 과도한 실험적 시험없이 질병 인자 및/또는 이차 질병 인자로부터 하나이상의 표적 서열을 충분히 증폭가능케 한다. 본 명세서에 사용된, "표적 서열"은 증폭되어지고 최종적으로 검출되어지는 질병 인자 또는 이차 질병 인자의 뉴클레오타이드 서열이며; 상기 표적 서열은 본 명세서에 기술된 프라이머 세트에 의해 증폭된 보다 큰 핵산 서열내에 함유된다. 증폭을 위한 각 표적 서열은 시료내에 존재하는 경우 (아래에 기술된 바와 같이) 검출시 질병 인자 또는 이차 질병 인자의 확인이 가능하도록 선택된다. (직접 또는 간접적으로 - 하기 참조) 증폭된 표적 서열의 검출은 질병 인자 또는 이차 질병 인자의 존재 및 일치를 나타낼 것이며 이에 따라 관련 질병 상태를 진단할 것이다. 일 구현으로, 단일 표적 서열이 시험되는 각 질병 인자 및 각 이차 질병 인자로부터 증폭을 위해 선택된다. 택일적인 구현으로, 하나이상의 표적 서열이 각 질병 인자 및 각 이차 질병 인자로부터 증폭을 위해 선택된다. 다른 구현으로, 하나이상의 표적 서열이 질병 인자로부터 증폭을 위해 선택되고, 단일 표적 서열이 각 이차 질병 인자로부터 증폭을 위해 선택된다.
Tem-PCR의 원리가 도 1A 및 1B에 설명된다. 도 1A는 표적 서열의 증폭을 위한 3 프라이머 올리고뉴클레오타이드쌍의 사용을 나타낸다. 상기 프라이머 올리고뉴클레오타이드는 Fout(아웃사이드 포워드 프라이머), Fin(인사이드 포워드 프라이머), Rout(아웃사이드 리버스 프라이머), Rin(인사이드 리버스 프라이머), FSP(포워드 수퍼 프라이머) 및 RSP(리버스 수퍼 프라이머)로서 표시된다. 도 1에 나타낸 3 프라이머쌍은 2쌍의 표적 엔리치먼트 프라이머(Fout 및 Rout; 및 Fin, 및 Rin) 및 1쌍의 표적 증폭 프라이머(FSP 및 RSP)를 포함한다. 하기한 바와 같이, 추가의 표적 엔리치먼트 프라이머 및 표적 증폭 프라이머가 필요에 따라 편입될 수 있다. 이러한 구현에서, 표적 엔리치먼트 프라이머, Fout 및 Rout; 및 Fin, 및 Rin는 상기 표적 서열을 함유하는 핵산에 특이적으로 하이브리드화되고 도 1A에 나타낸 바와 같이 상기 표적 서열을 브라켓팅(bracketing)하도록 디자인된다. 따라서, 제1세트의 표적 엔리치먼트 프라이머, Fout 및 Rout은 표적 서열을 함유하는 핵산에 바인딩하고 표적 서열을 브라켓팅한다(Fout 및 Rout중 하나는 표적 서열의 5'상에 혹은 좌측에 존재하며, 나머지는 표적 서열의 3', 또는 우측상에 존재한다). 제2세트의 표적 엔리치먼트 프라이머, Fin 및 Rin은 상기 표적 서열을 함유하는 핵산에 바인딩하고 상기 제1세트의 표적 엔리치먼트 프라이머에 대해 설명된 바와 같이 상기 표적 서열을 브라켓팅한다. 상기 제2세트의 표적 엔리치먼트 프라이머는 도 1A에 나타낸 바와 같이 상기 제1세트의 표적 엔리치먼트 프라이머의 안쪽에 바인딩한다. 이러한 로케이션은 표적 서열에 근접한 것으로 규정된다. 즉, 제2세트의 표적 엔리치먼트 프라이머는 제2세트의 표적 엔리치먼트 프라이머가 제1세트의 표적 엔리치먼트 프라이머와 비교하여 표적 서열에 보다 근접하게 위치되도록 표적 서열을 함유하는 핵산에 바인딩한다.
적어도 하나의 제1 또는 제2 프라이머 엔리치먼트쌍에서 각 프라이머는 이의 5'말단상에 수퍼 프라이머 바인딩 태그를 더욱 포함한다. 상기 수퍼 프라이머 태그는 표적 증폭 프라이머(RSP 및 FSP)의 서열과 동일한 올리고뉴클레오타이드 서열이다. TemPCR 공정도중의 증폭도중에, 상기 수퍼 프라이머 바인딩 태그를 함유하는 프라이머쌍은 적어도 한쌍의 표적 증폭 프라이머(FSP 및 RSP)를 위한 바인딩 사이트를 생성하기위해 이의 컴플리먼트내로 복제되어 표적 서열의 지수적 증폭을 가능케 한다. 도 1A로 나타낸 구현에서, 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍은 수퍼 프라이머 바인딩 태그, 이와 함께 FSP의 서열과 동일한 수퍼 프라이머 바인딩 태그를 함유하는 Fi 및 RSP의 서열과 동일한 수퍼 프라이머 바인딩 태그를 함유하는 Ri를 포함한다. 외부 프라이머는 상기한 바와 같이 이루어지는 작동 원리로 필요에 따라 수퍼 프라이머 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
표적 엔리치먼트 프라이머와 이의 핵산 서열간의 하이브리드화 특이성은 당 기술분야에 알려져 있는 바와 같이 하이브리드화 책임이 있는 프라이머 서열의 길이를 증가시키거나 감소시킴으로써 조절될 수 있다. 일반적으로, 보다 짧은 프라이머 서열은 증가된 특이성을 제공할 것이며, 한편 보다 긴 프라이머 서열은 보다 우수한 하입리드화 효율을 제공할 것이다. 또한, 하이브리드화 책임이 있는 프라이머의 길이를 증가 또는 감소시키는 것은 또한 여러 단계의 TemPCR 증폭 공정도중(하기 참조) 프라이머가 활성적임을 결정할 수 있다. 일 구현으로, 표적 엔리치먼트 프라이머의 길이는 10-50뉴클레오타이드이다. 택일적인 구현으로, 상기 표적 엔리치먼트 프라이머의 길이는 10-40뉴클레오타이드이다. 다른 택일적인 구현으로, 상기 표적 엔리치먼트 프라이머의 길이는 10-20뉴클레오타이드이다. 각 세트의 표적 엔리치먼트 프라이머내의 프라이머는 필요에 따라 다른 길이일 수 있다. 예를 들어, 일 구현으로, 표적 엔리치먼트 프라이머 Fout 및 Rout은 15-25뉴클레오타이드 길이이며, 표적 엔리치먼트 프라이머 Fin 및 Rin은 35-45뉴클레오타이드 길이이다(이러한 길이는 수퍼 프라이머 바인딩 태그를 포함하지 않음).
도 1A 및 1B에서 제1세트의 표적 증폭 프라이머, FSP 및 RSP는 일반 프라이머 서열이며 표적 엔리치먼트 단계도중 증폭되는 핵산의 보편적인 증폭을 위해 사용된다(이는 표적 핵산을 함유한다). 일 구현으로, 표적 증폭 프라이머의 길이는 10-50뉴클레오타이드이다. 택일적인 구현으로, 표적 증폭 프라이머의 길이는 10-40뉴클레오타이드이다. 다른 택일적인 구현으로, 표적 증폭 프라이머의 길이는 10-20뉴클레오타이드이다.
상기 표적 엔리치먼트 프라이머는 표적 서열의 엔리치먼트(즉, 제한된 증폭)를 위해 저농도로 사용되는 반면, 상기 표적 증폭 프라이머는 표적 서열의 지수적 증폭을 위해 고농도로 사용된다. 증폭 및 검출을 위해 어떠한 편의적인 표적 서열이 선택될 수 있기 때문에, 네스티드 프라이머의 서열은 표적 서열을 플랭킹하는 핵산 서열의 특성에 의해서만 지시된다. 따라서, 표적 엔리치먼트 프라이머는 이의 조성에 대해 최소의 제약으로 디자인될 수 있다. (도 1A에서 Fout 및 Rout와 같은)상기 올리고뉴클레오타이드 태그를 함유하지 않는 적어도 한 세트의 네스티드 프라이머의 사용은 초기 역전사 반응의 효율을 증가시킬 수 있다. 다중 세트의 표적 엔리치먼트 프라이머는 표적 서열 엔리치먼트를 제공하기위해 함께 작동하도록 네스티드 프라이머에 대해 보다 많은 기회 및 조합을 허용함으로써 어세이의 민감도 및 특이성을 증진시킬 수 있다. 또한, 상기 표적 엔리치먼트 프라이머는 저농도로 존재하고, 표지되지 않고 그리고 표적 서열의 지수적 증가에 책임이 없기 때문에, 표적 엔리치먼트 프라이머의 디자인은 여러가지 조합의 표적 엔리치먼트 프라이머에 관한 친화성과 관련된 중요한 문제는 일으키지 않는다. 하기한 바와 같이, 지수적 증폭은 수퍼 프라이머에 의해 수행된다. Tem-PCR의 이러한 견지는 추가적인 질병 인자 및 이차 질병 인자를 검출하기 위한 어세이의 단순하고 신속한 변형을 가능케 한다.
도 1A 및 1B에 나타낸 구현은 표적 서열을 함유하는 주어진 핵산을 증폭시키기위한 하나 또는 두 세트의 표적 엔리치먼트 프라이머의 사용을 보여줌에도 불구하고, 2세트 이상의 표적 엔리치먼트 프라이머가 필요에 따라 사용될 수 있다. 일 구현으로, 3-6세트의 표적 엔리치먼트 프라이머가 Tem-PCR 반응에 사용된다. 다른 구현으로, 3-5세트의 표적 엔리치먼트 프라이머가 사용된다. 택일적인 구현으로, 3-4세트의 표적 엔리치먼트 프라이머가 사용된다.
1세트이상의 표적 증폭 프라이머가 또한 사용될 수 있다. 1세트이상의 표적 증폭 프라이머가 사용되는 경우, 다중 세트의 표적 증폭 프라이머의 서열은 지수적 증폭 단계에서 서로 친화적이도록 선택된다. 즉, 다중 세트의 수퍼 프라이머는 증폭된 표적 핵산상의 수퍼 프라이머 바인딩 사이트에 바인딩되고 유사한 증폭 효율을 갖는 경우 유사한 Tms을 공유한다. 다중 표적 증폭 프라이머는 하나 이상의 질병 인자 또는 이차 질병 인자가 다른 타이터/농도로 존재하는 경우에 사용될 수 있다. 만일 타이터에 현저한 차이가 나는 경우, 1세트의 증폭 프라이머만을 이용하여 고 타이터 인자의 우선적인 증폭이 일어날 수 있다. 이는 보다 낮은 타이터로 존재하는 인자에 대해 위음성 진단을 초래할 수 있다. 이러한 편향된 증폭은 다중 세트의 표적 증폭 프라이머를 이용하여 회피될 수 있다. 일 구현으로, 2-8세트의 표적 증폭 프라이머가 사용된다. 택일적인 구현으로, 2-6세트의 표적 증폭 프라이머가 사용된다. 다른 구현으로, 2-4세트의 표적 증폭 프라이머가 사용된다.
상기 표적 증폭 프라이머는 고농도로 사용된다. 만일 한 세트의 표적 증폭 프라이머가 사용되는 경우 표적 증폭 프라이머의 서열은 증폭되어지는 각 표적 서열과 동일하며, 또는 만일 다중 세트의 표적 증폭 프라이머가 사용되는 경우 표적 증폭 프라이머는 증폭되어지는 각 표적 서열과 유사한 증폭 특성을 공유하도록 디자인된다. 일 구현으로, 두가지 모든 표적 증폭 프라이머는 증폭 산물이 하기한 바와 같이 검출 및 조작되어질 수 있는 검출 수단을 포함한다. 택일적인 구현으로, 두 표적 증폭 프라이머중 하나만 검출 수단을 포함한다. 다른 택일적인 구현으로, 표적 증폭 프라이머의 RSP만 검출 수단을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 검출 수단은 화학적 요소, 효소적 요소, 형광 요소, 또는 방사능표지 요소와 같은 당 기술분야에 알려진 어느 요소일 수 있다. 일 구현으로, 상기 검출 수단은 이에 한정하는 것은 아니나 Cy-3 라벨과 같은 형광 요소일 수 있다. 상기 형광 요소는 수퍼 프라이머 서열에 직접 접합되거나 간접적으로 접합될 수 있다. 간접 접합의 경우, 검출 수단은 바이오틴 분자(즉, 화학적 요소)일 수 있으며 형광 요소가 아비딘 또는 스트렙타비딘 분자에 접합될 수 있다. 검출 수단은 하기한 바와 같이 조작될 수 있다.
Tem-PCR 방법에 사용되는 표적 엔리치먼트 프라이머는 네스티드 프라이머 적용에 대한 분야에 일반적으로 알려져 있는 바와 같이 2-단계 PCR 반응에 사용되지 않는다. Tem-PCR에서, 표적 엔리치먼트 프라이머는 1 단계 PCR 반응에 사용된다. 표적 엔리치먼트 프라이머는 저농도로 존재하기 때문에, 표적 엔리치먼트는 표적 증폭 목적보다는 표적-엔리치먼트 목적으로 제공된다. 상기 표적 엔리치먼트 프라이머의 농도는 표적 서열의 지수적 증가에 충분하지 않다. 상기 표적 엔리치먼트 프라이머는 또한 로컬 템플레이트 구조물이 개시되도록 하며 이에 따라 증폭 민감도 및/또는 효율을 증가시킨다. 센스 표적 서열의 지수적 증폭은 FSP 및 RSP를 이용하여 수행된다.
본 명세서에 사용된 "저농도"는 표적 엔리치먼트 프라이머의 농도를 설명하는데 사용된 경우, 주어진 표적 서열(들)의 지수적 증폭에 충분치 않지만 주어진 표적 서열의 표적 엔리치먼트에 충분한 농도를 의미한다. 이러한 저농도는 증폭되어지는 표적 서열을 함유하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열에 따라 달라질 수 있다. 일 구현으로, 표적 엔리치먼트 프라이머의 농도는 0.002μM 내지 0.2μM미만의 범위내이다. 다른 구현으로, 표적 엔리치먼트 프라이머의 농도는 0.002μM 내지 0.15μM 범위내이다. 택일적인 구현으로, 표적 엔리치먼트 프라이머의 농도는 0.002μM 내지 0.1μM 범위내이다. 다른 택일적인 구현으로, 표적 엔리치먼트 프라이머의 농도는 0.002μM 내지 0.05μM 범위내이다. 만일 증폭되어지는 표적 서열을 함유하는 핵산 서열의 특성이 명시된 범위 미만이거나 넘는 표적 엔리치먼트 프라이머의 농도가 지수적 증폭없이 표적 엔리치먼트에 요구되는 경우에 상기 범위를 벗어나는 다른 농도 범위가 사용될 수 있다. 여러가지 표적 엔리치먼트 프라이머가 다른 농도(즉, 비율) 또는 동일한 농도로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "고농도"는 표적 증폭 프라이머(FSP 및 RSP)의 농도를 설명하는데 사용된 경우, 주어진 표적 서열의 지수적 증폭에 충분한 프라이머 농도를 의미한다. 일 구현으로, 표적 증폭 농도는 0.2μM 내지 2.0μM범위내이다. 다른 구현으로, 표적 증폭 프라이머의 농도는 0.2μM 내지 1.0μM범위내이다. 택일적인 구현으로, 표적 증폭 프라이머의 농도는 0.2μM 내지 0.8μM범위내이다. 다른 택일적인 구현으로, 표적 증폭 프라이머의 농도는 0.2μM 내지 0.4μM범위내이다. 만일 증폭되어지는 표적 서열을 함유하는 핵산 서열의 특성이 명시된 범위 미만이거나 넘는 표적 증폭 프라이머의 농도가 지수적 증폭에 요구되는 경우에 상기 범위를 벗어나는 다른 농도 범위가 사용될 수 있다. 수퍼 프라이머가 다른 농도(즉, 비율) 또는 동일한 농도로 사용될 수 있다.
일반적인 방식으로, 주어진 표적 서열의 지수적 증폭을 달성하기위해 0.2μM 범위내 프라이머 농도가 프라이머 농도를 위한 출발점으로 일반적으로 사용된다. 상기 표적 엔리치먼트 프라이머 및 표적 증폭 프라이머는 본 명세서에 기술된 바와 같이 서로 여러가지 비율로 사용될 수 있다.
2세트의 표적 엔리치먼트 프라이머가 사용되는 경우의 증폭도중, 2세트의 표적 엔리치먼트 프라이머는 각각 표적 서열: Fout/Rout; Fout/Rin; Fin/Rout; 및 Fin/Rin을 함유하는 4개의 가능한 증폭 산물을 생성할 것이다. 수퍼 프라이머 바인딩 태그는 도 1A에 Fin 또는 Rin 프라이머와 같은 수퍼 프라이머 바인딩 태그를 포함하는 표적 엔리치먼트 프라이머를 이용하여 증폭된 어느 증폭 산물내로 편입될 것이다. 그러나, 상기 수퍼 프라이머 바인딩 태그는 표적 증폭 프라이머의 서열과 일치하기때문에 이러한 점에서 상기 수퍼 프라이머 바인딩 태그는 표적 증폭 프라이머에 의한 지수적 증폭에 유용하지 않다. 수퍼 프라이머 바인딩 사이트를 생성하기 위해, 수퍼 프라이머 바인딩 태그를 함유하는 증폭 산물은 제1 증폭의 반대 방향으로 두번째로 증폭되어야 한다. (아래에 언급되는) 멀티플렉스 증폭 프로토콜은 증폭 산물내로 수퍼 프라이머 바인딩 태그를 편입하게 하는 다단계 공정을 이용한다. 이러한 단계는 표적 엔리치먼트 단계 및 선택적 증폭 단계로 칭하여진다. 상기 표적 엔리치먼트 단계는 단독으로 사용되거나 혹은 선택적 증폭 단계와 함께 사용될 수 있다. 상기 표적 엔리치먼트 및 선택적 증폭 단계는 표적 엔리치먼트를 위한 이의 하이브리드화 표적에 하이브리드화하기위해 저농도 표적 엔리치먼트 프라이머에 필요한 조건을 제공하도록 최적화된다. 이러한 단계는 표적 증폭 프라이머에 의해 수행되는 지수적 증폭 공정을 위한 기초로 제공되기에 충분히 증폭된 산물을 생성한다. 따라서, 저농도로 사용되는 경우, 표적 엔리치먼트 프라이머는 그 안에 편입된 수퍼 프라이머 바인딩 태그와 함께 표적 특이 서열을 생성할 것이다. 이러한 수퍼 프라이머 바인딩 태그는 표적 서열의 지수적 증폭을 위한 표적 증폭 프라이머에 의해 사용되는 수퍼 프라이머 바인딩 서열을 생성할 것이다. 그 결과물인 증폭 표적 서열은 하기한 바와 같은 표적 특이 리포터(검출자라고도 불리움) 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 검출될 수 있다.
상기 Tem-PCR 증폭 방법의 결과는 표적 엔리치먼트 프라이머에 의한 표적 서열의 특이적 엔리치먼트, 및 수퍼 프라이머 바인딩 태그를 함유하는 증폭 산물의 복제에 의해 제공되는 수퍼 프라이머 바인딩 사이트를 이용하는 상기 표적 증폭 프라이머에 의한 표적 서열의 후속적인 지수적 증폭이다. 각 표적 서열의 지수적 증폭은 하나이상 세트의 표적 증폭 프라이머에 의해 수행되기 때문에, 증폭 조건은 표적 증폭 프라이머만 고려하여 표준화 및 최적화될 수 있다. 따라서, 지수적 증폭 반응 조건의 불화합성은 당 기술분야에 현재 알려진 멀티플렉스 증폭 방법의 경우와 문제되지 않는다.
상기 Tem-PCR 증폭 방법은 표적 증폭 프라이머가 고농도로 존재하기 때문에 감소된 백그라운드를 생성한다. 결과적으로, 프라이머 다이머 형성 및 이와 관련된 현상의 문제가 감소된다. 감소된 백그라운드 뿐만 아니라, 수퍼 프라이머(또는 각 1세트의 수퍼 프라이머)만이 검출용 수단과 접합되기 때문에, 프라이머 다이머 형성이 일어날지라도 이는 리포터 올리고뉴클레오타이드에 의해 검출되지 않을 것이다. 감소된 백그라운드는 위양성 진단 기회를 감소시킬 것이다.
상기 Tem-PCR 증폭 방법에 사용되는 표적 엔리치먼트 프라이머(Fout, Fin, Rout, 및 Rin)의 비율은 변화될 수 있다. 다른 병원체 게놈은 다른 표적 엔리치먼트 프라이머를 필요로 할 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 일부 질병 인자 및 이차 질병 인자는 DNA 게놈 또는 RNA 게놈(파지티브 또는 네가티브 스트랜드)을 포함할 수 있다. 또한, 특히 수퍼 프라이머중 1개만이 검출 수단에 접합되는 경우 표적 증폭 프라이머의 농도가 달라질 수 있다. 타겟 엔리치먼트 프라이머 또는 수퍼 프라이머중 적어도 하나가 1:1과 다른 비율로 사용되는 멀티플렉스 증폭은 비대칭 멀티플렉스 증폭으로 칭하여진다.
여러가지 표적 엔리치먼트 프라이머 및 표적 증폭 프라이머 비율을 사용하여 수행되는 실험에서, 네가티브 스트랜드 RNA 게놈으로부터 유도된 표적 서열의 증가된 증폭은 프라이머 농도 범위에서 일어나는 것으로 측정되었다. 일 구현으로, Fout의 농도는 잔존 표적 엔리치먼트 프라이머의 농도보다 1.0 내지 8배 높았다. 전형적인 비율은 Fout:Fin:Rout:Rin에 대해 4:1:1:1이다. 네가티브 스트랜드 RNA 바이러스에 있어서, 게노믹 네가티브 스트랜드 RNA에 상보적인 파지티브 RNA 스트랜드의 초기 증폭을 제공하기 위해 Fout의 양은 잔존 네스티드 프라이머의 비율이상으로 증가될 수 있다. 일 구현으로, 증가된 증폭은 표적 증폭 프라이머의 농도가 Fout의 농도보다 약 1.25 내지 32배 높은 경우 관찰되었다. 전형적인 비율은 각각 Fout:Fin:Rout:Rin:FSP:RSP에 대해 4:1:1:1:10:40이다. 각각의 표적 증폭 프라이머의 비율은 서로에 대해 달라질 수 있다. 이러한 비대칭적 변화는 검출 단계에서 증가된 민감도를 제공하는 것으로 나타났다(참조 표 4). 일 구현으로, 검출 수단이 편입된 수퍼 프라이머는 다른 수퍼 프라이머보다 높은 농도로 첨가된다. 일 구현으로, RSP는 검출 수단을 함유하며 보다 높은 농도로 첨가된다. 표적 서열의 증가된 증폭은 고농도의 RSP가 FSP의 농보보다 1.25 내지 16배 높은 경우 관찰되었다. 전형적인 비율은 각각 FSP:RSP에 대해 10:40이다.
파지티브 스트랜드 RNA 게놈을 이용한 질병 인자 및 이차 질병 인자로부터 표적 서열의 증폭을 위해, 일 구현으로, Rout의 농도는 잔존 네스티드 프라이머의 농도보다 1.0 내지 8배 높다. 전형적인 비율은 Fout:Fin:Rout:Rin에 대해 1:1:4:1이다. 파지티브 스트랜드 RNA 바이러스에 있어서, Rout의 양은 표적 서열을 함유하는 RNA 스트랜드의 증가된 증폭을 제공하기 위해 잔존 표적 엔리치먼트 프라이머의 비율이상으로 증가될 수 있다. 일 구현으로, 증가된 증폭은 표적 증폭 프라이머의 농도가 Rout의 농도보다 1.25 내지 32배 높은 경우 관찰되었다. 전형적인 비율은 Fout:Fin:Rout:Rin:FSP:RSP에 대해 각각 1:1:4:1:10:40이다. 각각의 표적 증폭 프라이머의 비율은 또한 서로에 대해 달라질 수 있다. 이러한 비대칭적 변화는 검출 단계에서 증가된 민감도를 제공하는 것으로 나타났다(참조 표 4). 일 구현으로, 검출 수단이 편입된 수퍼 프라이머는 다른 수퍼 프라이머보다 높은 농도로 첨가된다. 일 구현으로, RSP가 검출 수단을 함유하고 보다 높은 농도로 첨가된다. 표적 서열의 증가된 증폭은 RSP의 농도가 FSP의 농도보다 1.25 내지 16배 높은 경우에 관찰되었다. 전형적인 비율은 각각 FSP:RSP에 대해 10:40이다.
DNA 게놈을 이용한 질병 인자 및 이차 질병 인자로부터 표적 서열의 증폭을 위해, 부가적인 프라이머 비율이 이용될 수 있다. 일 구현으로, 표적 엔리치먼트 프라이머의 농도는 본질적으로 동등하다. 택일적인 구현으로, Fout 또는 Rout중 하나의 농도는 잔존 네스티드 프라이머 농도보다 1.0 내지 4배 높다. 전형적인 비율은 Fout:Fin:Rout:Rin에 대해 1:1:1:1일 수 있다. 일 구현으로, 증가된 증폭은 표적 증폭 프라이머의 농도가 Rout 농도보다 1.25 내지 128배 높은 경우 관찰되었다. 전형적인 비율은 Fout:Rin:Rout:Rin:FSP:RSP 각각에 대해 1:1:1:1:10:40일 수 있다. 각각의 표적 증폭 프라이머의 비율은 서로에 대해 달라질 수 있다. 이러한 비대칭적 변화는 검출 단계에서 증가된 민감도를 제공하는 것으로 나타났다(참조 표 4). 일 구현으로, 검출 수단이 편입된 수퍼 프라이머는 다른 수퍼 프라이머의 농도보다 높은 농도로 첨가된다. 일 구현으로, RSP는 검출 수단을 함유하고 보다 높은 농도로 첨가된다. 표적 서열의 증가된 증폭은 RSP의 농도가 FSP의 농도보다 1.25 내지 16배 높은 경우에 관찰되었다. 전형적인 비율은 FSP:RSP 각각에 대해 10:40일 수 있다.
1쌍의 표적 엔리치먼트 프라이머만이 사용되는 구현에서, 프라이머는 상기 1쌍의 표적 엔리치먼트 프라이머내에 이에 상응하는 프라이머에 대한 비율이상으로로 제공되는 Fout 또는 Rout 프라이머 비율로 (상기 표적 증폭 프라이머 비율을 포함하는)상기한 바와 같은 다른 비율로 사용될 수 있다. 상기 표적 엔리치먼트 프라이머의 농도는 본질적으로 동등하다.
택일적인 설명으로 한정하려는 것은 아니나, 표적 엔리치먼트 프라이머의 농도가 증가함에 따라, 표적 서열은 검출 수단없이 증폭되며, 리포터 올리고뉴클레오타이드에 바인딩하는 것을 완수할 수 있으며, 여기서 상기 표적 서열은 FSP 및/또는 RSP에 의해 증폭되는 검출 수단을 포함한다. 상기 표적 증폭 프라이머를 이용한 비대칭 증폭은 또한 검출 수단을 함유하는 수퍼 프라이머가 보다 높은 농도로 사용되는 경우 표적 서열 및 검출 수단을 함유하는 보다 높은 증폭 산물이 생성되기 때문에 증폭 효율 및 민감도를 증가시킬 수 있으며, 검출에 유용하다. 표 1은 Fout, Fin, 및 Rin 뿐만 아니라 FSP 및 RSP의 농도에 대한 한 세트의 전형적인 비율을 제공한다.
상기한 바와 같이, 표적 증폭 프라이머는 각 표적 서열의 지수적 증폭에 사용된다. 표적 증폭 프라이머의 서열은 어느 공지된 GenBank 서열과 명백한 상동성을 공유하지 않도록 선택된다. 또한, 표적 증폭 프라이머의 서열은 효율적인 증폭 반응을 제공하기위해 증폭 산물내 수퍼 프라이머 바인딩 사이트에 대한 바인딩시 유사한 Tm을 공유하도록 선택된다. 최종적으로, 표적 증폭 프라이머의 서열은 열 안정성 DNA 폴리머라아제에 대한 프라이밍 능력이 증폭되어지는 각 표적 서열에 특이적인 표적 엔리치먼트 프라이머보다 우수하도록 선택될 수 있다.
멀티플렉스 증폭은 당 기술분야에 알려진 표준 방법에 따라 수행된다. 일 구현으로, RT-PCR이 증폭 단계로서 사용된다. PCR 효소는 Taq 폴리머라아제와 같이 역전사 및 폴리머라아제 기능 모두를 갖는 효소일 수 있다. 또한, PCR 효소는 당 기술분야에 알려진 바와 같이 "핫 스타트"가 가능하다. RT-PCR 또는 PCR에 대한 조건은 당 기술분야에 알려져 있다. 그러나, 본 출원인은 TemPCR 방법을 함께 사용하도록 디자인되는 최적화된 RT-PCR 및 PCR 조건 세트를 만들었다. 정확한 시간 및 온도는 목적을 완수하기위해 당 기술분야의 숙련자에게 알려져 있는 대로 하기한 바와 같이 달라질 수 있다. 일 구현으로, RT-PCR 또는 PCR 조건은 다음과 같다. 하기 방법은 표적 엔리치먼트 기능을 제공하는 일차 증폭 반응 및 표적 증폭 기능을 포함하는 이차 증폭 반응에 대한 한 세트의 일차 증폭 조건을 포함한다. 증폭을 위한 인자를 함유하는 시료는 다음과 같이 프로그램된 열순환 반응기에 넣어진다: (i) 역전사 - 50℃에서 30분; (ii) 초기 PCR 활성화 - 95℃에서 15분; (iii) 3단계 사이클링(표적 엔리치먼트)을 포함하는 일차 증폭 반응 - 92-94℃에서 0.5-1분, 50-55℃에서 1-2.5분 및 70-72℃에서 0.5-1분; 적어도 2 완전 사이클, 바람직하게 10-15 완전 사이클; (iv) 이차 3단계 사이클링(표적 증폭)을 포함하는 이차 증폭 반응 - 92-94℃에서 15-30초, 50-55℃에서 15-30초 및 70-72℃에서 15-30초; 적어도 2 완전 사이클, 바람직하게 10-40 완전 사이클; 및 (v) 최종 익스텐션 - 72℃에서 3분.
단계 (i)는 질병 인자 및/또는 이차 질병 인자의 핵산이 DNA가 아닌 경우에 역전사 반응이 일어나도록 한다. 단계 (ii)는 PCR 효소 기능의 활성화가 일어나도록 한다. 이러한 기술은 "핫 스타트" PCR로 알려져 있으며, 여기서 보다 낮은 온도(50℃)에서 PCR 효소 기능은 역전사 반응을 수행하는 것에만 능력이 있으나, 보다 높은 온도에서 PCR 효소 기능은 폴리머라아제 기능도 가능하다. PCR 효소 기능의 배양은 폴리머라아제 기능의 억제를 완화시키는데 필요하다. 단계 (iii)에서 일차 증폭은 표적 엔리치먼트 프라이머가 이의 표적에 하이브리드되고 표적 엔리치먼트 단계를 프라이밍하도록 디자인된다. 알 수 있는 바와 같이, 표적 엔리치먼트 프라이머가 이의 표적에 하이브리드되도록 추가시간이 허용된다(단계 (iv)에서 50-55℃에서 15초에 비해 50-55℃에서 2.5분). 표적 엔리치먼트 프라이머가 보다 낮은 농도로 사용되기 때문에 증가된 시간이 사용된다. 단계 (iv)에서 표적 증폭 반응은 표적 증폭 프라이머(고농도로 존재함)를 이용한 지수적 증폭 단계이다. 표적 증폭 프라이머는 고농도로 존재하기때문에, 표적 증폭 프라이머와 표적간의 증가된 하이브리드 시간이 요구되지 않는다. 단계 (v)는 전체 이중 스트랜드 증폭 산물을 생성하기 위한 최종 익스텐션 단계이다. 단계 (v)는 임의적이며 포함될 필요는 없다.
택일적인 구현으로, RT-PCR 또는 PCR 조건은 다음과 같다. 증폭을 위한 인자를 함유하는 반응 튜브는 다음과 같이 프로그램된 열순환 반응기에 넣어진다: (i) 역전사 - 50℃에서 30분; (ii) 초기 PCR 활성화 - 95℃에서 15분; (iii) 일차 3단계 사이클링(표적 엔리치먼트)을 포함하는 일차 증폭 반응 - 92-94℃에서 0.5-1분, 50-55℃에서 1-2.5분 및 70-72℃에서 0.5-1분; 적어도 2 완전 사이클, 바람직하게 10-15 완전 사이클; 및 이차 2단계 사이클링(선택적 증폭) - 92-94℃에서 15-30초, 70-72℃에서 1-2분; 적어도 2 완전 사이클, 바람직하게 4-8 완전 사이클; (iv) 삼차 3단계 사이클링(표적 증폭)을 포함하는 이차 증폭 반응 - 94℃에서 15-30초, 50-55℃에서 15-30초 및 72℃에서 15-30초; 적어도 2 완전 사이클, 바람직하게 10-40 완전 사이클; 및 (v) 최종 익스텐션 - 72℃에서 3분.
이러한 구현에서, 상기 여러 단계의 기능은 상기한 바와 같다. 그러나, 일차 증폭 반응은 추가 3단계 사이클링 공정을 포함하며, 이는 수퍼 프라이머 바인딩 태그를 포함하는 증폭 산물의 생성을 증가시키고, 최종적으로 수퍼 프라이머 바인딩 사이트를 함유하는 증폭 산물을 증가시키기 위해 첨가된다. 추가된 3단계 사이클링 공정에서, 하이브리드 온도는 (단계 (iii)에서 50-55℃에 비하여) 70-72℃로 증가된다. 하이브리드 시간은 또한 상기한 바와 같이 그 표적에 하이브리드되는 기회를 저농도 표적 엔리치먼트 프라이머에 제공하기위해 증가된다. 이러한 증가된 하이브리드 온도는 특정 길이의 표적 엔리치먼트 프라이머만 그 표적에 하이브리드되기에 충분히 안정하도록 허용한다. 이러한 구현에서, Fout 및 Rout 프라이머는 20뉴클레오타이드이하의 길이를 갖도록 선택되며, Fin 및 Rin 프라이머(이러한 구현에서 상기 수퍼 프라이머 바인딩 태그를 포함함)는 적어도 30-40뉴클레오타이드 길이이다. 따라서, Fout 및 Rout 프라이머는 70-72℃에서 열 안정적이지 못하며, 이는 이의 표적에 하이브리드되지 않음을 의미한다. 그러나, 증가된 길이의 Fin 및 Rin 프라이머는 이러한 프라이머가 70-72℃에서 열 안정적이도록 확실히 해주며 이의 표적에 하이브리드할 것이다. 선택적인 증폭 단계에서, Fin 및 Rin 프라이머는 Fin 및 Rin 프라이머(표적 엔리치먼트 단계에서, Fin 및 Rin 프라이머)를 포함하는 초기 증폭 산물의 반대 방향으로 증폭에 의해 생성된 초기 세트의 증폭 산물내에서 상보적인 서열에 이의 전체 길이에 따라 하이브리드된다. 상기 Fin 및 Rin 프라이머는 수퍼 프라이머 바인딩 태그를 함유하는 증가된 양의 증폭 산물을 생성하며, 이는 단계 (v)에서 지수적 증폭의 양을 증가시킨다. 따라서, 단계 (iv)는 수퍼 프라이머 바인딩 태그를 함유하는 증폭 산물을 생성하는 방향으로 편향된 선택적인 증폭 단계이다. 이러한 선택적인 증폭은 보다 높은 GC 함량을 설계할 필요없이 혹은 열 안정성을 증가시키기위해 변형된 뉴클레오타이드를 사용할 필요없이 완수된다. 그 다음 단계 (iv)의 증폭 산물은 상기한 바와 같이 지수적 증폭이 이루어진다.
멀티플렉스 검출
확고한 표적 서열 멀티플렉스 증폭 방법은 민감하고 특이적인 멀티플렉스 검출을 위한 기초를 제공한다. MAS에 사용되는 멀티플렉스 검출 방법은 증폭된 표적 서열의 검출시 균형된 민감도 및 특이성을 제공하도록 멀티플렉스 증폭을 보완한다. 민감도 및 특이성은 성공적인 진단 시험 또는 감별 진단 시험에 중요한 이슈이다.
MAS에 사용되는 멀티플렉스 검출 방법은 직접 또는 간접 멀티플렉스 검출 방법일 수 있다. 표적 서열의 특성은 직접 혹은 간접 검출이 사용되는지를 부분적으로 결정한다. 예를 들어, 만일 표적 서열이 서로 광범위한 상동성을 공유하지 않는 경우, 요구되는 민감도 및 특이성은 리포터 올리고뉴클레오타이드를 직접적으로 표적 서열에 하이브리드함으로써 얻어질 수 있다. 예를 들어, 질병 인자를 위한 진단 시험 또는 질병 인자 및 적어도 하나의 이차 질병 인자에 대한 감별 진단 시험에서, 멀티플렉스 증폭은 질병 인자 및 이차 질병 인자로부터 증폭된 각 표적 서열이 광범위한 상동성을 공유하지 못하도록 디자인될 수 있어 따라서, 직접 검출이 사용될 수 있다. 그러나, 증폭된 표적 서열이 서로 광범위한 상동성을 공유하는 경우, 요구되는 민감도 및 특이성이 확보되도록 상동적인 서열간에 추가 식별을 첨가하기 위해 부가적인 단계가 멀티플렉스 검출 단계에 편입될 수 있다. 예를 들어, 개체의 대립유전자에서 하나이상의 단일 뉴클레오타이드 폴리모피즘의 존재를 검출하는 진단 시험에서, 직접 하이브리드는 단지 하나의 뉴클레오타이드에 의해 달라지는 표적 서열을 특이적으로 검출하는데 필요한 대립유전자 식별을 제공할 수 없다. 이러한 경우, 간접 검출 방법이 부가적인 식별력을 첨가하기위해 사용될 수 있다.
도 2는 직접 검출 방법의 구현을 보여준다. 멀티플렉스 증폭 반응으로부터 표적 서열(6)을 함유하는 증폭된 핵산(1)이 검출용으로 제공된다(증폭 공정은 본 명세서에 기술된 Tem-PCR일 수 있다). 공지된 표적 서열(6)에 특이적인 하이브리드 도메인(3)을 포함하는 리포터 올리고뉴클레오타이드(2)가 제공되며 제1신호 생성 수단(4)에 접합된다. 제1신호 생성 수단은 검출가능한 제1신호를 생성할 수 있다. 제1신호 생성 수단(4)은 검출 단계에 사용된 기술 플랫폼에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 만일 Luminex 플랫폼이 검출 단계에서 기술 플랫폼으로 사용된 경우, 제1신호 생성 수단(4)은 도 2에 나타낸 바와 같은 내부적으로 색 암호화된 스펙트럼 어드레서블 마이크로스피어일 수 있다. 아래에 설명된 직접 검출 방법에 대한 변형이 동시계류중인 미국 출원 일련 번호 10/284,656에 기술되어 있으며, 이러한 변형의 실행은 당 기술 분야의 통상의 기술을 가진 자에게 자명하다.
리포터 올리고뉴클레오타이드(2)는 상기 멀티플렉스 증폭 단계에 의해 제공된 특정 표적 서열(6)에 특이적으로 하이브리드되도록 디자인된다. 리포터 올리고뉴클레오타이드(2)와 표적 서열(6)간의 하이브리드 특이성은 리포터 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드 도메인(3)의 길이를 증가 혹은 감소시킴으로써 조절될 수 있다. 일반적으로, 보다 짧은 하이브리드 도메인(3)은 증가된 특이성을 제공할 것이며 표적 서열(6)과 하이브리드 도메인(3)간의 미스매치와 같은 식별은 하이브리드 효율에 대해 현저한 영향을 나타낼 것이다. 보다 긴 하이브리드 도메인(3)은 보다 적은 특이성을 제공하지만 보다 높은 하이브리드 효율을 제공하여, 따라서 증가된 민감도를 제공할 것이다. 표적 서열(6)의 특성은 하이브리드 도메인(3)의 조성에 영향을 줄 것이다. 당 기술분야의 통상의 기술을 가진 자는 표적 서열(6)에 하이브리드 도메인(3)의 바인딩에 대한 원하는 특이성 및 민감도를 달성하기 위해 하이브리드 도메인(3)의 파라미터를 변경할 수 있다. 일 구현으로, 하이브리드 도메인(3)은 10-50bp길이이다. 택일적인 구현으로, 하이브리드 도메인(3)은 20-40bp길이이다. 다른 택일적인 구현으로, 하이브리드 도메인(3)은 15-25bp길이이다.
하이브리드 도메인(3)을 통해 공지 표적 서열에 특이적으로 하이브리드되는 각 리포터 올리고뉴클레오타이드(2)는 (색 암호 비드와 같은) 알려진 제1신호 생성 수단(4)과 관련될 것이다. 따라서, 제1신호 생성 수단(4)의 정체를 검출함으로써 표적 서열(6)의 정체가 검출될 수 있으며, 이에 따라 질병 인자 또는 이차 질병 인자의 정체가 검출될 수 있다.
표적 서열(6)을 함유하는 증폭된 핵산(1)은 멀티플렉스 검출 단계 전 혹은 도중에 필요에 따라 변성될 수 있다. 변성이 요구되는 것은 아니다. (40:10 비와 같이 FSP보다 높은 농도로 RSP가 존재하는 것과 같은) 비대칭 증폭 조건을 이용한 TemPCR 증폭 반응은 변성이 요구되는 단계가 아닌 검출 반응을 위해 충분한 단일 스트랜드 증폭 산물을 생성한다. 본 명세서에 언급된 이러한 단계 및 다른 단계에서 변성은 충분한 온도로 열을 가하거나 화학 수단(이에 한정하는 것은 아니나 5N NaOH와 같은 제제의 첨가와 같은)에 의해 일어날 수 있다. 다음 구현에 있어서, 표적 서열(6)을 함유하는 증폭 핵산(1)의 변성은 사용되지 않았다. 그러나, 다음 단계에 구현된 원리는 변성 단계가 부가되더라도 달라지지 않을 것이다.
리포터 올리고뉴클레오타이드(2)는 적절한 하이브리드 버퍼(1X TMAC 또는 1X TE와 같은)내에 존재하는 변성 증폭 핵산(1)에 첨가된다. 리포터 올리고뉴클레오타이드(2)의 첨가는 변성(만일 이용되는 경우) 전 혹은 후에 일어날 수 있다. 리포터 올리고뉴클레오타이드(2)는 핵산-리포터 올리고뉴클레오타이드 복합체(I)를 형성하는 하이브리드 도메인(3)을 통해 증폭 핵산(1)상의 표적 서열(6)에 바인딩한다. 하이브리드 조건은 52℃에서 15분간 배양하는 것과 같이 당 기술 분야에 알려져 있다. 하이브리드가 완료된 후, 복합체 I은 원심분리에 의한 것과 같이 분리되고, 바인딩되지 않은 리포터 올리고뉴클레오타이드(2) 및 바인딩되지 않은 증폭 핵산(1')은 제거된다. 그 다음 복합체 1은 적절한 검출 플랫폼을 이용하여 검출될 수 있다. 일 구현으로, 제1신호 생성 수단(4)은 내부적으로 색 암호화된 스펙트럼 어드레서블 비드(Luminex)이며 상기 Luminex 플랫폼은 검출용으로 사용된다. Luminex 플랫폼은 제1신호 생성 수단(4)을 자극하여 검출가능한 제1신호를 생성한다. 제1신호는 기록되고 해석된다. 제1신호 생성 수단(4) 및 생성된 제1신호는 리포터 올리고뉴클레오타이드(2)에 의해 바인딩된 표적 서열(6)의 정체를 검출하는데 사용된다. 표적 서열(6)이 확인되면, 검출된 질병 인자 또는 이차 질병 인자의 정체가 알려진다.
그러나, 증폭 핵산(1)은 FSP 또는 RSP중 적어도 하나에 의해 제공된 검출 수단(8)을 함유할 수 있다. 이러한 검출 수단(8)은 상기한 바와 같을 수 있으며 증폭 핵산(1)에 직접 혹은 간접적으로 접합될 수 있다. 도 2에서, 표적 증폭 프라이머중 하나에 의해 제공된 바이오틴 분자가 검출 수단(8)으로 나타내어진다. 검출 수단(8)은 검출가능한 제2신호를 생성할 수 있는 제2신호 생성 수단을 편입하는데 사용될 수 있다. 일 구현으로, 제2신호 생성 수단(10)은 형광 표지, 화학 표지, 효소적 표지 또는 방사능 표지와 같은 검출가능한 표지가 바인딩된 스트렙타비딘 분자일 수 있다. 적절한 형광 표지는 이에 한정하는 것은 아니나 PE 또는 cy-3를 포함한다. 일 구현으로, 제2신호 생성 수단(10)은 스트렙타비딘-PE 복합체이다. 택일적인 구현으로, 제2신호 생성 수단(10)은 검출 수단의 성분으로서 증폭 핵산 산물에 직접 접합될 수 있다. 제2신호 생성 수단(10)은 핵산-리포터 올리고뉴클레오타이드 복합체에 첨가되고 바인딩되도록 배양하여 복합체 (II)를 형성한다. 일 구현으로, 배양은 52℃에서 5분간이나, 다른 시간 및 온도가 당 기술분야에 알려져 있는 바와 같이 사용될 수 있다.
그 다음 복합체 (II)는 적절한 플랫폼을 이용하여 분석될 수 있다. 일 구현으로, 제1신호 생성 수단(4)은 내부적으로 색 암호화된 스펙트럼 어드레서블 비드(Luminex)이며 제2신호 생성 수단(10)은 형광 PE 표지이다. 이러한 구현에서, Luminex 플랫폼은 검출용으로 사용된다. Luminex 플랫폼은 제1(4) 및 제2(10) 신호 생성 수단을 자극하여 각각 검출가능한 제1 및 제2 신호를 생성한다. 제1 및 제2신호 생성 수단은 제1 및 제2신호가 각각 다른 하나의 존재하에 검출될 수 있도록 선택된다. 제1 및 제2신호가 기록되고 해석된다. 제1신호 생성 수단 및 생성된 제1신호는 리포터 올리고뉴클레오타이드(2)에 의해 바인딩된 표적 서열(6)의 정체를 검출하는데 사용된다. 제2신호 생성 수단(10) 및 제2신호는 (어느 프리 리포터 올리고뉴클레오타이드(2)로부터 신호 생성을 억제하기위해) 리포터 올리고뉴클레오타이드(2)와 함께 표적 서열(6)의 존재를 확인하는데 사용된다. 표적 서열(6a)이 확인되면, 검출된 질병 인자 또는 이차 질병 인자의 정체가 알려진다. 그러나, 복합체 I은 상기한 바와 같이 검출될 수 있음에 유의바란다.
부가적인 기술 플랫폼이 또한 직접 검출 단계에 사용될 수 있다. 택일적인 구현으로, 리포터 올리고뉴클레오타이드상의 제1신호 생성 수단은 적절한 검출 및 분석 장치에 배치되는 경우 검출가능한 물리적 제1신호를 생성할 수 있다. 물리적 신호는 색 변화, 여기시 주어진 광 파장의 방출 또는 전도성과 같은 전기적 특성의 변화, 또는 전자성 또는 화학 특성의 변화일 수 있다. 다른 물리적 신호가 또한 사용될 수 있다. 일 구현으로, 제1신호 생성 수단은 고형 지지체상에 로케이션과 같이 그대로 배치될 수 있다. 예를 들어, 리포터 올리고뉴클레오타이드는 칩 또는 다른 고형 지지체와 같은 수집 수단상에 알려진 로케이션으로 공간적으로 용해될 수 있다. 따라서, 제1신호는 그대로 배치된다. 표적 서열을 함유하는 증폭 산물이 리포터 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드되는 경우, 그 바인딩은 증폭 핵산상에 제2신호 생성 수단에 의해 생성된 제2신호의 존재에 의해 검출될 수 있다. 제2신호의 공간적 로케이션(제1신호)을 검출함으로써, 표적 서열 및 질병 인자/이차 질병 인자의 정체가 검출된다. 택일적인 구현으로, 리포터 올리고뉴클레오타이드는 하나는 공간적이고 하나는 비-공간적인 두개의 제2신호가 생성되도록 부가적인 제1신호 생성 수단에 결합될 수 있다. 따라서, 제2신호 생성 수단에 의해 생성되는 제2신호는 리포터 올리고뉴클레오타이드에 대한 표적 핵산의 바인딩을 신호할 것이다. 택일적인 구현으로, 리포터 올리고뉴클레오타이드에 대한 표적 서열의 바인딩은 (이에 한정하는 것은 아니나 전도성과 같은 전기적 특성의 변화를 포함하는) 리포터 올리고뉴클레오타이드의 특성에 있어서 검출가능한 변화를 생성할 수 있다. 그 다음 이러한 특성 변화는 제2신호로 제공된다.
간접 검출 프로토콜의 일 구현으로, ROCASH(Reporter Oligo Capturing After Specific Hybridization)으로 불리우는 새로운 방법이 사용된다. ROCASH 방법은 동시 계류중인 미국 특허 출원 일련번호 10/284,656에 기술되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다. 명쾌하게 하기 위하여, Luminex X-Map 기술을 이용한 ROCASH 방법이 기술된다. 다른 간접 검출 방법이 또한 당 기술분야에 알려져 있는 바와 같이 사용될 수 있다. 미국 특허 출원 일련번호 10/284,656에 기술된 바와 같은 ROCASH 방법의 변형이 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 종래 기술 방법과 달리, ROCASH 방법에서 리포터 올리고뉴클레오타이드와 표적 서열간의 하이브리드 특이성 및 표적 서열의 검출 민감도는 다른 단계의 ROCASH 방법에서 하이브리드되는 리포터 올리고뉴클레오타이드의 다른 핵산 서열에 의해 제공된다. 따라서, 이러한 중요한 단계를 위한 조건은 검출 단계에서 증가된 특이성 및 민감도를 제공하기 위해 서로 독립적으로 최적화될 수 있다.
Luminex xMAP 기술 및 관련 기술은 당 기술 분야 및 미국 특허 번호 6,524,473, 6,514,295, 6,449,562, 6,411,904, 6,366,354, 6,268,222, 6,139,800, 6,057,107, 6,046,807 및 5,736,330에 기술되어 있다. xMAP 기술은 표적 특이 포획제(하기한 바와 같이 cRTs로 칭하여짐)에 공유결합된 다수의 내부적으로 색 암호화된 마이크로스피어를 사용한다. 이러한 포획제는 올리고뉴클레오타이드일 수 있으나(하기 cRTs의 경우에서와 같이), 또한 리젼 태그와 특이적으로 상호작용하도록 디자인된 폴리펩타이드 또는 화학부일 수 있다. 택일적인 포획제가 사용되는 경우, 리포터 올리고뉴클레오타이드상의 리젼 태그는 상보적인 바인딩 파트너를 제공하기위해 변경될 수 있다. 내부 색 암호는 Luminex 플랫폼에 의해 여기시 각 비드 세트에 대해 독특한 신호를 생성한다.
ROCASH 방법은 두개의 주 성분을 포함하는 것으로 간주될 수 있다: (i) 리포터 올리고뉴클레오타이드; 및 (ii) 수집 수단. 리포터 올리고뉴클레오타이드는 상기 멀티플렉스 증폭 단계에 의해 제공된 표적 서열에 특이적으로 바인딩되도록 디자인된다. 리포터 올리고뉴클레오타이드는 표적 서열에 하이브리드되도록 디자인된 가변 길이의 하이브리드 도메인(특이성 및 민감도에 대한 하이브리드 도메인 길이의 영향과 관련되어 상기 언급한 내용 참조), 수집 수단에 대한 하이브리드를 위한 리젼 태그로 칭하여지는 핵산 서열, 및 제1신호 생성 수단을 포함한다. 일 구현으로, 리포터 올리고뉴클레오타이드상의 리젼 태그는 각 하이브리드 도메인에 대해 독특하다. 즉, 표적 서열 "A"에 바인딩하는 하이브리드 도메인을 갖는 리포터 올리고뉴클레오타이드 및 표적 서열 "B"에 바인딩하는 하이브리드 도메인을 갖는 리포터 올리고뉴클레오타이드는 다른 리젼 태그를 가질 것이다. 수집 수단은 이러한 구현에서 cRTs로 칭하여지는 다수의 포획제(상보적인 리젼 태그) 및 제2신호 생성 수단을 포함한다. cRTs는 리포터 올리고뉴클레오타이드에 함유된 리젼 태그에 상보적인 핵산 서열이다. 제1 및 제2 신호 생성 수단은 검출 플랫폼에 사용된 기술의 특성에 따라 달라질 수 있다. Luminex X-Map 기술을 이용하는 경우, 제1신호 생성 수단은 PE 또는 cy-3와 같은 형광 태그일 수 있으며, 제2신호 생성 수단은 내부적으로 색 암호된, 스펙트럼 어드레서블 마이크로스피어일 수 있다. 리포터 올리고뉴클레오타이드와 수집 수단의 cRTs의 상호작용을 통해, 각 리포터 올리고뉴클레오타이드(하이브리드 도메인에 의해 알려진 표적 서열에 특이적인)는 알려진 제2신호 생성 수단(색 암호 Luminex 비드와 같은)과 연결될 것이다. 따라서, 제2신호 생성 수단의 정체를 검출함으로써, 표적 서열의 정체가 검출될 수 있으며, 이는 질병 인자 또는 이차 질병 인자의 확인을 가능케 한다. 따라서, 특이성은 리포터 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드 도메인과 표적 서열간의 하이브리드에 의해 달성되며(특이성은 하이브리드 도메인의 길이를 감소 혹은 증가시킴으로써 변화될 수 있음에 주의 바람), 민감도는 리포터 올리고뉴클레오타이드의 리젼 태그와 수집 수단의 cRT간의 하이브리드에 의해 검출된다. 증폭된 핵산 서열과 상호작용하도록 디자인된 정제 수단이 또한 사용될 수 있으며, 아래에 기술한 바와 같이 사용하지 않은 증폭 표적 핵산의 제거에 도움된다.
ROCASH 방법의 일 구현을 도 3에 나타내었다. 멀티플렉스 증폭 반응으로부터 표적 서열(6a)을 함유하는 증폭 핵산(1a)은 검출용으로 제공된다(증폭 공정은 본 명세서에 기재된 Tem-PCR 공정일 수 있다). 표적 서열(6a)을 함유하는 증폭 핵산(1a)은 필요에 따라 변성될 수 있다. 그러나 변성 단계는 임의적이다. 도 3은 변성후 증폭 핵산(1a)을 보여준다. 상기한 바와 같이, 증폭 핵산의 역 스트랜드는 FSP 또는 RSP중 적어도 하나에 의해 제공되는 검출 수단(8a)을 함유할 것이다. 이러한 검출 수단(8a)은 FSP 및/또는 RSP 또는 상기한 바와 같이 당 기술 분야에 알려진 바와 같은 다른 수단에 결합된 바이오틴 분자일 수 있다. 정제 수단(9a)은 검출 수단(8a)과 상호작용하도록 선택된다. 일 구현으로, 정제 수단(9a)은 스트렙타비딘에 접합된 자기 비드(Dynal270 자기 비드와 같은)이며 검출 수단(8a)은 바이오틴 표지이다. 정제 수단(9a)은 증폭 핵산(1a)에 첨가되며, 이는 검출 수단에 바인딩하여 핵산-정제 수단 복합체(복합체 I)을 형성한다. 복합체 I은 세정되어 바인딩되지 않은 핵산 및 잔존 성분이 제거되고 당 기술분야에 알려지고 상기 정제 수단과 호환적인 분리 기술을 이용하여 분리된다. 정제 수단이 자기 비드인 경우, 자기 분리 기술이 사용될 수 있다. 1X TMAC 또는 1X TE와 같은 하이브리드 버퍼가 복합체 I에 첨가되어 하이브리드용으로 제조된다.
그 다음 리포터 올리고뉴클레오타이드(2a)가 복합체 I에 첨가된다. 리포터 올리고뉴클레오타이드는 이전 단계에 첨가될 수 있으나, 필요에 따라 증폭 핵산의 변성 전 혹은 후에 첨가될 수 있다. 리포터 올리고뉴클레오타이드(2a)는 하이브리드 도메인(3a)을 통해 표적 서열에 바인딩하여 정제-핵산-리포터 올리고뉴클레오타이드 복합체(복합체 II)를 형성한다. 리포터 올리고뉴클레오타이드(2a)는 또한 리젼 태그(12a) 및 제1신호 생성 수단(4a)을 포함한다. 하이브리드는 52℃에서 15분간 배양에 의한 것과 같이 당 기술분야에 알려진 대로 수행될 수 있다. 바인딩후, 복합체 II는 세정될 수 있으며(온난한 1X SSC에서와 같이), 상기한 바와 같은 적절한 분리 기술을 이용하여 분리될 수 있다. 바인딩되지 않은 리포터 올리고뉴클레오타이드의 제거후, 복합체 (II)는 변성 조건에 놓여져 표적 서열(6a)로부터 리포터 올리고뉴클레오타이드(2a)가 방출되도록 한다. 핵산-정제 수단 복합체는 상기한 바와 같이 적절한 분리 기술에 의해 제거된다.
수집 수단(20a)은 용액내 잔존하는 리포터 올리고뉴클레오타이드(2a)와 혼합된다. 수집 수단은 cRT(22a) 및 제2신호 생성 수단(10a)을 포함한다. 수집 수단(20a)의 cRT(22a)는 리포터 올리고뉴클레오타이드의 리젼 태그(12a)와 상호작용하여 수집 수단-리포터 올리고뉴클레오타이드 복합체(복합체 III)를 형성한다. cRTs(22a) 및 리젼 태그(12a)는 각 cRT/리젼 태그 상보성 쌍이 서로 유사한 바인딩 Tm을 갖도록 선택된다. 따라서, 상보성 cRT(22a)에 대한 각 리젼 태그(12a)의 하이브리드 조건은 공통적이다. 이는 한 세트의 하이브리드 조건이 사용되기 때문에 특히 멀티플렉스 검출 셋팅시 증가된 검출 민감도를 이루게 한다. 상기한 바와 같은 하이브리드 조건이 사용될 수 있으며, 또한 당 기술분야에 알려진 바와 같은 다른 하이브리드 조건이 사용될 수 있다. 그 다음 복합체(III)가 분리되고 적절한 검출 플랫폼을 이용하여 분석된다.
일 구현으로, 제1신호 생성 수단(4a)은 형광 PE 표지이며 제2신호 생성 수단(10a)은 내부적으로 색 암호된 스펙트럼 어드레서블 비드(Luminex)이다. 이러한 구현에서, Luminex 플랫폼이 검출용으로 사용된다. Luminex 플랫폼은 제1(4a) 및 제2(10a) 신호 생성 수단을 자극하여 각각 검출가능한 제1 및 제2 신호를 생성한다. 제1 및 제2 신호는 기록 및 해석된다. 제1 및 제2 신호 생성 수단은 제1 및 제2 신호가 다른 하나의 존재하에 검출될 수 있도록 선택된다. 제2신호 생성 수단 및 생성된 제2신호는 리포터 올리고뉴클레오타이드(2a)에 의해 바인딩된 표적 서열(6a)의 정체를 검출하는데 사용된다. 제1신호 생성 수단(10a) 및 제2신호는 (어느 프리 수집 수단 10a로부터 신호 생성을 억제하기위해) 표적 서열(6a)의 존재를 확인하는데 사용된다. 표적 서열(6a)이 확인되면, 질병 인자 또는 이차 질병 인자의 정체가 검출된다.
MAS 의 구현을 이용한 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)의 감별 진단
하기는 SARS(이러한 실시예에서 SARS-CoV)에 대한 감별 진단을 제공하기 위해 본 명세서의 가르침을 이용한 MAS의 몇가지 예이다. 이러한 실시예에서, SARS는 질병 인자이며 이차 질병 인자는 다음중 하나이상을 포함한다: 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) A 및 B, 파라인플루엔자바이러스(PIV) 타입 1 및 3, 인플루엔자(INF) A 및 B, 아데노바이러스 스트레인(ADV), C. 뉴모니아에(C. pneumoniae) M. 뉴모니아에(M. pneumoniae), 엔테로바이러스(ENT) 및 콕사키 바이러스 A(CVA), 콕사키 바이러스 B(CVB), 리노바이러스(RhV) 및 에코바이러스(EV)와 같은 엔테로바이러스 타입을 포함한다. 상기한 바와 같이, 이러한 실시예는 사실상 예시적인 것으로 제공되며 본 명세서를 개시된 감별 진단에 한정하려는 것은 아니며, 다른 질병 인자 및 이차 질병 인자로부터 다른 표적 서열이 증폭 및 검출될 수 있다.
표 2 및 3은 질병 인자 및 이차 질병 인자로부터 표적 서열을 증폭하기위해 TemPCR에 사용된 표적 엔리치먼트 프라이머의 서열(Fout, Rin, Rout 및 Rin에 대해 각각 FO, FI, RO, 및 RI으로 지정됨(이러한 용어는 본 명세서에 정의된 바와 같음)) 뿐만 아니라 리포터 올리고뉴클레오타이드의 핵산 서열(De로 지정됨)을 나타낸다. 표 2 및 3에서, Fi 및 Ri 프라이머는 수퍼 프라이머 바인딩 태그를 함유하였다. 표 2는 또한 질병 인자 및 이차 질병 인자의 핵산 서열에 대한 GenBank 어세션 번호 뿐만 아니라 프라이머 및 리포터 올리고뉴클레오타이드에 의해 바인딩되는 핵산 리젼을 제공한다. 표적 증폭 프라이머(FSP 및 RSP)의 서열은 표 2 및 3의 하단부에 제공된다.
이러한 실시예에서, SARS 바이러스 게놈의 3 표적 서열이 증폭 및 검출되었다. SARS 바이러스는 고 돌연변이율을 갖는 것으로 알려져 있다. 만일 돌연변이가 프라이머 바인딩 사이트 또는 검출 하이브리드 사이트에서 일어나는 경우, 위음성 결과가 유도될 수 있다. SARS 병원체로부터 3 표적 검출은 검출 민감도를 증가시키고 위음성 결과를 감소시킨다. 이차 질병 인자에 있어서, 각각의 핵산으로부터 핵산중 하나의 영역이 증폭 및 검출되었다. 표 2에 열거된 상기 표적 엔리치먼트 프라이머는 일부 경우에 다중 스트레인의 병원체를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 A를 증폭하는데 사용되는 표적 엔리치먼트 프라이머는 (적절한 검출 올리고뉴클레오타이드를 이용하여) 이에 한정하는 것은 아니나 H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H4N6, H5N1 및 H9N2를 포함하는 다양한 스트레인의 검출 및 식별에 충분한 표적 서열을 함유하는 증폭 핵산을 생성한다. 인플루엔자 B를 증폭하는데 사용되는 표적 엔리치먼트 프라이머는 (적절한 검출 올리고뉴클레오타이드를 이용하여) 이에 한정하는 것은 아니나 Lee40, Memphis 97, Saya 99 및 Taiwan 99를 포함하는 다양한 스트레인의 검출 및 식별에 충분한 표적 서열을 함유하는 증폭 핵산을 생성한다. 아데노바이러스를 증폭하는데 사용되는 프라이머는 (적절한 검출 올리고뉴클레오타이드를 이용하여) 아데노바이러스 스트레인 3, 4, 7, 14, 및 21의 검출 및 식별에 충분한 표적 서열을 함유하는 증폭 핵산을 생성한다. 상기 각 경우에, 특정 스트레인을 확인하기위해 각 스트레인에 특이적인 검출 올리고뉴클레오타이드가 검출 단계에 사용될 수 있다. RSP는 바이오틴과 같은 검출 수단으로 표지된다(다른 표지 분자가 상기한 바와 같이 사용될 수 있다).
또한 표 3에 열거한 표적 엔리치먼트 프라이머가 일부 경우에 다중 스트레인의 병원체를 검출하는데 사용될 수 있다. 표 4는 표 3에 나타낸 표적 엔리치먼트 프라이머에 의해 여러 병원체로부터 증폭된 유전자를 보여준다. 비구조 유전자(NS)는 인플루엔자 A 바이러스로 증폭을 위해 선택된다. 보존 부위는 4 표적 엔리치먼트 프라이머의 디자인을 위해 선택되며 (적절한 검출 올리고뉴클레오타이드를 이용하여) 이에 한정하는 것은 아니나 (현재 순회하는 조류 독감 A 스트레인, H5N1을 포함하는) H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H3N8, H4N6, H4N8, H5N1, H5N2, H5N3, H6N1, H6N2, H6N4, H7N2, H7N3, H7N7, H7N8, H9N2, H10N5, H11N1, H11N8, 및 H11N0를 포함하는 다양한 스트레인의 검출 및 식별에 충분한 표적 서열을 함유하는 증폭 핵산을 생성한다. 비구조 유전자는 또한 인플루엔자 B 바이러스의 증폭 및 검출용 표지로서 선택된다. 적어도 51개의 알려진 아데노바이러스 혈청형이 존재한다. 헥손 유전자내 보존 부위는 일련의 표적 엔리치먼트 프라이머의 디자인을 위해 선택되며 (적절한 검출 올리고뉴클레오타이드를 이용하여) 이에 한정하는 것은 아니나 (호흡기 감염과 일반적으로 관련된 혈청형을 포함하는) 혈청형 3, 4, 7, 14 및 21을 포함하는 다양한 스트레인의 검출 및 식별에 충분한 표적 서열을 함유하는 증폭 핵산을 생성한다. 검출 올리고뉴클레오타이드 ADV3-3De는 스트레인 3, 7 및 21을 검출하며, ADV3-3De는 스트레인 4를 검출하며 ADv14-3De는 스트레인 14를 검출한다. 여러 엔테로바이러스 종 및 과 멤버의 5'UTR 리전으로부터 보존 서열이 증폭을 위해 선택되었다. 엔테로바이러스 및 리노바이러스는 피코르나비리데과의 멤버이다. 엔테로바이러스는 또한 콕사키 바이러스 및 에코바이러스와 같은 다른 속을 포함한다. 이러한 바이러스는 모두 호흡기 감염과 관련된다. 여러가지 멤버의 엔테로바이러스류의 검출을 위해, 일련의 표적 엔리치먼트 프라이머가 이에 한정하는 것은 아니나 (적절한 검출 올리고뉴클레오타이드를 이용하여) Ts, 1a, 1b, 2, 9, 14, 15, 16, 39, 49, 50, 85, 및 89를 포함하는 다양한 스트레인의 리노바이러스; 이에 한정하는 것은 아니나 A21 및 A24를 포함하는 다양한 스트레인의 콕사키 바이러스 A; 이에 한정하는 것은 아니나 B4 및 B5를 포함하는 다양한 스트레인의 콕사키 바이러스 B; 및 이에 한정하는 것은 아니나 11, 20, 및 25를 포함하는 다양한 스트레인의 에코바이러스의 검출 및 식별에 충분한 표적 서열을 함유하는 증폭 핵산을 생성하도록 디자인된다. 검출 올리고뉴클레오타이드 Rhv2는 리노바이러스의 검출에 특이적이며, 검출 올리고뉴클레오타이드 CVE2는 콕사키 바이러스 A 및 B 그리고 에코바이러스를 검출한다.
뉴클레오캡시드 단백질 유전자(N 유전자)의 보존 서열은 파라인플루엔자 타입 1 및 3 바이러스로부터 증폭을 위해 선택된다. 비구조 유전자 서열은 호흡기 세포융합 바이러스 A 및 B에 대한 표적으로서 선택된다. 백그라운드 증폭 및 위양성 검출을 줄이기위해, rRNA 유전자는 열거된 박테리아종으로부터 증폭용으로 선택되지 않았다. 대신, 마이코플라즈마 뉴모니아에의 시타데신 P1 유전자, 및 클라미디아 뉴모니아에의 우리딘 키나아제 유전자가 증폭을 위해 선택되었다. RSP는 바이오틴과 같은 검출 수단으로 표지된다(다른 표지 분자가 상기한 바와 같이 사용될 수 있다).
본 검출 방법에 사용되는 프라이머 서열은 상기 상세한 설명에 언급한 바와 같이 달라질 수 있다. 또한, 다른 인자가 그 인자에 특이적인 프라이머를 디자인함으로써 본 개시된 방법에 검출용으로 포함될 수 있다. 이러한 변형은 SARS-유사 질병 상태를 일으키는 새로운 인자가 발견되는 경우 또는 부가적인 SARS 변이체가 분리되는 경우 바람직할 수 있다.
도 1A 및 1B는 Tem-PCR 증폭 방법의 두 구현을 나타낸다.
도 2는 직접 검출 방법론의 일 구현을 나타낸다.
도 3은 간접 검출 방법론의 일 구현을 나타낸다.
실시예 1
본 실시예에서, 각 질병 인자 및 이차 질병 인자의 핵산 서열이 본 명세서에 기술된 바와 같이 획득 및 분리되었다. 각 인자의 핵산은 본 명세서에 기술된 Tem-PCR 방법에 의해 증폭되었다. 각 인자에 대한 핵산을 개별적인 반응 튜브에 넣고 표 2에 명시된 컴플리트 프라이머 믹스를 RT-PCR용 시약과 함께 첨가하였다. 각 인자에 대해 표 5에 명시된 각각의 3 프라이머 비율로 각 반응을 수행하였다. RT-PCR 분야에 알려진 어느 방법이 사용될 수 있으나, 다음 방법이 본 실시예에 사용되었다. 5X RT-PCR 버퍼, 데옥시 뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTP) 믹스(각 dNTP 400μM 함유), 표 5에 명시된 비율로 표 2에 나타낸 컴플리트 프라이머 믹스, 및 RT-PCR 효소 제조물를 함유하는 마스터 RT-PCR 믹스를 제조하였다. RNAse 억제제가 또한 필요에 따라 5-10유니트/반응의 농도로 첨가될 수 있다. 증폭하기에 충분한 각 질병인자 및 이차 질병인자의 표적 서열을 함유하는 핵산 서열 또는 그 일부를 RT-PCR 마스터 믹스를 함유하는 각 반응 튜브에 첨가하였다. RT-PCR 블랭크는 핵산 주형 대신에 하나의 반응 튜브에 RNAse가 없는 물을 첨가하여 제조되었다. 반응 튜브는 다음과 같이 프로그램된 열순환 반응기에 넣어진다: (i) 역전사 - 50℃에서 30분; (ii) 초기 PCR 활성화 - 95℃에서 15분; (iii) 3단계 사이클링(표적 엔리치먼트)을 포함하는 일차 증폭 반응 - 94℃에서 1분, 55℃에서 2.5분 및 72℃에서 1분, 10 완전 사이클; (iv) 이차 3단계 사이클링(표적 증폭) - 94℃에서 30초, 55℃에서 15초 및 72℃에서 15초, 40 완전 사이클; 및 (v) 최종 익스텐션 - 72℃에서 3분.
증폭 산물 분액을 상기한 바와 같이 그리고 도 2에 나타낸 바와 같은 직접 검출 방법을 이용하여 검출하였다. 본 실시예에서, 검출되어지는 각 인자에서 증폭된 표적 서열에 특이적인 검출 올리고뉴클레오타이드(표 2에 열거한 바와 같은)는 Luminex 마이크로스피어에 결합되었다. 증폭 산물의 분액은 개별적인 튜브로 1X TE, 하이브리드 버퍼 및 검출가능한 신호를 생성하는데 충분한 각 검출 뉴클레오타이드의 양을 함유하는 반응 혼합물에 첨가되었다. 본 실시예에서, 표 2의 각 인자에 대한 검출 올리고뉴클레오타이드는 증폭된 핵산 산물을 함유하는 각 반응내에 존재하였다. 검출 올리고뉴클레오타이드 음성 대조구를 위해 증폭 산물 대신에 1X TE가 첨가되었다. 시료는 즉시 검출 올리고뉴클레오타이드와 표적 서열간의 하이브리드를 위해 52℃에서 15분간 두었다. 시료는 바인딩되지 않은 검출 올리고뉴클레오타이드 및 이에 검출 올리고뉴클레오타이드가 바인딩되지 않은 핵산을 제거하기위해 원심분리하였다. 그 다음 상기 시료를 Luminex 플랫폼을 사용하여 검출한다. Luminex 플랫폼은 검출 올리고뉴클레오타이드(제1신호 생성 수단)에 접합된 마이크 로스피어를 자극하여 검출가능한 신호를 생성하였다. 본 실시예에서, 제2 검출 수단은 포함되지 않았으나, 제2 신호가 상기한 바와 같이 편입될 수 있다.
그 결과를 표 3에 나타내었다. 열(row)은 이의 핵산이 초기 증폭 반응에 사용된 질병 인자 또는 이차 질병 인자의 정체 및 상기 증폭 단계에 사용된 프라이머의 비율을 나타낸다. 종렬은 검출 단계에 사용된 검출 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다. 예를 들어, 열 5(RSVB 4:1:1:1:8:16으로 명명된)은 호흡기 세포융합 바이러스 타입 B의 핵산이 증폭 반응에 사용되었으며 네스티드 프라이머와 수퍼 프라이머는 4:1:1:1:8:16의 비율로 사용되었음을 나타낸다. 열 2(RSVB로 명명된)는 호흡기 세포융합 바이러스 타입 B 표적 서열에 특이적인 검출 올리고뉴클레오타이드가 검출 단계에 사용되었음을 나타낸다. 종렬 1(Lum Blank로 명명된)은 증폭 산물이 생략된 검출 올리고뉴클레오타이드 음성 대조구를 나타낸다. 열 3-5(각각, Blank 4:1:8:16, Blank 4:1:8:24 및 Blank 4:1:8:32로 명명된)는 특이 핵산 서열이 생략되었지만 각 특이 표적 서열의 증폭용 프라이머가 표시된 비율로 포함된 증폭 음성 대조구를 나타낸다.
표 4에 나타낸 바와 같이, 주어진 질병 인자 또는 이차 질병 인자에 특이적인 검출 올리고뉴클레오타이드는 다중 증폭된 표적 서열의 존재하에서 질병 인자 또는 이차 질병 인자의 핵산에 특이적으로 바인딩하였다. 이 결과는 표적 엔리치먼트 프라이머가 표적 서열에 특이적이지 않은 멀티플 프라이머의 존재하에서 정확한 표적 핵산을 증폭시켰으며, 표적 증폭 프라이머(FSP 및 RSP)가 상기한 바와 같이 표적 서열을 증폭시키는데 올바르게 작동하였으며, 그리고 적절한 검출 올리고뉴클 레오타이드가 검출되어지는 표적 서열에 하이브리드될 수 있음을 나타낸다. 검출 올리고뉴클레오타이드 음성 대조구 및 증폭 음성 대조구는 백그라운드 리딩을 제공하며 시험된 모든 시료에서 과도한 백그라운드가 없음을 보여준다.
일 예로, RSVB에 특이적인 검출 올리고뉴클레오타이드는 RSVB로부터 유도된 표적 서열에만 특이적으로 바인딩하였으며 다른 인자에 대해서는 바인딩하지 않았다. 또한, 검출 수준은 RSP의 농도가 증가함에 따라 증가하였으며, 이는 비대칭적 증폭이 검출 단계의 민감도를 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 또한, 아데노바이러스의 경우에, 표 4는 표적 엔리치먼트 프라이머 및 표적 증폭 프라이머가 정확한 아데노바이러스 표적 서열을 증폭시켰으며, 특이적 검출 올리고뉴클레오타이드가 아데노바이러스 스트레인간의 식별을 가능케함을 보여준다.
실시예 2
본 실시예에서, 각 질병 인자 및 이차 질병 인자의 핵산은 본 명세서에 기술된 바와 같이 획득 및 분리되었다. 각 인자의 핵산은 본 명세서에 기술된 Tem-PCR 방법에 의해 증폭되었다. 각 인자에 대한 핵산을 개별적인 반응 튜브에 넣고 표 3에 명시된 컴플리트 프라이머 믹스를 RT-PCR용 시약과 함께 첨가하였다. RT-PCR 조건은 상기 실시예 1에 기술된 바와 같았다. 본 실시예에 사용된 프라이머 비율은 1:1:1:1:10:40(Fout:Fin:Rin:Rout:FSP:RSP)이었다.
상기 표적 서열을 함유하는 증폭 산물의 검출은 실시예 1에 기술된 바와 같 이 Luminex 비드를 이용한 직접 검출 방법으로 수행되었다. 표 3에 열거된 각 인자에 대한 검출 올리고뉴클레오타이드는 각 검출 반응에 첨가되었다.
표 6은 표 3에 기재된 표적 엔리치먼트 및 표적 증폭 프라이머를 이용한 실험 결과를 보여준다. 열(row)은 이의 핵산이 초기 증폭 반응에 사용된 질병 인자 또는 이차 질병 인자의 정체 및 상기 증폭 단계에 사용된 프라이머의 비율을 나타낸다. 종렬은 검출 단계에 사용된 검출 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다. 예를 들어, 시료 번호 1은 표적 엔리치먼트 및 표적 증폭 프라이머의 혼합물을 포함하는 RT-PCR Blank이며, Luminex 비드에 접합된 검출 올리고뉴클레오타이드가 주형을 포함하지 않은 RT-PCR 반응에 하이브리드되었다. 백그라운드 신호는 양성 반응에 대한 컷-오프 값을 측정하는데 사용된다. TemPCR을 이용하는 MAS와 같은 멀리플렉스 시스템에서, 각 비드 세트는 사실상 그 자체로 마이크로-시스템이다. 최종 신호 뿐만 아니라 백그라운드는 비드 세트상에 포획 올리고뉴클레오타이드를 연결하는 결합 반응의 효율; 멀티플렉스 TemPCR 반응시 표적 증폭의 효율; 및 검출도중 하이브리드의 효율을 포함하는 다수 인자에 의해 영향을 받는다. 결과적으로, 각 병원체(각 비드 세트에 의해 나타내어지는)에 대한 컷오프 값은 개별적으로 결정되어야 한다. 백그라운드 신호(RT-PCR 블랭크 및 표적 인자를 함유하지 않은 것으로 알려진 시료로부터 획득된 값을 평균하여 측정되는)가 측정되었으며 표준편차가 획득되었다. 표준 편차는 5로 곱하여 그 값을 평균 백그라운드에 더했다. 평균 백그라운드보다 높은 값은 특정 인자의 존재를 표시하는 양성 결과로 간주된다.
시료 2-4는 각각 아데노바이러스 서브타입 4, 7, 및 21이었다. 시료 5-11은 각각 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae)(CPN), 마이코플라즈마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)(MPN), 및 인플루엔자 A(INFA), 인플루엔자 B(INFB), 파라인플루엔자 타입 1(PIV-1), 파라인플루엔자 타입 3(PIV-3), 및 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)이었다. 시료 12는 SARS-CoV이었다. 검출 민감도를 증가시키고 표적 변이에 의해 유발되는 위음성 검출을 최소화하기위해, 본 출원인은 증폭 및 검출용 SARS-CoV로부터 3개의 다른 표적 서열을 선택하였다. 시료 13-16은 콕사키 바이러스 A(CVA), 콕사키 바이러스 B(CVB), 리노바이러스(RhV), 및 에코바이러스(EV)를 포함하는 다른 엔테로바이러스이다. 아데노바이러스 및 엔테로바이러스 종의 검출을 위해, 아데노바이러스 및 엔테로바이러스 종에 대해 각각의 특이 검출 뉴클레오타이드가 검출 단계에 첨가되었다.
표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 본 명세서의 TemPCR 방법은 표적 서열의 특이적 증폭을 제공하였으며, 이는 이에 상응하는 검출 올리고뉴클레오타이드에 의해 특이적으로 검출되었다. 고 검출 특이성은 각 비드 세트로부터 획득된 고 신호 대 백그라운드 비율에 의해 분명히 나타났다. 이러한 결과는 표적 엔리치먼트 프라이머가 표적 서열에 특이적이지 않은 다중 프라이머 세트의 존재하에서 정확한 표적 핵산 서열을 증폭시켰으며 표적 증폭 프라이머(FSP 및 RSP)가 상기한 바와 같이 표적 서열을 증폭시키는데 올바르게 작동하였으며, 그리고 적절한 검출 올리고뉴클레오타이드가 검출되어지는 표적 서열에 하이브리드될 수 있음을 나타낸다.
실시예 3
실시예 1 및 2에서, 단지 1개의 핵산 시료만이 각 반응에 첨가되었다(다중 인자에 특이적인 표적 엔리치먼트 프라이머의 존재하에서도 불구하고). 표 7은 다중 병원체의 핵산 시료가 멀티플렉스 증폭 및 후속 검출을 위해 단일 시료내에 포함된 경우 TemPCR 증폭 방법의 특이성을 보여준다. 본 실시예에서, 표 3에 열거된 각 유기체에 대한 표적 엔리치먼트 프라이머가 표적 증폭 프라이머 및 표시된 병원체의 핵산과 함께 각 시료에 포함되었다. 표 7에서 열은 멀티플렉스 검출 단계도중 검출된 검출 올리고뉴클레오타이드를 나타내며(표 3에 열거된 모든 유기체에 대한 표적 서열에 특이적인 검출 올리고뉴클레오타이드는 각 검출 반응에 포함되었음을 주의 바람), 표 6에서 열은 각 시료에 첨가된 병원체 핵산의 정체를 나타낸다. TemPCR 증폭 조건 및 멀티플렉스 검출은 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행되었다.
시료 1은 주형 핵산이 RT-PCR 반응에 포함되지 않은 음성 대조구이다. 시료 2는 3개의 병원체, SARS, CPN, 및 INFA를 포함하였으며; 시료 3은 ADV-7, RSVB, 및 INFB를 포함하였으며; 시료 4는 PIV-3, CPN, 및 INFA를 포함하였으며; 시료 5는 ADV-21, RSVB, 및 INFB를 포함하였으며; 시료 6은 RhV 및 PIV1을 포함하였으며; 시료 7은 SARS 및 INFB를 포함하였으며; 그리고 시료 8은 ADV-7 및 PIV1을 포함하였다. 표 6에 나타낸 컷오프 값이 본 실시예에 사용되었으며 상기 컷오프보다 높은 값은 표 7에 하일라이트처리하였다.
그 결과는 TemPCR이 각 인자로부터 정확한 표적 서열을 증폭시켰으며, 증폭된 표적 서열은 시료에 존재하는 인자의 정확하고 특이적인 해독을 제공하도록 검 출될 수 있음을 보여준다. 일 예로서, 열 2에서 SARS, CPN 및 INFA의 핵산이 증폭 반응에 첨가되었다. 표 3에서 모든 인자에 특이적인 표적 엔리치먼트 프라이머의 존재하에서, 개시된 프라이머를 이용한 TemPCR 방법은 정확한 표적 서열을 증폭시켰다. TemPCR 증폭 조건의 변형 또는 최적화는 상기 3 인자의 정확한 멀티플렉스 증폭을 얻는데 필요하다. 현저하게, 동일한 세트의 TemPCR 멀티플렉스 증폭 조건은 표준 증폭 프로토콜을 이용한 다양한 인자의 특이적 검출을 가능케 하였다. 개시된 TemPCR 방법은 고 특이적이며 여러 가지 조합으로 특이적인 병원체를 검출할 수 있다. 위양성 혹은 위음성은 관찰되지 않았다.
실시예 4
TemPCR 방법의 민감도를 확인하기 위해, 1ml 혈청 시료를 표 8에 열거한 바와 같은 다른 양의 바이러스 또는 박테리아 인자와 함께 준비하였다. 각 인자에 대해, 4가지 농도가 준비되었다: 104pfu/ml, 103pfu/ml, 102pfu/ml, 및 101pfu/ml. 어세이 반복성을 관찰하기위해, 각 4농도에서, 3중 시료가 준비되고 분석되었다. ADV4 및 RhV와 같은 특정 시료는 유용한 고 타이터 스톡을 갖지 않았으며 출발 농도는 103pfu/ml이었다. SARS에 있어서, 바이러스 스톡은 제한되었으며, 따라서 두가지 시료만(3가지 시료보다는) 각 농도에 대해 조사되었다. 고농도의 양성 대조구(혈청내에 고정되지 않은)가 또한 각 병원체에 대해 포함되었다.
각 1ml의 고정 시료 혈청에 대해, 200μl가 핵산 분리에 사용되었다. 핵산 분리는 본 명세서에 기술된 바와 같은 트리아졸 방법을 이용하여 수행되었다. 분리 방법의 마지막에, 핵산은 50μl RNAse 프리 워터내로 용출되었다. 이 용출물중 5μl의 볼륨을 후속적인 TemPCR 반응시 주형으로 사용하였다. 따라서, 만일 출발 농도는 104pfu/ml인 경우, TemPCR 증폭 반응은 단지 약 200 카피의 병원체 게놈을 포함하였다. 마찬가지로, 103pfu/ml에서, 단지 20 카피가 반응 시스템 등에 포함되었다. TemPCR 증폭 반응에 대한 조건은 실시예 2에서 상기한 바와 같았으며 멀티플렉스 검출은 상기 직접 검출 방법을 이용하여 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행되었다.
표 8은 민감도 시험 결과를 나타낸다. 컷오프 값은 각 표적에 대해 특이적으로 검출되었으며 상기 컷오프 값은 평균에 표준편차의 5배를 곱하는 것으로 설정되었다. 일반적으로, 상기 어세이는 혈청 시료내에 존재하는 20-200 카피의 병원체를 검출할 수 있다. 본 실시예에 사용된 TemPCR 조건은 본 명세서에 기술된 선택적인 증폭 단계를 포함하지 않았다. 선택적인 증폭 단계의 사용은 반응 민감도를 현저히 증가시키는 것으로 예측된다.
실시예 5
실시예 5는 상기 TemPCR 방법의 택일적인 구현을 이용한 실험 결과를 나타낸다. 본 실시예에서, 각 질병 인자 및 이차 질병 인자의 핵산 서열은 본 명세서에 기술된 바와 같이 획득 및 분리되었다. 이러한 구현에서, TemPCR을 위한 증폭 조건은 표적 엔리치먼트 단계 및 선택적 증폭 단계가 포함되도록 변경되었다. 각 인자 에 대한 핵산을 개별적인 반응 튜브에 넣고 표 3에 명시된 컴플리트 프라이머 믹스를 RT-PCR용 시약과 함께 첨가하였다. 본 실시예에 사용된 프라이머 비율은 1:1:1:1:10:40(Fout:Fin:Rin:Rout:FSP:RSP)이었다.
상기 표적 서열을 함유하는 증폭 산물의 검출은 실시예 1에 기술된 바와 같이 Luminex 비드를 이용한 직접 검출 방법으로 수행되었다. 표 3에 열거된 각 인자에 대한 검출 올리고뉴클레오타이드는 각 검출 반응에 첨가되었다.
증폭 조건은 다음과 같다. 반응 튜브는 다음과 같이 프로그램된 열순환 반응기에 넣어진다: (i) 역전사 - 50℃에서 30분; (ii) 초기 PCR 활성화 - 95℃에서 15분; (iii) 3단계 사이클링(표적 엔리치먼트)을 포함하는 일차 증폭 반응 - 94℃에서 0.5분, 52℃에서 1분 및 72℃에서 1분, 15 완전 사이클, 및 이차 2-단계 사이클링(선택적 증폭) - 94℃에서 15초, 70℃에서 1.5분, 6 완전 사이클, 바람직하게 4-8 완전 사이클; (iv) 삼차 3단계 사이클링(표적 증폭)을 포함하는 이차 증폭 반응 - 94℃에서 15 내지 30초, 50-55℃에서 15 내지 30초 및 72℃에서 30초, 적어도 2완전 사이클, 바람직하게 10-40 완전 사이클; 및 (v) 최종 익스텐션 - 72℃에서 3분. 상기 표적 서열을 함유하는 증폭 산물의 검출은 실시예 1에 기술되고 도 2에 나타낸 바와 같은 Luminex 비드를 이용한 직접 검출 방법과 같은 방법으로 수행되었다. 표 3에 열거한 각 인자에 대한 검출 올리고뉴클레오타이드가 각 검출 반응에 첨가되었다.
표 9는 표 3에 개시된 표적 엔리치먼트 및 표적 증폭 프라이머를 이용한 실 험의 결과를 나타낸다. 열(row)은 이의 핵산이 초기 증폭 반응에 사용된 질병 인자 또는 이차 질병 인자의 정체를 나타낸다. 표 9에서 알 수 있는 바와 같이, 택일적인 증폭 전략을 이용한 TemPCR 방법은 표적 서열의 특이적 증폭을 제공하였으며, 이는 이에 상응하는 검출 올리고뉴클레오타이드에 의해 특이적으로 검출되었다. 고 검출 특이성은 각 비드 세트로부터 획득된 고 신호 대 백그라운드 비율에 의해 분명히 나타났다. 이러한 결과는 표적 엔리치먼트 프라이머가 표적 서열에 특이적이지 않은 다중 프라이머 세트의 존재하에서 정확한 표적 핵산 서열을 증폭시켰으며 표적 증폭 프라이머(FSP 및 RSP)가 상기한 바와 같이 표적 서열을 증폭시키는데 올바르게 작동하였으며, 그리고 적절한 검출 올리고뉴클레오타이드가 검출되어지는 표적 서열에 하이브리드될 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 목적은 또한 설명된 모든 구현에 기술된 방법을 수행하는데 필요한 성분을 포함하는 키트를 제공하는 것이다. 상기 키트는 다음중 하나이상을 포함할 수 있다: 질병 인자를 은닉하는 것으로 의심되는 개체의 시료에서 질병 인자 및 이차 질병 인자로부터 표적 서열의 증폭을 위한 적어도 하나의 프라이머 세트, 핵산(RNA, DNA 또는 두가지 모두)의 분리용 시약, (PCR, RT-PCR 또는 당 기술분야에 알려진 다른 기술에 의한) 상기 시료로부터 표적 핵산의 증폭용 시약, 포획제가 접합되거나 접합되지 않은 마이크로스피어(일 구현으로 cRTs), 표적 서열 특이 검출 올리고뉴클레오타이드, 양성/음성 대조구 및 제1 및 제2 신호의 생성에 필요한 시약.
(기사, 특허 및 url 주소를 포함하는) 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌이 허용되는 범위로 참고문헌으로 포함된다. 본 명세서에 언급된 인용문헌은 본 출원의 출원일 이전에 이의 명세서에 대해 제공된다. 하기 청구범위가 국외 우선권의 목적으로 첨부된다.
DNA RNA(+) RNA(+)
Fout 1 1 4
Rout 1 4 1
Fin 1 1 1
Rin 1 1 1
FSP 8 8 8
RSP 32 32 32
표 1 - 표시된 게놈을 갖는 질병 인자 및 이차 질병 인자에 대한 네스티드 프라이머 및 수퍼 프라이머의 예시적인 비율. 네스티드 프라이머 및 수퍼 프라이머의 비율은 본 명세서에 기술된 바와 같이 달라질 수 있다.
표 5. 포함된 병원체 표적 및 검출가능한 스트레인의 설명.
번호 병원체 생성물 명 표적 유전자 검출가능한 타입/스트레인
1 SARS-CoV SARS1 5'말단 폴리프로틴
SARS2 폴리머라아제 유전자
SARS3 N 유전자
2 인플루엔자 A INFA NS 유전자 H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H3N8, H4N6, H4N8, H5N1, H5N2, H5N3, H6N1, H6N2, H6N4, H7N1, H7N2, H7N3, H7N7, H7N8, H9N2, H10N5, H11N1, H1N8, H11N9
3 인플루엔자 B INFB NS 유전자
4 아데노바이러스 ADV 헥손 유전자 타입 3,4,7,14 및 21
5 파라인플루엔자 1 PIV1 N 유전자
6 파라인플루엔자 3 PIV3 N 유전자
7 호흡기 세포융합 바이러스 RSV NS 유전자 RSVA 및 RSVB
8 M. 뉴모니아에 MPN 시타데신 P1 유전자
9 C. 뉴모니아에 CPN 우리딘 키나아제 유전자
10 엔테로바이러스 ENT 5'UTR 리노바이러스 1a, 1b, 2, 9, 14, 15, 16, 39, 49, 50, 85, 89; 콕사키 바이러스 A: A21, A24; 콕사키 바이러스 B: B4, B5: 에코바이러스 11, 20 및 25.
Figure 112006033102515-pct00001
Figure 112006033102515-pct00002
Figure 112006033102515-pct00003
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Claims (88)

  1. a.
    i) 주형으로서, 각각의 하나 이상의 인자(agents)로부터 얻어지며 표적 서열을 함유하는 핵산;
    ii) 상기 핵산에 하이브리드되고 상기 표적 서열을 브라켓팅(bracketing)하는, 검출하고자 하는 각 표적 서열에 대한 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍;
    iii) 상기 핵산에 하이브리드되고 상기 표적 서열을 브라켓팅하며, 상기 표적 서열에 근접 위치되며, 그리고 5'말단에 한 쌍의 표적 증폭 프라이머중 하나의 서열에 상응하는 제1 바인딩 태그를 포함하는 하나의 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍 및 5'말단에 상기 표적 증폭 프라이머쌍의 다른 하나의 서열에 상응하는 제2 바인딩 태그를 포함하며, 상기 제1 바인딩 태그 및 상기 제2 바인딩 태그는 서로 다르지만 검출하고자 하는 각 표적 서열에 대해 동일한, 검출하고자 하는 각 표적 서열에 대한 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍; 및
    iv) 제1 증폭 반응이 하나 이상의 제1 증폭 산물을 생성하도록 하며, 여기서 상기 제1 증폭 산물의 적어도 일부가 상기 표적 엔리치먼트 프라이머에 대한 상기 제1 및 제2 바인딩 태그의 적어도 하나의 컴플리먼트를 함유하여 이에 따라 적어도 하나의 상기 표적 엔리치먼트 프라이머에 대한 적어도 하나의 바인딩 사이트를 형성하는 제1 증폭 반응을 위한 증폭 시약 및 조건;
    을 이용하여 제1 증폭 반응을 수행하는 단계; 및
    b.
    i) 주형으로서, 적어도 하나의 상기 표적 엔리치먼트 프라이머에 대한 상기 적어도 하나의 바인딩 사이트를 함유하는 제1 증폭 산물의 일부;
    ii) 상기 제1 증폭 산물의 일부상의 그에 상응하는 바인딩 사이트에 바인딩하는 적어도 하나의 상기 제1 표적 증폭 프라이머쌍; 및
    iii) 제2 증폭 반응이 상기 표적 서열을 함유하는 하나 이상의 제2 증폭 산물을 생성하도록 하는 제2 증폭 반응을 위한 증폭 시약 및 조건;
    을 이용하여 제2 증폭 반응을 수행하는 단계;
    포함하는 하나 이상의 인자로부터 인자마다 다른 표적 서열의 멀티플렉스 프라이머-기초 증폭 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍은 아웃사이드 리버스 프라이머 및 아웃사이드 포워드 프라이머를 포함하며, 상기 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍은 인사이드 포워드 프라이머 및 인사이드 리버스 프라이머를 포함하며 그리고 상기 제1 표적 증폭 프라이머는 포워드 수퍼 프라이머 및 리버스 수퍼 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 인사이드 포워드 프라이머상의 바인딩 사이트는 포워드 수퍼 프라이머가 상기 인사이드 포워드 프라이머상의 바인딩 사이트의 컴플리먼트에 바인딩하도록 포워드 수퍼 프라이머의 서열과 일치하며 그리고 상기 아웃사이드 리버스 프라이머상의 바인딩 사이트는 리버스 수퍼 프라이머가 상기 아웃사이드 리버스 프라이머상의 바인딩 사이트의 컴플리먼트에 바인딩하도록 리버스 수퍼 프라이머의 서열과 일치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 각 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 10-40뉴클레오타이드, 10-30뉴클레오타이드 및 10-20뉴클레오타이드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 각 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 10-40뉴클레오타이드, 10-30뉴클레오타이드 및 10-20뉴클레오타이드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 각 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 10-20뉴클레오타이드이며 각 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 30-40뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 각 제1 표적 증폭 프라이머쌍의 길이는 10-20뉴클레오타이드이며 각 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 30-40뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 표적 엔리치먼트 프라이머는 저농도로 존재하며 상기 표적 증폭 프라이머는 고농도로 존재하며, 상기 저농도는 0.002-0.2μM의 농도이며 상기 고농도는 0.2-1.0μM의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제 8항에 있어서, 상기 저농도의 표적 엔리치먼트 프라이머는 표적 서열의 지수적 증폭에 충분하지 않으며, 상기 고농도의 표적 증폭 프라이머는 표적 서열의 지수적 증폭에 충분한 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 각 표적 엔리치먼트 프라이머는 동일한 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 표적 엔리치먼트 프라이머는 다른 표적 엔리치먼트 프라이머보다 높은 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 각 표적 증폭 프라이머는 동일한 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 표적 증폭 프라이머는 다른 표적 증폭 프라이머보다 높은 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 보다 높은 농도의 표적 증폭 프라이머는 검출 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 제1 증폭 반응 조건은 표적 엔리치먼트 공정의 적어도 두개의 완전 사이클을 포함하며 제2 증폭 반응 조건은 표적 증폭 공정의 적어도 두개의 완전 사이클을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 표적 엔리치먼트 공정은 증폭 조건, 92-94℃에서 0.5-1분, 50-55℃에서 1-2.5분 및 70-72℃에서 0.5-1분을 포함하며 그리고 상기 표적 증폭 공정은 증폭 조건, 94℃에서 15-30초, 50-55℃에서 15-30초 및 72℃에서 15-30초를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 제1 증폭 반응 조건은 표적 엔리치먼트 공정의 적어도 두 개의 완전 사이클 및 선택적인 증폭 반응의 적어도 두 개의 완전 사이클을 포함하며 그리고 제2 증폭 반응 공정 조건은 표적 엔리치먼트 공정의 적어도 두개의 완전 사이클을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 표적 엔리치먼트 공정은 증폭 조건, 92-94℃에서 0.5-1분, 50-55℃에서 1-2.5분 및 70-72℃에서 0.5-1분을 포함하며, 선택적 증폭 반응은 증폭 조건, 92-94℃에서 15-30초, 70-72℃에서 1-2분을 포함하며 그리고 상기 표적 증폭 반응은 증폭 조건, 94℃에서 15-30초, 50-55℃에서 15-30초 및 72℃에서 15-30초를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 선택적인 증폭 반응은 적어도 하나의 상기 표적 엔리치먼트 프라이머에 대한 바인딩 사이트를 함유하는 제1 증폭 산물을 생성하는 방향으로 편향된 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19항에 있어서, 각 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 10-20뉴클레오타이드이며 각 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 30-40뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1항에 있어서, 3이상의 표적 엔리치먼트 프라이머쌍을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1항에 있어서, 2이상의 표적 증폭 프라이머쌍을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1항에 있어서, 상기 인자는 바이러스 및 박테리아로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 바이러스는 아데노바이러스, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 파라인플루엔자 타입 1, 파라인플루엔자 타입 3, 및 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), SARS, 및 콕사키 바이러스 A, 콕사키 바이러스 B, 리노바이러스 및 에코바이러스를 포함하는 엔테로바이러스로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 상기 박테리아는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 종 및 클라미디아(Chlamydia) 종으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 24항에 있어서, 상기 인자는 상기 제1 및 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 디자인에 의해 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 상기 표적 증폭 프라이머는 검출 수단을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 검출 수단은 화학적 요소, 효소적 요소, 형광 요소, 또는 방사능표지 요소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1항에 있어서, 상기 표적 서열을 검출하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 검출 방법은 직접 검출 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 30항에 있어서, 검출 방법은
    a. 각 검출 올리고뉴클레오타이드는 제1 신호 생성 수단을 포함하는 검출되는 각 표적 서열에 대한 검출 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 단계;
    b. 상기 검출 올리고뉴클레오타이드를 상기 제2 증폭 산물과 접촉 및 배양하는 단계;
    c. 상기 제1 신호 생성 수단을 자극하여 제1 신호를 생성하는 단계; 및
    d. 상기 제1 신호를 검출하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 제1 신호는 검출되는 각 표적 서열에 독특하며 상기 제1 신호는 상기 인자를 확인하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 32항에 있어서, 상기 제1 신호 생성 수단은 형광 표지, 화학적 표지, 효소적 표지, 또는 방사능표지인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 32항에 있어서, 상기 제1 신호 생성 수단은 형광 마이크로스피어인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 31항에 있어서, 상기 방법은 간접 검출 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. a.
    i) 주형으로서, 각각의 하나 이상의 인자(agents)로부터 얻어지며 표적 서열을 함유하는 핵산;
    ii) 상기 핵산에 하이브리드되고 상기 표적 서열을 브라켓팅(bracketing)하며 각각은 5'말단에 한 쌍의 표적 증폭 프라이머중 하나의 서열에 상응하는 제1 바인딩 태그를 포함하는 검출하고자 하는 각 표적 서열에 대한 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍 및 5'말단에 상기 표적 증폭 프라이머쌍의 다른 하나의 서열에 상응하는 제2 바인딩 태그를 포함하며 상기 제1 바인딩 태그 및 상기 제2 바인딩 태그는 서로 다르지만 검출하고자 하는 각 표적 서열에 대해 동일한, 검출하고자 하는 각 표적 서열에 대한 다른 하나의 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍; 및
    iii) 제1 증폭 반응이 하나 이상의 제1 증폭 산물을 생성하도록 하며, 여기서 상기 제1 증폭 산물의 최소 일부가 상기 표적 서열 및 상기 표적 엔리치먼트 프라이머중 하나에 대한 바인딩 태그의 최소 하나의 컴플리먼트를 함유하여 이에 따라 최소 하나의 상기 표적 엔리치먼트 프라이머에 대한 최소 하나의 바인딩 사이트를 형성하는 제1 증폭 반응을 위한 증폭 시약 및 조건;
    을 이용하여 제1 증폭 반응을 수행하는 단계; 및
    b.
    i) 주형으로서, 상기 최소 하나의 상기 표적 엔리치먼트 프라이머에 대한 최소 하나의 바인딩 사이트를 함유하는 제1 증폭 산물의 일부;
    ii) 상기 제1 증폭 산물의 일부상의 상응하는 바인딩 사이트에 바인딩하는 최소 하나의 상기 제1 표적 증폭 프라이머쌍; 및
    iii) 제2 증폭 반응이 상기 표적 서열을 함유하는 하나 이상의 제2 증폭 산물을 생성하도록 하는 제2 증폭 반응을 위한 증폭 시약 및 조건;
    을 이용하여 증폭되는 각 표적 서열을 위한 제2 증폭 반응을 수행하는 단계;
    포함하는 하나 이상의 인자로부터 인자마다 다른 표적 서열의 멀티플렉스 프라이머-기초 증폭 방법.
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  69. a. 질병 인자 존재의 진단을 필요로 하는 대상자로부터 질병 인자를 함유하는 것으로 의심되는 시료를 제공하는 단계;
    b. 상기 질병 인자의 표적 서열을 함유하는 핵산을 상기 시료로부터 분리하는 단계;
    c. 상기 핵산을 제 1항 또는 37항의 프라이머-기초 증폭 방법에 적용하는 단계;
    d. 상기 질병 인자로부터 상기 표적 서열을 검출하는 단계;
    를 포함하는 사람을 제외한 동물 대상자에서 질병 인자의 존재를 진단하는 방법.
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  79. a. 질병 인자 존재의 진단을 필요로 하는 대상자로부터 질병 인자 또는 이차 질병 인자를 함유하는 것으로 의심되는 시료를 제공하는 단계;
    b. 상기 질병 인자 또는 이차 질병 인자 또는 두가지 모두의 표적 서열을 함유하는 핵산을 상기 시료로부터 분리하는 단계;
    c. 상기 핵산을 제 1항 또는 37항의 프라이머-기초 증폭 방법에 적용하는 단계;
    d. 상기 질병 인자 또는 이차 질병 인자 또는 두가지 모두로부터 상기 표적 서열을 검출하는 단계;
    를 포함하는 사람을 제외한 동물 대상자에서 질병 인자 및 이차 질병 인자의 존재를 감별 진단하는 방법.
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