JP4773513B2

JP4773513B2 - Ａ型及びｂ型インフルエンザウイルスの核酸を検出するための組成物及びアッセイ

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Publication number: JP4773513B2
Application number: JP2008510215A
Authority: JP
Inventors: マーロウ，エリザベス・エム; ダービー，ポール・エム; ゲットマン，ダモン・ケイ; ノーマン，シルヴィア・エイ; ポルナー，ラインホルト・ベー
Original assignee: ジェン−プローブ・インコーポレーテッド
Priority date: 2005-05-06
Filing date: 2006-05-04
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2026-05-04
Also published as: CA2605015A1; EP1877418A4; WO2006121773A2; EP2471805A3; AU2006244460B2; US20060257860A1; US20100285450A1; EP1877418A2; AU2010202899A1; US8124335B2; WO2006121773A3; EP2471805A2; JP2011167199A; AU2006244460A1; JP2011172584A; EP1877418B1; JP2008539733A; US8338095B2; CA2605015C

Description

本出願は、米国３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）により、２００５年５月６日に出願された仮出願第６０／６７８，５０８号に基づく優先権を主張し、これを本明細書に援用する。

本発明は病原体の検出の分野に関し、より具体的には、インビトロで核酸増幅及びプローブ検出を用いて、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルス配列を検出するための組成物及び方法を用いて検出する。

インフルエンザウイルス（Ａ、Ｂ及びＣ型）は、インフルエンザの原因であるオルソミキソウイルス科の一員である。Ａ型インフルエンザウイルスは鳥類やヒトを含む哺乳動物に感染するが、Ｂ及びＣ型はヒトのみに感染する。インフルエンザウイルスは、分節したマイナス鎖ゲノムＲＮＡを含む、直径約８〜２００ｎｍのラフな球形エンベロープで包まれたウイルスである。そのエンベロープは、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む硬い構造を包含する。遺伝子再構成に起因するＨＡ及びＮＡの亜型の組み合わせは、ウイルス分離株の特定に用いられる。一般的に、インフルエンザウイルス分離株は、型、場所、分離番号、分離年、及びＨＡ及びＮＡ亜型を含む命名法により同定される（例えば、「Ａ／シドニー／７／９７（Ｈ３Ｎ２）」は、Ａ型、シドニー由来、分離番号７、１９９７年にＨＡ３及びＮＡ２亜型という。）。抗原連続変異を生じる多少の遺伝的変化は一時的なインフルエンザ流行の原因となりうるが、新規なＨＡ又はＮＡ亜型をもたらす遺伝的変化は、大流行を引き起こしうる抗原不連続変異の原因となる。ヒトＡ型インフルエンザウイルス感染の解析により、１９１８年のＨ１Ｎ１、１９５７年のＨ２Ｎ２及び１９６８年のＨ３Ｎ２のように１９００年代に大流行が起こったことで、２〜３個のＨＡ及びＮＡの組み合わせが臨床的に重大であることが示されてきた。

鳥類(例えば、ニワトリ、カモ、ハト)に感染するインフルエンザウイルスは、Ｈ５、Ｈ７又はＨ９とＮ１〜Ｎ９のいずれかとの組み合わせを用いる。１９９７年から、ヒトに感染するトリインフルエンザウイルスには、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２及びＨ７Ｎ７ウイルスが含まれてきた。トリインフルエンザウイルスに起因するヒトの感染に限っても、検疫及び苦難を伴う夥しい数の家禽の意図的な廃棄をもたらす、潜在的な大流行の懸念がある。ヒト対ヒト接触で効率的に移動するトリインフルエンザウイルス又はその変異体は大流行の原因となりえた（Li et al., 2003, J. Virol. 77(12): 6988-6994）。

ヒトインフルエンザウイルスは、幼若な亜集団、老齢な亜集団及び免疫機能が低下した亜集団で著しく高い致死率をもたらし、重篤な罹患及び経済コストの原因となる接触感染性が高い急性呼吸器疾患をもたらす。ヒトでのトリインフルエンザ感染は、一般的に致死率が高い。典型的なヒトでのインフルエンザウイルス感染は、インキュベーション期間が短く（１〜２日）、症状は約１週間程度続き（例えば、急な発熱、のどの痛み、咳、頭痛、筋肉痛、倦怠感及び拒食症）、肺炎を起こす場合もある。感染を最適に防御するには、世界規模での疫学的調査に基づいた、その年に最も流行しそうな亜型のＡ及びＢ型を組み合わせたワクチンを毎年接種しなければならない。治療を効果的なものにするためには、ウイルスが細胞内に侵入することを防御するか又は感染した細胞からのウイルスの放出を低下させる医薬を、発症から４８時間以内に投与しなければならない。

インフルエンザウイルスを臨床的に検出するために様々な方法が用いられてきた。インビトロでのウイルス培養（サル腎臓細胞）の後に、微生物学的方法を用いた視覚的アッセイ及び／又は血球吸着で、標本（例えば、鼻咽喉又は咽喉のスワブ、鼻腔又は気管支の洗浄物、鼻腔吸引物又は唾液）中のＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスを検出することができる。他の検出試験としては、インフルエンザウイルス抗原に特異的な抗体を用いる、免疫蛍光法（ＩＦＡ）、酵素免疫法（ＥＩＡ）及び酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）があげられる。Ａ型又はＢ型インフルエンザ特異的モノクローナル抗体及びフローサイトメトリーを用いるサンドイッチ微小体ベースＩＦＡ（Yan et al., 2004, J. Immunol. Methods 284(1-2): 27-38）、モノクローナル抗体ベースＥＩＡ試験（DIRECTIGEN(登録商標) FLU A and DIRECTIGEN(登録商標) FLU A+B, Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, and QUICKVUE(登録商標) influenza Test, Quidel, San Diego, CA）及び、固定化抗体がＡ型又はＢ型インフルエンザ核タンパク質に結合すると分子薄膜の厚みが増すために色が変化するような免疫法（FLU OIA(登録商標), Biostar Inc., Boulder, CO）が例としてあげられる。他のクロマゲニック（chromagenic）な方法では、基質の切断によりウイルス性ＮＡ活性を検出する（ZSTAT FLU(登録商標), ZymeTx, Inc., Oklahoma City, OK）。アッセイ方法は、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスを検出するためにインフルエンザウイルス配列を増幅するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）に依存することが知られている（例えば、Templeton et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42(4):1564-69; Frisbie et al., 2004, J. Clin. Microbiol. 42(3):1181-84; Boivin et al., 2004, J. Clin. Microbiol., 42(1):45-51 ; Habib-Bein et al., 2003, J. Clin. Microbiol. 41 (8):3597-3601 ; Li et al., 2001 , J. Clin. Microbiol. 39(2):696-704; van Elden et al., 2001 , J. Clin. Microbiol. 39(1): 196-200; Fouchier et aL, 2000, J. Clin. Microbiol. 38(11):4096-101; Ellis et al., 1997, J. Clin. Microbiol. 35(8): 2076-2082; ＷＯ２００４／０５７０２１号公報、ＷＯ０２／００８８４号公報、ＷＯ００／１７３９１号公報及びＷＯ９７／１６５７０号公報，欧州特許公報第１３２７６９１Ａ２号、米国特許第６，０１５，６６４号及びPROFLU-1（商標）及びHEXAPLEX（商標）試験, Prodesse, Milwaukee, Wl）。血清学では、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルス感染に関する血清変換を、インフルエンザの症状がある患者由来の急性かつ回復期の血清中に存在する抗体を検出することにより検出する。検出方法は、感度、特異性、アッセイ方法及び操作時間、必要な器具並びに研究室や個人に求められる安全性に関して、技術員が病原体に暴露することに関連して、好都合及び不都合な点がある。一般的には、培養及び血清学的試験は、期間がより長く（５日〜２週間）、潜在的に技術員が病原体に暴露される機会が増える。免疫学的方法は一般的に迅速であるが（３０分〜４時間）、時として、技術員により、実質的に試料を操作しなければならず、結果は主観的な測定に依存する。ＰＣＲベースの増幅アッセイ方法は、完了するまで２日かかる場合もあり、専門のサーモサイクラー装置が必要である。

すなわち、感染者を効果的に治療するのに十分な時間内に診断を完了させるため、技術員が病原体に暴露されることが最小限になるように比較的短時間で、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスを感度よく特異的に検出する試験に対する要望がある。

本明細書に開示される１の態様は、配列番号３〜配列番号１８及び配列番号２１〜配列番号３１若しくはそれらと完全に相補的な配列又はそれらのＤＮＡ同等物からなる配列から構成されるＡ型インフルエンザウイルスに特異的な少なくとも２つの核酸オリゴマーを含む組成物である。好ましい態様としては、少なくとも１のオリゴマーが配列番号７〜配列番号１８からなる配列から選択され、少なくとも１のオリゴマーが配列番号２１〜配列番号２４からなる配列から選択される核酸オリゴマーがあげられる。他の好ましい態様としてはまた、配列番号２５〜配列番号３１からなる配列から選択される少なくとも１のオリゴマーがあげられる。好ましい態様では、少なくとも１のオリゴマーには、少なくとも１の２’−メトキシＲＮＡ基が含まれ、他の好ましい態様では、少なくとも１のオリゴマーには、オリゴマーの５’末端に少なくとも１のロックされた核酸（ＬＮＡ）残基が含まれる。配列番号２５〜配列番号３１からなる配列から選択されるオリゴマーが含まれる好ましい態様では、オリゴマーはまた、オリゴマー配列に直接的又は間接的に結合した検出可能な標識を含む。好ましい標識は、均一系アッセイシステムで検出可能なものである。当該組成物の好ましい態様は、Ａ型インフルエンザウイルスに特異的な、少なくとも２つの特定の核酸オリゴマーを含むキットである。

本明細書で開示する他の態様は、配列番号３４〜配列番号５８からなる配列若しくはそれらに完全に相補的な配列又はそれらのＤＮＡ同等物から構成されるＢ型インフルエンザウイルスに特異的な少なくとも２つの核酸オリゴマーを含む組成物である。好ましい態様としては、配列番号３８〜配列番号４３からなる配列から選択される少なくとも１のオリゴマー、及び、配列番号４４〜配列番号４７からなる配列から選択される少なくとも１のオリゴマーがあげられる。他の好ましい態様としてはまた、配列番号４８〜配列番号５８からなる配列から選択される少なくとも１のオリゴマーがあげられる。いくつかの好ましい態様では、少なくとも１のオリゴマーは少なくとも１の２’−メトキシＲＮＡ基を含み、他の好ましい態様では、少なくとも１のオリゴマーは、オリゴマーの５’末端に少なくとも１のロックされた核酸（ＬＮＡ）残基を含む。好ましい態様では、配列番号４８〜配列番号５８からなる配列から選択されるオリゴマーは、直接的又は間接的にオリゴマー配列に結合した検出可能な標識を含む。好ましい態様としては、均一系アッセイシステムで検出できる標識があげられる。組成物の好ましい態様は、Ｂ型インフルエンザウイルスに特異的な、少なくとも２つの特定の核酸オリゴマーを含むキットである。

他の態様は、試料中のＡ型インフルエンザウイルス又はＢ型インフルエンザウイルスの核酸を検出する方法であって、実質的に等温条件下で増幅産物を産生するために、試料中に含まれるＡ型インフルエンザウイルス核酸又はＢ型インフルエンザウイルス核酸中の標的配列をインビトロで核酸ポリメラーゼを用いて増幅する工程であって、Ａ型インフルエンザウイルスの標的配列は配列番号１若しくはそれに完全に相補的な配列又はそれらのＲＮＡ同等物に含まれており、Ｂ型インフルエンザウイルスの標的配列は配列番号３２若しくはそれに完全に相補的な配列又はそれらのＲＮＡ同等物に含まれている前記増幅工程及び増幅産物を検出する工程を含む、前記方法である。好ましい態様では、Ａ型インフルエンザウイルスの標的配列を増幅する工程は、配列番号７〜配列番号１８からなる配列から選択される少なくとも１のオリゴマー及び配列番号２１〜配列番号２４からなる配列から選択される１のオリゴマーを用いる。他の態様では、Ｂ型インフルエンザウイルスの標的配列を増幅する工程は、配列番号３８〜配列番号４３からなる配列から選択される少なくとも１のオリゴマー及び配列番号４４〜配列番号４７からなる配列から選択される１のオリゴマーを用いる。他の好ましい態様では、検出工程は、配列番号２５〜配列番号３１からなる配列から選択される少なくとも１のプローブを用いてＡ型インフルエンザウイルスの標的配列の増幅産物を検出するか、又は、配列番号４８〜配列番号５８からなる配列から選択される少なくとも１のプローブを用いてＢ型インフルエンザウイルスの標的配列の増幅産物を検出する。本方法の好ましい態様としてはまた、内部調節オリゴマーをもたらす工程、内部調節オリゴマーに含まれる標的配列を増幅する工程、及び、内部調節オリゴマーから作製された増幅産物を検出する工程により本方法の増幅工程及び検出工程が適切に実行されたことを示す工程があげられる。他の好ましい態様では、本方法はまた、増幅工程の前に、Ａ型インフルエンザウイルス核酸又はＢ型インフルエンザウイルス核酸を含有する試料由来のインフルエンザウイルス核酸を単離する工程があげられる。

核酸オリゴマー配列は、インビトロでの核酸増幅の方法を用いて、好ましくはＴＭＡ又はＮＡＳＢＡ等の転写介在増幅反応を用いて、試料中に存在するＡ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスの核酸を増幅するためのプライマーとして、及び、増幅された核酸配列の検出のためのプローブとして機能しうることが開示される。検出プローブは、増幅プロセスの終了後又はプロセス中に、増幅したウイルス配列の部分に特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様では、増幅配列に特異的に結合した標識プローブを混合物中で検出する均一系検出方法を用いて増幅産物を検出する（例えば、Arnold et al., 1989, Clin. Chem. 35:1588-1594；米国特許第５，６５８，７３７号、Ｎｅｌｓｏｎら、及び米国特許第５，１１８，８０１号及び第５，３１２，７２８号、Ｌｉｚａｒｄｉらを参照）。方法の態様はまた、標的インフルエンザウイルス核酸を捕捉して、他の試料成分から分離するために試料を加工するための捕捉プローブとして機能するオリゴヌクレオチド配列を用いる（米国特許第６，１１０，６７８号、第６，２８０，９５２号及び第６，５３４，２７３号、Ｗｅｉｓｂｕｒｇら）。

本明細書で開示された方法は、ヒト由来の試料中、好ましくは、鼻咽頭又は咽頭のスワブ、鼻腔及び気管支の洗浄液、鼻腔吸引物又は唾液中、に存在するＡ型及びＢ型インフルエンザウイルス核酸を検出する。本明細書で開示された組成物としては、Ａ型インフルエンザウイルス又はＢ型インフルエンザウイルスの標的核酸を試料中の他の成分から分離するための捕捉オリゴマー、インフルエンザウイルスのゲノム配列に存在する選択された核酸配列を特異的に増幅するための増幅オリゴマー及び増幅配列を検出するための核酸プローブがあげられる。好ましい態様としては、転写関連増幅反応の開始約４５分以内に検出可能なシグナル又は反応をもたらすアッセイ中で、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスの配列を増幅して検出するためのオリゴマーの特異的な組み合わせがあげられる。

開示された核酸配列及び方法は、診断が感染の初期段階（例えば、兆候がみられてから４８時間以内）で行われ、効果的な治療が開始されるように、比較的短時間での試料中に存在するウイルス粒子由来のＡ型及びＢ型インフルエンザウイルス核酸の増幅及び検出に有用である。当該方法は、インフルエンザウイルスに感染しているが明確な兆候が現れていない個体のスクリーニング、特に、インフルエンザウイルス感染から致死又は重篤な合併症の危険性が高い患者、例えば、若年者、老人又は免疫不全の個体のスクリーニングに有用である。当該方法はまた、伝染病の流行又は大流行時等の多量の試料の迅速スクリーニングにも有用であり、適当な公衆衛生対策を開始できる。当該方法は、研究員が、ヒトに感染性になったＡ型又はＢ型インフルエンザウイルスに関連するトリインフルエンザウイルス等の病原体に暴露される危険性を最小限にするため、有用である。すなわち、本明細書で開示された当該方法及び組成物は、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルスを含有しうる臨床試料の迅速、高感度及び特異的な試験の要望に応えるものである。

「生物学的」又は「臨床的」試料を含む「試料」又は「標本」は、例えば、鼻咽頭又は咽頭のスワブ、鼻腔及び気管支の洗浄液、鼻腔吸引物又は唾液、他の呼吸組織若しくは浸出液、又は、リンパ節を含む生検試料を含む、インフルエンザウイルス標的核酸を含む、生体若しくは死体又は動物由来の組織又は材料をいう。試料は、細胞内核酸を、酵素、緩衝液、塩、界面活性剤等を含みうる溶液中に放出するために、物理的又は機械的に組織や細胞の構造を崩壊して処理してアッセイ試料を調製してもよい。

「核酸」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ−ＤＮＡ及びその類似物のポリマーを含み、共に結合してポリヌクレオチドを形成する窒素含有複素環塩基若しくは塩基類似物を有する、ヌクレオシド又はヌクレオシド類似物を含む多重化合物をいう。核酸の「骨格」は、１又はそれ以上の糖ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」又はＰＮＡ；国際特許出願公報ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオネート結合、メチルホスホネート結合又はそれらの組み合わせを含む、様々な結合から構成されてもよい。核酸の糖部分は、リボース、デオキリボース、又は、例えば、２’−メトキシ又は２’−ハロゲン置換体などの置換がなされた類似の化合物でもよい。窒素含有塩基は、慣用の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その類似物（例えば、イノシンその他；The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., ed., 11^thed., 1992参照）、プリン又はピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ^４−メチルデオキシグアノジン、デアザ−又はアザ−プリン、デアザ−又はアザ−ピリミジン、５又は６位に置換基があるピリミジン塩基、２、６又は８位に置換基があるプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ^６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン及びＯ^４−アルキル−ピリミジン；米国特許第５，３７８，８２５号及び国際特許出願ＷＯ９３／１３１２１号）でもよい。核酸は、１又はそれ以上の、骨格のポリマーの位置に窒素含有塩基がない「脱塩基」残基を含んでもよい（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は慣用のＲＮＡ又はＤＮＡの糖、塩基及び結合のみを含んでもよく、又は、慣用の成分及び置換物を共に含有してもよい（例えば、２’−メトキシ結合、又は、慣用の塩基及び１又はそれ以上の塩基類似物を共に含有するポリマーがある慣用の塩基）。核酸には、「ロックされた核酸」（ＬＮＡ）、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ配列へのハイブリダイゼーション親和性を高めるＲＮＡ擬似糖構造中の二環式フラノース単位がロックされた、１又はそれ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有する類似物が含まれる。（Vester and Wengel, 2004, Biochemistry 43（42）: 13233-41）。ハイブリダイゼーション複合体の安定性に影響を及ぼしうるオリゴマーの態様としては、ＰＮＡオリゴマー、２’−メトキシ若しくは２’−フルオロ置換ＲＮＡを含むオリゴマー、又は、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート）又は中性基（例えば、メチルホスホネート）を含有するオリゴマーを含む、ハイブリダイゼーション複合体の全体的な電荷、電荷密度、又は立体的関係に影響を及ぼすオリゴマーがあげられる。

「オリゴマー」又は「オリゴヌクレオチド」は、一般的には、下限が約２〜５ｎｔで上限が約５００〜９００ｎｔの範囲の大きさであるものを含む、１，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の核酸をいう。ある好ましい態様としては、下限が約５〜１５ｎｔで上限が約５０〜６００ｎｔの範囲の大きさであるオリゴマー、そして他の好ましい態様としては、下限が約１０〜２０ｎｔで上限が約２２〜１００ｎｔの範囲の大きさであるオリゴマーである。オリゴマーは天然源から精製されてもよいが、好ましくは、周知の酵素的又は化学的方法を用いて合成される。オリゴマーは、機能的名称で表してもよく（例えば、捕捉プローブ、プライマー又はプロモータープライマー）、当業者であれば、そのような用語がオリゴマーを表すことを理解するであろう。

「捕捉プローブ」、「捕捉オリゴヌクレオチド」又は「捕捉オリゴマー」は、標準的塩基対で標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズし、標的核酸を捕捉するために支持体に固定されたプローブ上の結合パートナーと結合する核酸オリゴマーをいう。捕捉オリゴマーの好ましい態様には、通常、同一オリゴマー上に、配列−結合領域（すなわち、標的特異的部分）及び固定化プローブ結合領域の２つの結合領域が含まれるが、この２つの領域は、１又はそれ以上のリンカーが共に結合した２つの異なるオリゴマー上に存在してもよい。

「固定化プローブ」、「固定化オリゴマー」又は「固定化核酸」は、捕捉オリゴマーを支持体に直接的又は間接的に結合させる核酸結合パートナーをいう。支持体に結合した固定化プローブは、試料中の非結合材料から標的が結合した捕捉プローブを分離するのを促進する。いかなる支持体が用いられてもよく、例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン又は金属等の様々な材料から構成されうる、溶液が含まれていない基質又は粒子等を用いてもよい。好ましい態様では、例えば、固定化プローブが、直接的（例えば、共有結合、キレート又はイオン相互作用を介して）又は間接的（例えば、リンカーを介して）に結合した単分散常磁性粒子（均一サイズ±５％）等の磁気的誘導粒子であり、結合は核酸ハイブリダイゼーション条件では安定であるような支持体を用いる。

「分離」又は「精製」は、試料中の１又はそれ以上の成分を１又はそれ以上の他の試料成分から取ることをいい、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質又は他の核酸もまた含有しうる一般的な水溶液から、ある核酸を取ることをいう。好ましい態様では、分離工程又は精製工程は、標的核酸を他の試料成分から、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％及びさらにより好ましくは少なくとも約９５％取る。

「増幅オリゴヌクレオチド」又は「増幅オリゴマー」は、例えば、プライマー又は及びプロモータープライマーとして機能するような、標的核酸又はその相補体とハイブリダイズして核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドをいう。好ましい増幅オリゴマーは、標的核酸配列又はそれらの相補鎖の領域に相補的な、少なくとも約１０の連続した塩基、より好ましくは、少なくとも１２の連続した塩基を含有する。連続した塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、及びさらに好ましくは完全に相補的である。好ましい増幅オリゴマーは、約１０〜約６０塩基長で、場合によっては、改変ヌクレオチドが含まれていてもよい。「プライマー」は、鋳型核酸にハイブリダイズして、３’末端が重合により延長されたオリゴマーをいう。プライマーは、場合によっては、例えば、標的配列に非相補的な５’領域を含むことにより改変されていてもよい。５’プロモーター配列で改変されたプライマーは「プロモータープライマー」といわれる。分子生物学又は生化学の当業者であれば、プライマーとして機能しうるオリゴマーは５’プロモーター配列を含むように改変されうること、さらにプロモータープライマーとして機能すること、同様に、いかなるプロモータープライマーも５’プロモーター配列があってもなくてもプライマーとして機能しうることを理解するであろう。

「核酸増幅」は、標的核酸配列若しくはその相補的な配列又はそのフラグメント（すなわち、完全標的核酸よりも短い配列を含む増幅配列）の多数コピーを産生するいかなる周知のインビトロ手順をもいう。周知の核酸増幅手順の例としては、転写介在増幅（ＴＭＡ）、核酸配列−ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）その他（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号、第５，４３７，９９０号、第５，１３０，２３８号、第４，８６８，１０５号及び第５，１２４，２４６号）等の転写関連方法、複製介在増幅（例えば、米国特許第４，７８６，６００号）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、欧州特許出願第０３２０３０８号）及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号）があげられる。複製介在増幅は、自己複製ＲＮＡ分子及びＱＢ−レプリカーゼ等のレプリカーゼを用いる。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー及び熱サイクル工程を用いて、ＤＮＡ又はｃＤＮＡの２つの相補鎖の多数コピーを合成する。ＬＣＲ増幅は、少なくとも４の別個のオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーション、ライゲーション及び変性の多数サイクルを用いて、標的及びその相補鎖を増幅する。ＳＤＡは、標的配列を含む半改変ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖に切れ目を入れることになる制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを用いて、プライマー延長及び鎖置換工程を繰り返して増幅を行う。好ましい態様は、ＴＭＡ又はＮＡＳＢＡ等の転写関連増幅を用いるが、当業者であれば、本明細書で開示されたオリゴマーが他の増幅方法でプライマーとして容易に用いられることは自明であろう。簡潔には、転写関連増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド３リン酸、リボヌクレオシド３リン酸、オリゴヌクレオチド含有プロモーターを用いて、場合によっては、他のオリゴヌクレオチドを含んでもよいが、核酸鋳型から最終的に多数のＲＮＡ転写物を産生する（米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号、Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，４３７，９９０号、Ｂｕｒｇら、国際出願公報ＷＯ８８／０１３０２号及びＷＯ８８／１０３１５号、Ｇｉｎｇｅｒａｓら、米国特許第５，１３０，２３８号、Ｍａｌｅｋら、米国特許第４，８６８，１０５号及び第５，１２４，２４６号、Ｕｒｄｅａら、国際出願公報ＷＯ９４／０３４７２号、ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、国際出願公報ＷＯ９５／０３４３０号、Ｒｙｄｅｒらに詳細が報告されている）。ＴＭＡを用いる好ましい方法は以前に詳細に報告されている（米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号）。

「検出プローブ」は、増幅配列を含む標的配列に、標的核酸の検出のために核酸ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、特異的にハイブリダイズする核酸オリゴマーをいう。検出は、直接（すなわち、標的に直接ハイブリダイズするプローブ）又は間接的（すなわち、プローブと結合する介在構造物が標的とハイブリダイズするプローブ）でもよい。プローブの標的配列は、一般的に、プローブが特異的にハイブリダイズするより大きい配列内の特異的配列をいう。検出プローブとしては、標的特異的配列及び他の配列、又は、標的配列が存在するか否かに依存してプローブの３次元構造をもたらす構造があげられる（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、第５，３１２，７２８号、第６，８３５，５４２号及び第６，８４９，４１２号）。

「標識」は、検出するか、検出可能なシグナルをもたらすプローブに、直接的又は間接的に結合する部分又は化合物をいう。直接結合は、共有結合又は非共有相互作用（例えば、水素結合、疎水性又はイオンの相互作用及びキレート又は配位錯体の配置）を用い、間接結合は、（例えば、抗体や他のオリゴヌクレオチドを介した）検出シグナルを増幅する架橋部分又はリンカーを用いてもよい。いかなる検出部分をも用いうるが、例えば、放射性核種、ビオチン又はアビジン等のリガンド、酵素、酵素基質、反応基；検出可能な色素、発光化合物（例えば、生物発光、発光又は化学発行化合物）及び蛍光化合物をもたらす色素又は粒子（例えば、ラテックス又は金属ビーズ）等の発色団が用いられてもよい。好ましい態様としては、混合物中の結合標識プローブが非結合プローブと比較して検出可能な変化を呈するような均一系システムで検出可能であり、標識をハイブリダイズしなかった標識プローブからハイブリダイズしたものを物理的に取り出さずに検出させる「均一系検出可能標識」があげられる。（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，２０７号及び第５，６５８，７３７号）。好ましい均一系検出可能標識としては、化学発光化合物があげられ、さらに好ましくは周知のＡＥ又はＡＥ誘導体等のアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物があげられる（米国特許第５，６５６，２０７号、第５，６５８，７３７号及び第５，６３９，６０４号）。標識を合成し、核酸に標識を付着し、標識からシグナルを検出する方法は周知である（例えば、 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)第１０章並びに米国特許第５，６５８，７３７号、第５，６５６，２０７号、第５，５４７，８４２号、第５，２８３，１７４号及び第４，５８１，３３３号及び欧州特許出願第０７４７７０６号）。ＡＥ化合物を核酸に結合する好ましい方法は公知である（例えば、米国特許第５，５８５，４８１号及び米国特許第５，６３９，６０４号第１０欄第６行目〜第１１頁第３行目及び実施例８を参照）。好ましいＡＥ標識位置はプローブの中央領域及びＡ／Ｔ塩基対領域付近、プローブの３’又は５’末端、又は、所望の標識配列と比較して検出すべきでないプローブである公知配列があるミスマッチ部位若しくはその付近である。

もし、例えば、プローブ及び標的配列のような２つの核酸配列のハイブリダイゼーションが安定であるのであれば、配列が当該配列が完全に相補的でなくても、その配列は「十分に相補的」である。２つの配列が相補的でない１又はそれ以上の残基（脱塩基位置を含む）を包含していても、全配列では適当なハイブリダイゼーション条件で安定なハイブリダイゼーション複合体を形成する限り、それは、標準的な塩基対（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ又はＡ：Ｕ）を用いて、一連の部分的に相補的なヌクレオチド間を水素結合により他の配列にハイブリダイズする「十分に相補的な」配列である。十分に相補的な配列は、互いにハイブリダイズする配列中で、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％及び最も好ましくは、完全に相補的である。適当なハイブリダイゼーション条件は当業界で周知であり、配列組成物に基づいて予測でき、又は常套試験を用いて経験的に決定できる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51及び11.47-11.57章、特に、9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47及び11.55-11.57章）。

「本質的に〜からなる」は、本明細書で記載される組成物及び方法の基本的及び新規な特性が物質的に変化しない他の成分、組成物又は方法工程が当該組成物又は方法に含まれうることを意味する。当該特性としては、インフルエンザウイルス核酸を少なくとも５０の他の公知の呼吸器系病原体から識別する特異性で試料中に存在するＡ型インフルエンザウイルス又はＢ型インフルエンザウイルス核酸配列を検出する機能があげられ、好ましくは、検出された増幅ウイルス配列を作製する増幅反応の開始から約４５分以内にインフルエンザウイルスの少なくとも１．７〜２．７対数コピーを検出する感受性で検出する。

特に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての科学的及び技術的用語は、関連する当業者に通常理解される意味と同一である。一般的な定義は、例えば、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd ed.（Singleton et al., 1994, John Wiley & Sons, New York, NY）又はThe Harper Collins Dictionary of Biology（Hale & Marham. 1991 , Harper Perennial, New York, NY）等の分子生物学界の技術書籍に見出すことができる。特に言及しない限り、本明細書で用いられるか又は意図する技術は、当業者に周知の標準的な方法手順である。本明細書にあげられる実施例はいくつかの好ましい態様の例示である。

核酸の標的捕捉、増幅及び検出で機能する核酸オリゴマーを含む組成物並びに生物学的試料中に存在するヒトＡ型インフルエンザウイルス（「ＦｌｕＡ」）及びＢ型インフルエンザウイルス（「ＦｌｕＢ」）の核酸を検出する方法が本明細書に開示されている。Ａ型インフルエンザウイルスを検出する試験で用いられる適当な標的配列を選択するために、公知のＡ型インフルエンザウイルスＲＮＡ又は部分的又は相補的な配列（公衆に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋが利用できる）を含む基質タンパク質（ＭＰ１）をコードするＤＮＡ配列を同一又は類似の配列とマッチすることによりアラインさせて比較した。Ｂ型インフルエンザウイルスを検出するための試験で用いられる適当な標的配列を選択するために、公知のＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡ又は部分的又は相補的な配列（公衆に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋが利用できる）を含む基質タンパク質（ＮＳ１）をコードするＤＮＡ配列を同一又は類似の配列とマッチすることによりアラインさせて比較した。配列比較は、コンピューター実行アルゴリズムを用いて促進させることもできるが、当業者であれば、手動及び視覚的に比較を行うことができる。比較した個々のウイルス配列間の変化が比較的少ない各ウイルス標的の配列の部分が、本明細書に記載された方法を用いるための合成オリゴマーを設計するための基礎として選択された。ＦｌｕＡ標的の検出のためのオリゴヌクレオチド配列を表１に示し、ＦｌｕＢ標的の検出のためのオリゴヌクレオチド配列を表２に示す。両方の表では、好ましい機能が、各配列のため、及び好ましい機能としてプロモータープライマーとして同定された配列のために含まれ、当該配列としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが適当な条件下で初期転写できる５’Ｔ７バクテリロファージプロモーター配列（配列番号１９又は配列番号２０からなる下線部）があげられる。当業者であれば、他の５’プロモーター配列を下線のＴ７プロモーター配列と置換しても、その後、適当なＲＮＡポリメラーゼで選択した他のプロモーター配列に機能し、同等のプロモータープライマーオリゴヌクレオチドを作製するであろうことを理解できる。プロモータープライマーを用いない増幅システムでプライマーとして機能することができる、プロモータープライマーとして同一の標的特異的配列があるがプロモーター配列はないオリゴマーもまた示される（配列番号１３〜１８及び４１〜４３）。当業者であれば、標的捕捉における好ましい機能を有するものとして同定されるオリゴマーには標的特異的部分（配列番号３，４、３６及び３７で示される）があり、場合によっては、欠失したり、他の配列や結合部分で置換されたりする尾部分（配列番号５，６，３４及び３５で示されるＴ_３Ａ_３０）が含まれることを認識するであろう。

配列は、表１及び２にＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡ配列として示されるが、当該配列には、対応するＤＮＡ又はＲＮＡ配列及びそれらに完全に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ配列が含まれることを意味する。オリゴマーの好ましい態様としては、骨格構造に影響を及ぼす１又はそれ以上の改変残基（例えば、２’−メトキシ置換ＲＮＡ基）、又は、１又はそれ以上のＬＮＡモノマー、好ましくは、プライマーオリゴマーの５’残基を含んでもよく、又は、標識をオリゴマーに結合させる非ヌクレオチドリンカーを含んでもよい。例えば、ＲＮＡ標的のプローブとして機能するオリゴマーは、２’−メトキシ置換ＲＮＡ基で合成してもよく、プローブと標的配列の間のハイブリダイゼーションをより安定に促進する。態様には、２’−メトキシ置換ＲＮＡ基で合成し、配列番号２５の第６〜７の残基の間、配列番号２６及び５０の第７〜８の残基の間、配列番号２６及び２７の第８〜９の残基の間及び配列番号４８及び４９の第９〜１０の残基の間に非ヌクレオチドリンカー（米国特許第５，５８５，４８１号に記載されたように）を有する、配列番号２５〜２７のオリゴマーが含まれる。他の態様としては、５’の第１〜３残基にてＬＮＡで合成された配列番号４４及び４５のオリゴマー及び５’の第１〜４残基にてＬＮＡで合成された配列番号４６のオリゴマーがあげられる。

標的捕捉オリゴマーの好ましい態様としては、ＦｌｕＡ又はＦｌｕＢの標的核酸に特異的に結合する標的特異的配列及び標的核酸を含有するハイブリダイゼーション複合体を固体支持体上の固定化配列に捕捉することに用いられる、共有結合している「テール」配列（配列番号５、６、３４及び３５のＴ_３Ａ_３０）があげられる。捕捉オリゴマーの好ましい態様としては、少なくとも１の２’−メトキシ結合があげられる。捕捉オリゴマーの態様としては、例えば、固定化されたアビジン又はストレプトアビジンに特異的に結合するビオチン化配列のような他の結合部分に結合したＦｌｕＡ又はＦｌｕＢゲノム配列と結合する標的特異的配列があげられる。テール配列又は結合部分は、ハイブリダイズした標的を捕捉するための固定化プローブ（例えば、相補的な配列又はアビジン）に結合して、当該混合物から固形支持体を分離することにより、それを他の試料成分から分離する。

プロモータープライマー配列を含むプライマー配列は、標的核酸又はそれと相補的な配列と特異的に結合し、かつ、例えば、プロモータープライマー中のプロモーター配列のように標的特異的でない他の配列を含有してもよい。プロモーター配列が結合していてもしていなくてもよい標的特異的配列は、様々なインビトロでの増幅プロセスで増幅オリゴマーとして機能することができる。ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイの態様としては、ＰＣＲ等の複数の循環する反応温度が必要な増幅方法（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号）を用いてもよく、又は、ＴＭＡ又はＮＡＳＢＡ等の転写関連増幅方法で実質的に等温の反応であってもよい（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、第５，４８０，７８４号、第５，８２４，５１８号、第５，８８８，７７９号、第５，７８６，１８３号、第５，４３７，９９０号、第５，１３０，２３８号、第４，８６８，１０５号及び第５，１２４，２４６号並びに国際特許出願ＷＯ８８／０１３０２号及びＷＯ８８／１０３１５号）。ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイの好ましい態様としては、プローブが増幅工程中に作製される目的とする標的配列に結合すると、識別可能な蛍光シグナルを発するプローブを含ませることにより、増幅工程（すなわち、リアルタイム検出）中で検出されるＰＣＲベース又はＴＭＡベースの増幅系を用いてもよい。リアルタイム検出に好ましいプローブとしては、「分子ビーコン」又は「分子スイッチ」プローブ（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号及び第５，３１２，７２８号、Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，９２５，５１７号及び第６，１５０，０９７号、Ｔｙａｇｉら、Giesendorf et al., 1998, Clin. Chem. 44(3):482-6）及び「分子トーチ」プローブ（例えば、米国特許第６，８３５，５４２号及び第６，８４９，４１２号、Ｂｅｃｋｅｒら）といわれるものがあげられる。一般的に、当該プローブとしては、プローブオリゴマーの一端に結合したレポーター色素（reporter dye）（例えば、ＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＶＩＣ（商標））、及び、プローブオリゴマーの一端に結合した消光化合物（例えば、ＴＡＭＲＡ（商標）又は非蛍光消光剤）を含み、シグナル産生物は、その結合している化合物を有する２端が接近しているか離れているかに依存する。

試料中のインフルエンザウイルスを検出するアッセイには、目的とする標的領域に特異的な増幅オリゴマー又はプライマーを用いて、試料中に含まれる標的インフルエンザウイルス核酸中の標的領域を増幅する工程、及び、プローブ配列とハイブリダイズすることにより増幅された核酸を検出する工程が含まれる。好ましいアッセイは、転写関連増幅反応を用いて、検出は増幅反応中に行うものである。検出では、増幅核酸を標識し、未標識のプローブと結合させてもよいが、好ましい態様では、標識されたプローブを増幅核酸に結合させる。リアルタイム検出の好ましい態様では、均一系システムで検出される標識プローブを用いる。

一般的には、標的インフルエンザウイルス核酸は、増幅工程の前に、他の試料成分から分離される。これは、標的インフルエンザウイルス核酸に特異的に結合する標的特異的捕捉オリゴマーを用いるか、試料から核酸を精製する非特異的な方法を用いて、インフルエンザウイルス核酸を捕捉することで行われる（例えば、米国特許第５，２３４，８０９号、第５，７０５，６２８号、第６，５３４，２６２号及び第６，９３９，６７２号）。好ましい使用の態様では、捕捉工程で標的特異的捕捉オリゴマーを用いる（米国特許第６，１１０，６７８号、第６，２８０，９５２号及び第６，５３４，２７３号）。捕捉プローブの態様としては、Ａ型インフルエンザウイルスに特異的な核酸（配列番号３〜６）及びＢ型インフルエンザウイルスに特異的な核酸（配列番号３４〜３７）があげられる。配列番号５、６、３４及び３５の態様は、相補的な固定化配列へのハイブリダイゼーションのためのｄＴ_３Ａ_３０テール部分が含まれるが、配列番号３、４、３６及び３７の態様は、結合対のメンバーである他のリガンド（例えば、固定化アビジン又はストレプトアビジンに結合するビオチン化ＤＮＡ）に連結して用いられる。捕捉プローブ、その標的インフルエンザウイルス核酸及び固定化結合パートナー又はプローブの複合体は他の試料成分からインフルエンザウイルス核酸分離することを促進し、場合によっては、捕捉したウイルス核酸をさらに精製するために洗浄工程を用いてもよい。

２つのプライマーを用いてインフルエンザウイルス標的領域を増幅することは、様々な公知の核酸増幅反応を用いて実行することができるが、好ましくは、ＴＭＡ等の転写関連増幅反応（米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号に詳細に記載されている）を用いる。ＴＭＡベースのアッセイでは、標的核酸の単一コピーから多くのＲＮＡ転写物（アンプリコン）が産生され、このアンプリコンは、試料中の標的インフルエンザウイルスの存在を示すように検出される。簡潔には、ＴＭＡベースアッセイでは、プロモータープライマーは、標的配列に特異的にハイブリダイズし、ＲＮａｓｅＨ活性を含む逆転写酵素（ＲＴ）は、プロモータープライマーの３’末端からの伸長により第１鎖ｃＤＮＡを作製して、鋳型鎖を消化する。ｃＤＮＡはその後、第２プライマーにより結合して、ＤＮＡの新しい鎖が、ＲＴを用いて第２プライマーの末端から合成されて、機能的プロモーター配列を含有する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を作製する。そのプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼは、プロモーター配列に結合し、初期鋳型に用いられたのと同様の工程を用いて、各々が他の配列の増幅の鋳型として作用することができる複数のＲＮＡ転写物が産生される。すなわち、多量の１本鎖増幅産物が実質的に等温である反応条件を用いて産生される。

Ａ型インフルエンザウイルスのアッセイの他の態様は、ＰＣＲ増幅（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号、Ｍｕｌｌｉｓら）を用いて、分離した鎖の部分に特異的なプライマー及びｄｓＤＮＡを分離するサーモサイクル反応を用いて複数ＤＮＡ鎖を産生して、ＤＮＡポリメラーゼを用いて他のｄｓＤＮＡ分子を作製する。例えば、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを産生するＲＴを用いる逆転写ＰＣＲ等の慣用されている様々な基本的なＰＣＲ法もまた用いることができ、その場合、ＤＮＡはＰＣＲサイクルで増幅されるか、又は、リアルタイム検出と併用したＰＣＲによって増幅されるが、これらは共に、時として、ＲＴ−ＰＣＲという（例えば、TaqMan One-Step RT-PCR kits, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）。

Ａ型インフルエンザウイルス核酸に特異的な増幅オリゴマーの態様としては、配列番号７〜１２のプロモータープライマー、プロモータープライマー中に含まれる配列番号１３〜１８の標的特異的配列及び配列番号１９〜２４があげられる。好ましい組成物は、配列番号２１の第１〜３位にＬＮＡ残基がある、配列番号７及び配列番号２１のオリゴマーの混合物を含み、組成物は配列番号１のＡ型インフルエンザウイルス標的領域のＴＭＡベースの増幅に有用である。

Ｂ型インフルエンザウイルス核酸に特異的な増幅オリゴマーの態様としては、配列番号３８〜４０のプロモータープライマー、プロモータープライマー中に含まれる配列番号４１〜４３標的特異的配列及び配列番号４４〜４７があげられる。好ましい組成物としては、配列番号４４の第１〜３位にＬＮＡ残基がある、配列番号３９及び配列番号４４のオリゴマーの混合物を含み、組成物は配列番号３２のＢ型インフルエンザウイルス標的領域のＴＭＡベースの増幅に有用である。

インフルエンザウイルス核酸を検出する方法には、増幅したインフルエンザウイルス産生物（ＲＮＡ又はＤＮＡアンプリコン）に特異的に結合する少なくとも１のプローブを用いる検出工程が含まれる。好ましくは、当該プローブは標識されて、均一系システム、すなわち、結合していないプローブから結合したプローブを分離しないシステム中で検出されるシグナルを産生する。好ましいプローブは、均一系システムで化学発光シグナルが産生されて、検出されるアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物で標識される（米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，７４４号及び第５，６５８，７３７号に実質的に詳細が記載されている）。他の好ましいプローブは、例えば、分子スイッチ、ビーコン又はトーチプローブの標識とプローブが結合する場合のみ検出シグナルが発生する蛍光化合物で標識される。Ａ型インフルエンザウイルス配列を特異的に検出する好ましいプローブとしては、好ましくは、配列番号２５の第６〜７残基間、配列番号２６の第７〜８残基間又は第８〜９残基間及び配列番号２７の第８〜９残基間にＡＥが標識されている配列番号２５〜２７のオリゴマーがあげられる。他のＡ型インフルエンザウイルス配列の特異的検出に好ましいプローブとしては、配列番号２８〜３１の蛍光化合物が標識されたオリゴマーがあげられる。Ｂ型インフルエンザウイルス配列の特異的検出に好ましいプローブとしては、、好ましくは、配列番号４８及び４９の第９〜１０残基間及び配列番号５０の第７〜８残基間にＡＥが標識されている配列番号４８〜５０のオリゴマーがあげられる。他のＢ型インフルエンザウイルス配列の特異的検出に好ましいプローブとしては、配列番号５１〜５８の蛍光化合物が標識されたオリゴマーがあげられる。

Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルス核酸の検出のためのアッセイの好ましい態様には、インフルエンザウイルス核酸増幅及び検出に用いられる同一反応混合物中の内部調節（ＩＣ）特異的プライマー及びプローブを用いて増幅されて検出される、ＩＣ核酸が含まれる。ＩＣ特異的配列の増幅及び検出は、インフルエンザウイルス特異的シグナルが試験試料中に検出されない場合（すなわち、陰性試料）でも、アッセイの試薬及び条件が適切に用いられたことを示す。ＩＣは、アッセイの定量的結果をもたらす内部校正として用いられてもよい。好ましいＩＣの態様は、インフルエンザウイルスではない天然源（例えば、ＨＩＶ）由来のランダム配列である。好ましいＩＣは、配列番号６５又はそのＲＮＡ転写物であり、このＩＣの増幅のためのプライマーの好ましい態様としては、配列番号６１、６２、６４、６６及び６７のプライマーがあげられる。ＩＣアンプリコンの検出のためのプローブには、本明細書に記載されたアッセイ条件下で、配列番号６５又はその相補体（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に含まれる連続した配列に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１０残基のいかなるオリゴマーも含まれる。好ましいＩＣ特異的プローブは、一端を蛍光化合物で、他の端を消光剤で標識した配列番号６３のオリゴマーが例示される。アッセイ中にＩＣを含む好ましい態様では、ＩＣは、アッセイ中、目的とする分析物と同じように処理される。例えば、標的捕捉工程が試料中のインフルエンザウイルス核酸標的の精製にも用いられる場合、標的捕捉工程には、標的インフルエンザウイルス核酸及び他の試料成分に含まれる混合物からＩＣを精製するためのＩＣに特異的な捕捉オリゴマーが含まれる。配列番号６５のＩＣに特異的な捕捉オリゴマーの好ましい態様としては、配列番号５９及び６０のオリゴマーがあげられる。

一般に、本明細書に記載された組成物を用いて、Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルス核酸の増幅及び検出を示すのに用いられた方法は、以下の工程を含んだ。インフルエンザウイルスＲＮＡは、標的インフルエンザウイルス核酸を、他の試料成分から分離させる固形支持体に結合させる方法を用いて他の試料成分から分離される。好ましい態様では、ウイルスＲＮＡはインフルエンザウイルス分析物の標的特異的捕捉プローブを含む標的捕捉システムを用いるか（例えば、米国特許第６，１１０，６７８号、第６，２８０，９５２号及び第６，５３４，２７３号に記載された方法の工程を用いる）、又は、核酸の分離のための非特異的な方法（米国特許第５，２３４，８０９号）を用いて、他の試料成分から分離された。他の試料成分からウイルスＲＮＡを非特異的に分離するには、核酸を固形支持体に可逆的に付着させて、その後、付着した核酸を実質的な水溶液で洗浄して抽出して（例えば、QIAAMP（商標） viral RNA Mini kit, Qiagen Inc.を用いる）行った。単離したインフルエンザウイルス核酸は、ＴＭＡ又はＰＣＲ増幅を用いてゲノムを包含する特異的な標的配列を増幅し、増幅産物は増幅反応の完了後又は増幅中に検出された（すなわち、リアルタイム検出）。リアルタイム検出では、蛍光粒子標識プローブ（例えば、分子ビーコン）は、プローブがその標的配列にハイブリダイズする場合のみ、検出シグナルが発生するように用いられ、蛍光は標準的なフローサイトメトリーを用いて検出された。一般的に、アッセイは、（異なる５’蛍光粒子で）２つの異なるプローブであるインフルエンザウイルス特異的プローブ及びＩＣ特異的プローブを検出した。蛍光は、反応物をインキュベートして、反応中の時間間隔で異なる波長で蛍光を検出するシステム（例えば、DNA Engine OPTICON（商標）2 system or CHROMO4（商標）Real-Time PCR Detector, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）を用いて検出した。各チャネル中のリアルタイム検出蛍光シグナルは、標準的な方法を用いて分析した。例えば、検出されたシグナルは、反応ごとのデータ点（相対蛍光度対時間）に対して最適なカーブを作成するために正規化され、結果は、シグナルが予め規定しておいたレベルに適合するか上回る場合、発生時間として報告された。

ＴＭＡベースアッセイを比較するために、リアルタイム逆転写ＰＣＲベースアッセイ（ＲＴ−ＰＣＲ）を、標準的なＰＣＲ反応成分（TAQMAN（登録商標）が提供するOne-Step ＲＴ−ＰＣＲ Master Mix Reagents Kit, Applied Biosystems, Inc.）を含む５０μｌ反応物中の０．９ｐｍｏｌ／μｌのプライマー（Ａ型インフルエンザウイルスに配列番号６８及び配列番号６９又はＢ型インフルエンザウイルスに配列番号７１及び配列番号７２）及び０．２ｐｍｏｌ／μｌのプローブ（Ａ型インフルエンザウイルスに配列番号７０及びＢ型インフルエンザウイルスに配列番号７３）を用いて行った。インキュベーションは、４８℃３０分、９５℃１０分、９５℃１５秒の４５サイクルの後、冷却し、最後に６０℃１分という条件を用いて行った。標的増幅産物とハイブリダイズする分子ビーコンプローブの増幅及び検出は、４５サイクル各々で得られた蛍光シグナルを読み込む、リアルタイム蛍光検出のための開口システム（CHROMO4（商標）, Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用いて行った。リアルタイム蛍光シグナルは解析され、分析物の検出は、標準的な方法を用いて蛍光発生カーブから算出した。

リアルタイムＴＭＡベースアッセイは、主として分析物核酸、増幅試薬（APTIMA（商標）reagent, Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA）、Ｔ７プロモータープライマー（９ｐｍｏｌ／反応含有）、プロモーターがない第２プライマー（１５ｐｍｏｌ／反応）及びアンプリコン検出のための分子ビーコンプローブ（０．２−０．３ｐｍｏｌ／反応）を４０μｌ反応液（標準的な９６穴プレート１ウェル中に不活性化オイルで覆うか、蒸発を防ぐために装置で密封する）に含む反応混合物中で行った。標的核酸、プライマー及びプローブの混合物は、６０℃１０分間インキュベートし、４２℃で５分間冷却してＲＴ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼ含有酵素試薬を添加した後、混合物を混合して（例えば、３０秒間ボルテックス）、蛍光の検出を３秒ごとに実行する間、等温増幅のために４２℃で７５〜１００分間インキュベートした。増幅及び検出工程は、リアルタイム２色蛍光検出のために、インキュベーションと開口チャネル蛍光光度計（GHROMO4（商標）, Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用いて行った。一般的に、上記のように、標的インフルエンザウイルス核酸のためのプライマー及びプローブ並びにＩＣ特異的プライマー及びプローブを含む反応混合物を含む、ＩＣを含むアッセイでは、各プローブを、別個に検出可能な５’蛍光粒子で標識した。リアルタイム蛍光シグナルを解析して、検出シグナル（発生時期）を算出した。発生時期は、例えば、検出されたシグナル（相対蛍光単位又はＲＦＵ）を分析する方法を用いて算出したが、このシグナルはシグナル検出時間（ＲＦＵ（ｔ）データ点）に関連し、ＲＦＵ（ｔ）データ点が所定の閾値に到達した時間である発生時期（「Ｔ−ｔｉｍｅ」）を測定した（２００５年３月１０日に出願された米国出願第６０／６５９，８７４号、Ｓｃａｌｅｓｅら、に詳細に記載）。簡潔には、ＲＦＵ（ｔ）データは、バックグラウンドシグナル（「ｎｏｉｓｅ」レベル）を差し引いて処理され、カーブ（ＲＦＵ対時間）は所定の最小点及び最大点の間のデータにカーブを最適化するために正規化される。一般的に、高濃度の分析物を含む試料は、カーブが高勾配となり、発生時期が早まる。本明細書に記載される実施例では、試料は時として、既知量の標的インフルエンザウイルス核酸（Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡで反応ごとの「対数コピー」として表される）を含有し、平均（ｍｅａｎ）発生時期（平均Ｔ時間）は同一に行った複製試験として測定される。平均発生時期は、例えば、分析物の単一の既知量を比較するような、異なるアッセイ条件の相対効果を測定するために比較し、ＰＣＲベースアッセイを用いて検出した発生時期を、ＴＭＡベースアッセイを用いて比較した。ＩＣを含むＴＭＡベースアッセイでは、ＩＣは、標的インフルエンザウイルス核酸の増幅と同一反応でＩＣ特異的プライマーを用いて増幅した配列番号６５からインビトロで作製した既知量のＲＮＡ転写物である。一般的に、Ａ型インフルエンザウイルスのアッセイでは、ＩＣ特異的プライマーは配列番号６１（０．５ｐｍｏｌ／反応）及び配列番号６２（１５ｐｍｏｌ／反応）であり、Ｂ型インフルエンザウイルスのアッセイでは、ＩＣ特異的プライマーは配列番号６４（０．５ｐｍｏｌ／反応）及び配列番号６２（１５ｐｍｏｌ／反応）であり、上記アッセイでは共に、配列番号６３（０．７５ｐｍｏｌ／反応）のＩＣ特異的検出プローブを用いた。

リアルタイム検出を伴うＴＭＡベースのＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイは、他の呼吸器系ウイルス、通常、口腔又感染に関連する微生物（細菌及び真菌）及びいくつかのヒトインフルエンザウイルス亜型に対して試験する場合、各インフルエンザウイルス標的に１００％特異的となった。４年間にわたってインフルエンザの時期に採取した臨床試料について行った試験では、本明細書で記載したＴＭＡベース及びＰＣＲベースアッセイを比較した場合、感受性及び特異性が１００％一致したことが示された。リアルタイム検出を伴うＴＭＡベースアッセイは、ウイルス核酸の検出のためのリアルタイムＰＣＲベースアッセイに要する時間よりも短い時間で得られた試料中のインフルエンザウイルスの存在を示す、好都合な陽性検出結果であった。例えば、リアルタイム検出を伴うＰＣＲベースアッセイが典型的には陽性結果を得るのに２時間又はそれ以上を要するのに、リアルタイム検出を伴うＴＭＡベースアッセイは、一般的には、増幅反応開始から４５分未満で陽性の結果を得られた。

他に特に特定しない限り、通常、本明細書中に記載したＴＭＡベースアッセイで用いられる試薬としては、以下のものがあげられる。試料輸送試薬：１１０ｍＭラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、１５ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、１５ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、ｐＨ６．７。溶解バッファー：７９０ｍＭＨＥＰＥＳ、２３０ｍＭコハク酸、１０％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ及び６８０ｍＭＬｉＯＨ一水和物。標的捕捉試薬（ＴＣＲ）：２５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１．８８ＭＬｉＣＩ、３１０ｍＭＬｉＯＨ、１００ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ６．４及びそれらに共有結合する（ｄＴ）_１４オリゴマーがある２５０μｇ／ｍｌの常磁性体粒子（０．７〜１．０５μ粒子、Ｓｅｒａ−Ｍａｇ（商標）ＭＧ−ＣＭ）。洗浄溶液：１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭＮａＣＩ、６．５ｍＭＮａＯＨ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン及び０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５。増幅試薬：プライマー及びプローブを添加してもよい、１２５ｍＭＨＥＰＥＳ、２６．７ｍＭｒＡＴＰ、３３．３ｍＭｒＧＴＰ、ｒＣＴＰ及びＵＴＰを各５ｍＭ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを各１．３３ｍＭ、８％（ｗ／ｖ）トレハロース、ｐＨ７．７の濃縮溶液。ＴＭＡ酵素：反応毎約９０ＵμｌのＭＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）及び反応毎約２０ＵμｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（１ＵのＲＴは１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを１０分間３７℃で、２００−４００μＵのオリゴ−ｄＴ−感作ポリＡ鋳型を用いて取り込み、１ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡに１ｎｍｏｌのＡＴＰに１時間３７℃でＤＮＡ鋳型中でＴ７プロモーターを用いて取り込む）。ＡＥ標識プローブのプローブ試薬：（ａ）１００ｍＭＬｉ−スクシネート、３％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、１０ｍＭメルカプトエタンスルホン酸（ＭＥＳ）及び３％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、又は（ｂ）１００ｍＭＬｉ−スクシネート、０．１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ及び１０ｍＭＭＥＳの溶液。ハイブリダイゼーション試薬：（Ｃ−型）１００ｍＭコハク酸、２％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、１００ｍＭＬｉＯＨ、１５ｍＭアルドリチオール（ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ）−２、１．２ＭＬｉＣＩ、２０ｍＭＥＤＴＡ及び３．０％（ｖ／ｖ）エタノール、ｐＨ４．７。選択試薬：非結合オリゴマーのＡＥ標識を加水分解するために、６００ｍＭホウ酸、１８２．５ｍＭＮａＯＨ、１％（ｖ／ｖ）オクトキシノール（ｏｃｔｏｘｙｎｏｌ）（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）、ｐＨ８．５〜９．２。ＡＥ標識の検出試薬は検出試薬Ｉ：１ｍＭ硝酸及び３２ｍＭＨ_２Ｏ_２、並びに検出試薬ＩＩ：１．５ＭＮａＯＨ（米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，７４４号及び第５，６５８，７３７号参照）。

インフルエンザウイルスの増幅及び検出のためのＴＭＡベースアッセイ
本実施例は、共に、同一アッセイ条件中で増幅及び検出される内部コントロール（ＩＣ）を用いるＡ型インフルエンザウイルス検出のためのＴＭＡベースアッセイ（ＦｌｕＡアッセイ）及びＢ型インフルエンザウイルス検出のためのＴＭＡベースアッセイ（ＦｌｕＢアッセイ）を示す。

ＴＭＡベースＦｌｕＡアッセイは、Ａ型インフルエンザウイルス標的の量を変動させて用いて（配列番号１のＲＮＡ転写物を反応毎０〜６．７対数コピー）、実質的に上記のように実行したＴＭＡ反応において、配列番号８（９ｐｍｏｌ／反応）及び配列番号２１（１５ｐｍｏｌ／反応）のプライマー並びに配列番号２９の蛍光粒子標識プローブ（０．３２ｐｍｏｌ／反応）を用いた。反応は、ＩＣ成分がある場合とない場合（配列番号６１及び６２のプライマー、配列番号６３のプローブ及び配列番号６５のＩＣ標的ＲＮＡ転写物を反応毎０又は２．３対数コピー）で行った。各反応の６回複製を行い、標準の９６穴プレートの１ウェル各反応は、適当な標的オリゴヌクレオチドを含有する増幅試薬の３０μｌを用いて、６０℃１０分間及び４２℃５分間でインキュベートした後、ＴＭＡ酵素を酵素試薬中の各反応物に添加して（反応毎１０μｌ）反応物を混合して（３０秒間ボルテックス）、４５〜６０分間４２℃で、上記のように、時間間隔で蛍光プローブシグナルが検出される間（ＣＨＲＯＭＯ４（登録商標）器具内で）、増幅インキュベーションした。試験の結果を、Ａ型インフルエンザウイルス分析物のシグナルの平均発生時期として（算出した標準偏差（ＳＤ）で）表３に示す。陰性コントロール試料（Ａ型インフルエンザウイルス標的を含まない）は、陽性試料の発生時期の算出のために、バックグラウンドノイズシグナルをもたらした。結果は、Ａ型インフルエンザウイルス標的の検出のためのアッセイのダイナミックレンジは、ウイルス標的の１．７〜６．７対数コピーであり、ＩＣはウイルス標的希釈範囲（６．７対数コピーまで）を超えて検出されたことを示す。

個々のＴＭＡベースアッセイは、配列番号２１の第２プライマー（１５ｐｍｏｌ／反応）で、異なるプロモータープライマー（配列番号８、９、１０及び１２、各々別個に９ｐｍｏｌ／反応で試験した）を用いて増幅した２．７又は３．７対数コピーのＡ型インフルエンザウイルス標的（配列番号１の転写物）を用いた以外は、上記と実質的に同様の手順を用いて行い、アンプリコンを配列番号２９の蛍光粒子標識プローブ（８ｐｍｏｌ／反応）を用いて検出した。陽性シグナルの同様な結果が、異なるプライマーの組み合わせを用いたこれらの試験で得られたが、ある組み合わせでは、シグナルの発生時間が短くなったことが測定されて、増幅でさらに有用であった。配列番号８及び２１のプライマーでは発生時間は２０．９〜２５．８分であり、配列番号９及び２１のプライマーでは発生時間は３０．４〜３４．８分であり、配列番号１０及び２１のプライマーでは発生時間は１９．４〜２７．９分であり、配列番号１２及び２１のプライマーでは発生時間は１９．８〜２５．８分であった。

ＴＭＡベースのＦｌｕＢアッセイは、Ｂ型インフルエンザウイルス特異的プライマー及びプローブ以外は同様の条件を用いて行った。１の態様では、配列番号３９（９ｐｍｏｌ／反応）及び配列番号４４（１５ｐｍｏｌ／反応）のプライマーは、Ｂ型インフルエンザウイルス標的量を変動させて（配列番号３２のＲＮＡ転写物を反応毎０〜７．７対数コピー）増幅するために用いて、アンプリコンを配列番号５２（８ｐｍｏｌ／反応）の蛍光粒子標識プローブを用いて検出した。反応は、実質的に上記のように行い、ＩＣ成分がある場合とない場合（配列番号６４及び６２のプライマー、配列番号６３のプローブ及び反応毎０又は２．３対数コピーである配列番号６５のＲＮＡ転写物であるＩＣ標的）で行った。これらＦｌｕＢアッセイの結果を、Ｂ型インフルエンザウイルス分析物に関するシグナルの発生の平均時間を表した表４（算出された標準偏差（ＳＤ））に示す。陰性コントロール試料（インフルエンザウイルス標的なし）の結果は、陽性試料の発生時間を算出するのにバックグラウンドノイズシグナルとして機能する。これらの結果は、ＦｌｕＢアッセイのダイナミックレンジがＢ型インフルエンザウイルス標的の１．７〜７．７対数コピーであり、ＩＣがＢ型インフルエンザウイルス標的の反応毎に５．７対数コピーまで検出されたことを示す。

個々のＴＭＡベースのＦｌｕＢアッセイを、上記のような条件を用いて行ったが、同様の結果をもたらした配列番号５２、５５及び５８の異なる蛍光粒子標識プローブを用いて検出した。これらのＴＭＡベースのＦｌｕＢアッセイでは、反応毎にＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡ標的を８対数コピーで増幅するためのプライマーは配列番号３９（３ｐｍｏｌ／反応）及び配列番号４４（１５ｐｍｏｌ／反応）であった。検出プローブは各々（約０．３ｐｍｏｌ／反応）を上記のように、７複製増幅及び検出アッセイで別個に試験した。これらのアッセイでは、平均発生時間は：配列番号５２プローブで１４．０±０．１６分、配列番号５５プローブで１０．７±０．２２分及び配列番号５８プローブで１２．０±０．３３分であった。配列番号５１、５２、５３、５６及び５７の蛍光粒子標識プローブを用いること及びＢ型インフルエンザウイルス標的ＲＮＡ（反応毎４．３対数コピー）量を少量にした以外は同様の条件を用いて行った別の実験では、平均発生時間は：配列番号５６プローブで２４．９±０．１２分、配列番号５７プローブで２５．８±０．０５分、配列番号５２プローブで２６．５±０．３０分、配列番号５３プローブで２６．６±０．５９分及び配列番号５１プローブで３１．８±０．４８分であった。

同様の試験では、ＴＭＡベースのＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイを、異なるＩＣプライマーの組み合わせを用いて行った。ＦｌｕＡアッセイでは、配列番号９及び２１のＡ型インフルエンザウイルス特異的プライマーは、Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（反応毎３．７対数コピーの配列番号１の転写物）を増幅し、アンプリコンは配列番号２９の蛍光粒子標識Ａ型インフルエンザウイルス特異的プローブを用いて検出した。ＦｌｕＢアッセイでは、配列番号３９及び４４のＡ型インフルエンザウイルス特異的プライマーは、Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（反応毎４．７対数コピーの配列番号３２の転写物）を増幅し、アンプリコンは配列番号４８の蛍光粒子標識Ａ型インフルエンザウイルス特異的プローブを用いて検出した。ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイでは共に、ＩＣ特異的オリゴマーの異なる組み合わせをＩＣ（反応毎２．３対数コピーの配列番号６５のＲＮＡ転写物）を増幅するために用いた：配列番号６２のプライマー（１０ｐｍｏｌ／反応）を配列番号６１、６４、６６又は６７の約０．５ｐｍｏｌ／反応のプライマーと組み合わせて、ＩＣアンプリコンを、配列番号６３の蛍光粒子標識プローブを用いて全ての反応で検出した。これらの試験の結果は、ＩＣ特異的プライマーの全ての組み合わせが、アッセイのための各インフルエンザウイルス標的の検出を妨げることなくＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイで用いられ、配列番号６１のプロモータープライマーがＦｌｕＡアッセイには最適であり、配列番号６４のプロモータープライマーがＦｌｕＢアッセイには最適であったことが示された。

ＴＭＡベースのＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイ特異性
本実施例は、試料が、正常なヒトの口腔叢又は呼吸器系の感染で通常見られる他の細菌やウイルス病原体を含有する場合、各試験で目的とするウイルス標的を特異的に検出するが、陽性シグナルはもたらさないような、ＴＭＡベースのＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイの特異性を示す。ＴＭＡベースのＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイは、公知の細菌やウイルスを含むがＡ型インフルエンザウイルス又はＢ型インフルエンザウイルス核酸（陽性コントロールを除く）を含有しない試料を試験したことを除いて、実質的に実施例１に記載されたとおりに行った。すなわち、アッセイは、他の細菌やウイルス核酸と交差反応をしないことを示す陰性の結果をもたらした。ＩＣＲＮＡを、アッセイ条件並びに増幅及び検出工程が、試料中のＩＣ標的（又は交差反応標的）を検出するために適切に行われたことを示すために全ての試験に含ませた。

ＴＭＡベースの、ＩＣを含むＦｌｕＡ試験及び同一のＩＣを含むＦｌｕＢ試験を用いて、公知のウイルスを含有する試料を各々別個に試験した。個々のＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイは、Ａ型インフルエンザウイルス又はＢ型インフルエンザウイルスの標的を含む陽性コントロール試料を用いて同一の条件で同時に行った。陽性コントロールには、４つの採取源からのＡ型インフルエンザウイルス核酸及び２つの採取源からのＢ型インフルエンザウイルス核酸（American Type Culture Collection （ＡＴＣＣ）アクセッション番号を以下に示す）を含み、各々を反応あたり１０^５及び１０^２コピーで個々に試験した。Ａ型インフルエンザウイルスの陽性コントロール試料としては以下があげられる：Ａ／ＰｏｒｔＣｈａｌｍｅｒｓ／１／７３（Ｈ３Ｎ２）（ＡＴＣＣＶＲ−８１０）、Ａ／Ｍａｌ／３０２／５４（ＭＮ１）（ＡＴＣＣＶＲ−９８）及びＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／８／６８（Ｈ３Ｎ２）（ＡＴＣＣＶＲ−５４４）の分離株並びにＦｌｕＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ（Ｈ１Ｎ１）のインビトロでのＲＮＡ転写物（the Center for Disease Control （CDC）, Atlanta, GAからの分離株）。Ｂ型インフルエンザウイルスの陽性コントロール試料としては以下があげられる：Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１／５９（ＡＴＣＣＶＲ−２９６）のインビトロでのＲＮＡ転写物及びＢ／Ｌｅｅ／４０（ＡＴＣＣＶＲ−１０１）の分離株。

ＴＭＡベースのＦｌｕＡアッセイは、配列番号８（９ｐｍｏｌ／反応）及び第１〜３残基がＬＮＡである配列番号２１（１５ｐｍｏｌ／反応）のプライマー並びにＴＭＡアンプリコンのリアルタイム検出のための配列番号２９の分子ビーコンプローブ（０．２６７ｐｍｏｌ／反応）を用いて行った。反応には、配列番号６１及び６２のプライマー（各々０．５及び１５ｐｍｏｌ／反応）を用いて増幅されたＩＣ（配列番号６５のＲＮＡ転写物を２００コピー／反応）が含まれ、ＩＣアンプリコンは配列番号６３の分子ビーコンプローブ（０．６ｐｍｏｌ／反応）を用いてリアルタイムに検出された。他の陽性コントロールを、公知の量のＡ型インフルエンザウイルス標的（配列番号１のＲＮＡ転写物を反応毎２又は５対数コピー）を含む試料を用いた以外は、同一の条件を用いて同時に試験した。

ＴＭＡベースのＦｌｕＢアッセイは、配列番号３９（９ｐｍｏｌ／反応）及び第１〜３残基がＬＮＡである配列番号４４（１５ｐｍｏｌ／反応）のプライマー並びにＴＭＡアンプリコンのリアルタイム検出のための配列番号５２の分子ビーコンプローブ（０．２６７〜０．３２ｐｍｏｌ／反応）を用いて行った。反応には、配列番号６４及び６２のプライマー（各々０．５及び１５ｐｍｏｌ／反応）を用いて増幅されたＩＣ（配列番号６５のＲＮＡ転写物を２００コピー／反応）が含まれ、ＩＣアンプリコンは配列番号６３の分子ビーコンプローブ（０．６ｐｍｏｌ／反応）を用いてリアルタイムに検出された。陽性コントロールを、公知の量のＢ型インフルエンザウイルス標的（配列番号３２のＲＮＡ転写物を反応毎２又は５対数コピー）を含む試料を用いた以外は、同一の条件を用いて同時に試験した。

ＴＭＡベースのＦｌｕＡアッセイでは、Ａ型インフルエンザウイルス核酸を含有する全ての試験試料（陽性シグナルの平均発生時間は１３．９分であった）について陽性結果が、Ｂ型インフルエンザウイルス核酸を含有する全てのコントロール試料について陰性結果が得られた。同様に、ＴＭＡベースのＦｌｕＢアッセイでは、Ｂ型インフルエンザウイルス核酸を含有する全ての試験試料（陽性シグナルの平均発生時間は２１．９分であった）について陽性結果が、Ａ型インフルエンザウイルス核酸を含有する全てのコントロール試料について陰性結果が得られた。

試験した試料中に含まれる通常の正常な病原性細菌種及び分離株（ＡＴＣＣアクセッション番号）は以下のとおりである：Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ（ＡＴＣＣ１０５８０）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（ＡＴＣＣ８４６７）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（ＡＴＣＣ１５３１１）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｉａｃｅｐａｃｉａ（臨床分離株）、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ１８８０４）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔｒｉａｔｕｍ（ＡＴＣＣ６９４０）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２９２１４）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ１９４３３）、Ｆｌｕｏｒｉｂａｃｔｅｒｂｏｚｅｍａｎｉｉ（ＡＴＣＣ３３２１７）、Ｆｌｕｏｒｉｂａｃｔｅｒｄｕｍｏｆｆｉｉ（ＡＴＣＣ３３２７９）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＡＴＣＣ３３３９１）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＡＴＣＣ７９０１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ２３３５７）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｏｎｇｂｅａｃｈｅａｅ（ＡＴＣＣ３３４８４）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（３型ＡＴＣＣ３３１５５；４型ＡＴＣＣ３３１５６；６型ＡＴＣＣ３３２１５及び１１型ＡＴＣＣ４３１３０）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａｓｕｂｓｐ．ｆｒａｓｅｒｉ（５型ＡＴＣＣ３３２１６）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔｔａｒｈａｌｉｓ（ＡＴＣＣ２５２３８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ２７８５３及びＡＴＣＣ９０２７）、Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ２５９３３）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２５９２３）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１４９９０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）（ＡＴＣＣ１３８１３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ（ｖｉｒｉｄａｎｓｓｔｒｅｐ）（ＡＴＣＣ３３３９９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ（ＡＴＣＣ２５１７５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｏｒａｌｉｓ（ＡＴＣＣ１０５５７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ３５０８８）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）（ＡＴＣＣ１２３４４）及びＴａｔｌｏｃｋｉａｍｉｃｄａｄｉａｅ（ＡＴＣＣ３３２０４）。分離株は、適当な培養液で培養し、１μｌの細胞ループを、１５０μｌの溶解試薬（コハク酸緩衝界面活性溶液）を含む超遠心管に加えて、ボルテックスして、９５℃１０分間インキュベートして細胞を溶解させた。溶解物は試験をするまで冷凍保存（−２０℃）し、アッセイに用いる前に解凍して水に希釈（１：１００）した。微生物溶解物を用いて行ったＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイでは、どの溶解物からも陽性反応は得られなかったが、陽性反応は、アッセイが微生物溶解物に存在する核酸と交差反応しなかった適当な試薬で適切に行われたことを示す内部コントロール（ＩＣ）から検出された。陽性コントロール（Ａ型又はＢ型インフルエンザウイルス核酸含有）は、各アッセイで目的とする標的のみに陽性結果をもたらし、目的とするウイルス標的のためのＴＭＡベースのＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイの特異性を証明した。

アッセイを、潜在的な呼吸器系病原体である公知の非ヒトインフルエンザを用いて、ＴＭＡベースのＦｌｕＡ又はＦｌｕＢアッセイの交差反応を試験するために同様に行った。以下のウイルス（ＡＴＣＣアクセッション番号）を含有する試料を試験した：１型アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｉｄ７１株、ＡＴＣＣＶＲ−１）、４型アデノウイルス（ＲＩ−６７株、ＡＴＣＣＶＲ−４）、７型アデノウイルス（Ｇｏｍｅｎ株、ＡＴＣＣＶＲ−７）、１１型アデノウイルス（Ｓｌｏｂｉｔｓｋｉ株、ＡＴＣＣＶＲ−１２）、１８型アデノウイルス（ＤＣ株、ＡＴＣＣＶＲ−１９）、２９型アデノウイルス（ＢＰ−６株、ＡＴＣＣＶＲ−２７２）、コロナウイルス２２９Ｅ（グループ１型、ＡＴＣＣＶＲ−７４０）、コロナウイルスＯＣ４３（グループ２型、ＡＴＣＣＶＲ−７５９）、１型パラインフルエンザウイルス（臨床分離株及びＡＴＣＣＶＲ−１３８０）、２型パラインフルエンザウイルス（臨床分離株及びＧｒｅｅｒ株ＡＴＣＣＶＲ−９２）、３型パラインフルエンザウイルス（臨床分離株）、４ａ型パラインフルエンザウイルス（Ｍ−２５株、ＡＴＣＣＶＲ−１３７８）、ライノウイルス（臨床分離株）及び呼吸器系合胞体ウイルス（ＲＳＶ）（臨床株；ＢＷＶ／１４６１７／‘８５株、ＡＴＣＣＶＲ−１４００及びＡ−２株、ＡＴＣＣＶＲ−１５４０）。上記のウイルス及び４年間のインフルエンザの季節に採取した個々の臨床分離株を含む、計４２のウイルス試料を試験した。ウイルスＲＮＡを、核酸を支持体上で非特異的に収集して、収集した核酸を洗浄して、当該核酸を支持体から水溶液に溶出する標準的なプロトコール（QIAAMP（商標） Viral RNA Mini Vacuum Protocol, Qiagen Inc.）を用いて抽出した。全てのウイルス核酸は、抽出後すぐに試験するか、試験するまで凍結保存（−７０〜−８０℃）した。試験した全ての非インフルエンザウイルス核酸では、ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイ共に、非インフルエンザウイルス核酸については陰性結果をもたらしたが、アッセイが、非インフルエンザウイルス核酸と交差反応しない適当な成分で適切に行われたことを示すＩＣについては陽性結果をもたらした。インフルエンザウイルス標的核酸を含む全ての陽性コントロールは、ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイに特異的な、目的とする標的に適当な陽性反応をもたらした。すなわち、ＦｌｕＡアッセイは、Ｂ型インフルエンザウイルスではなくＡ型インフルエンザウイルスを検出したが、ＦｌｕＢアッセイは、Ａ型インフルエンザウイルスでなく、Ｂ型インフルエンザウイルスを検出した。これらの結果は、ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイが、その目的とするインフルエンザウイルス標的に特異的であり、呼吸器系試料に潜在的にみられる、他のヒトウイルス標的とは交差反応しないことを示す。

インフルエンザウイルス検出のためのＴＭＡベース及びＰＣＲベースのアッセイの比較
本実施例は、ＴＭＡ及びＰＣＲの増幅方法に基づく系特異的試験を用いた、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスの陽性検出のための時間を比較する試験を記載する。結果は、ＴＭＡベースアッセイは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法に基づくアッセイで得られた結果よりも迅速な検出結果をもたらしたことを示す。

ＴＭＡベースのＦｌｕＡアッセイは、配列番号９（３ｐｍｏｌ／反応）及び配列番号２１（１５ｐｍｏｌ／反応）のプライマーを用いて配列番号１の標的ＲＮＡ転写物（反応毎１〜７対数コピー）を増幅し、配列番号２９の蛍光粒子標識プローブ（８ｐｍｏｌ／反応）を用いてアンプリコンを検出して、実質的に実施例１に記載したように行った。配列番号２１のプライマーは、１つは完全ＤＮＡで、もう一つは、第１〜３残基のＬＮＡを欠いたＤＮＡという２系統で別個に試験した。６複製アッセイを各条件で行った。ＴＭＡベースのＦｌｕＢアッセイは、配列番号３９（３ｐｍｏｌ／反応）及び配列番号４４のプライマーを用いて配列番号３２の標的ＲＮＡ転写物（反応毎１〜７対数コピー）を増幅して、配列番号５２の蛍光粒子標識プローブ（８ｐｍｏｌ／反応）を用いてアンプリコンを検出して、実質的に実施例１に記載したように行った。６複製アッセイを各条件で行った。

ＦｌｕＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイは、配列番号６８及び６９のプライマーを同一のＲＮＡ標識をＴＭＡベースのＦｌｕＡアッセイで増幅するために用いて、及び、配列番号７０の蛍光粒子標識プローブを増幅産物を検出するために用いて、実質的に上記のように行った。ＦｌｕＢのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイは、配列番号７１及び７２のプライマーを同一のＲＮＡ標識をＴＭＡベースのＦｌｕＢアッセイで増幅するために用いて、及び、配列番号７３の蛍光粒子標識プローブを増幅産物を検出するために用いて、実質的に上記のように行った。含まれる各５０μｌの反応混合液には、標準試薬（TAQMAN（登録商標） One-Step RT- PCR Master Mix Reagents Kit, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）が含まれ、製造業者から指示された条件で用いて、増幅及び検出はサーモサイクラー及び蛍光光度計の装置（OPTICON（商標）2 system又はCHR0M04（商標）Real-time PCR Detector, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）を用いて行った。

比較試験の結果は、ＦｌｕＡアッセイについては表５に、ＦｌｕＢアッセイについては、表６に示す。結果は、増幅反応開始から測定した、陽性シグナルの発生時間の平均（ｍｅａｎ）として示した（算出した場合は±標準偏差）。結果は、ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢの標的について共に、同数の標的では、ＰＣＲベースアッセイで見られる陽性反応よりも前にＴＭＡベースアッセイが陽性反応をもたらすことを示す。表５の結果は、ＬＮＡ含有プライマーを用いたＴＭＡベースのＦｌｕＡアッセイが、特に標的が少ない試験では、完全ＤＮＡプライマーを用いたＴＭＡベースアッセイと比較して、増幅動態が向上したことを示す。

個々の実験では、ＴＭＡベースのＦｌｕＢアッセイを、個々の反応で、配列番号３９のプロモータープライマー（３ｐｍｏｌ／反応）を異なる合成系の配列番号４４のプライマーを組み合わせて（完全ＤＮＡ又は、第１〜３位にＬＮＡがあるＤＮＡ若しくは、第１〜４位にＬＮＡがあるＤＮＡを全て１５ｐｍｏｌ／反応で用いた）用いて、同様に行った。反応は、ＦｌｕＢのＲＮＡ転写物標的を反応毎に２．７及び３．７対数コピーで増幅し、アンプリコンを配列番号５２の蛍光粒子標識プローブを用いて検出した。これらのアッセイの結果は、ＬＮＡ含有の配列番号４４のプライマーは、配列番号４４の完全プライマーと比較すると、増幅及びアッセイ動態が向上したことを示す。

臨床試料中のインフルエンザウイルスの検出
本実施例は、リアルタイムでアンプリコンを検出するＴＭＡベースのＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイが、同数の１９臨床試料で、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲベースアッセイを行った場合よりも、標的インフルエンザウイルスを含有する試料で迅速に陽性結果をもたらすことを示す。アッセイは、標的インフルエンザウイルスのＲＮＡ転写物を調製試料核酸のアリコートに置き換えて用いた以外は、実質的に実施例３に記載した方法で行った。ＴＭＡベースアッセイのいくつかには、実質的に実施例２に記載したＩＣが含まれた。全てのアッセイには、陰性コントロール（標的なし）及び陽性コントロール（目的とする標的インフルエンザウイルスのＲＮＡ転写物を２又は５対数コピー）が含まれた。全ての陰性コントロールは陰性結果がもたらされた。

ＴＭＡベースのＦｌｕＡアッセイは、標的としてＦｌｕＡのＲＮＡ転写物の代わりに調製臨床試料核酸のアリコートを用いた以外は実質的に上記のように行った。アッセイでは、配列番号８及び２１のプライマー並びに配列番号２９の蛍光粒子標識プローブを用いた。ＴＭＡベースアッセイは、ＩＣ標的（配列番号６５のＲＮＡ転写物を２００コピー）、配列番号６１及び６２のＩＣ特異的プライマー及び配列番号６３のＩＣ特異的プローブを含むＩＣを用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲのＦｌｕＡアッセイは、標的としてＦｌｕＡのＲＮＡ転写物の代わりに調製臨床試料核酸のアリコートを用いた以外は実質的に上記のとおり行った。ＲＴ−ＰＣＲのＦｌｕＡアッセイは、５５サイクルのＰＣＲ増幅で配列番号６８及び６９のプライマー並びに配列番号７０のプローブを用いた。

ＴＭＡベースのＦｌｕＢアッセイは、標的としてＦｌｕＢのＲＮＡ転写物の代わりに調製臨床試料核酸のアリコートを用いた以外は実質的に上記のように行った。アッセイでは、配列番号３９及び４４のプライマー並びに配列番号４８の蛍光粒子標識プローブを用いた。ＴＭＡベースアッセイは、ＩＣ標的（配列番号６５のＲＮＡ転写物を２００コピー）、配列番号６４及び６２のＩＣ特異的プライマー及び配列番号６３のＩＣ特異的プローブを含むＩＣを用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲのＦｌｕＢアッセイは、標的としてＦｌｕＢのＲＮＡ転写物の代わりに調製臨床試料核酸のアリコートを用いた以外は実質的に上記のとおり行った。ＲＴ−ＰＣＲのＦｌｕＢアッセイは、５５サイクルのＰＣＲ増幅で配列番号７１及び７２のプライマー並びに配列番号７３のプローブを用いた。

ＦｌｕＡの臨床試料は、臨床試験研修室（Warde Medical Center）から提供され、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ（Ｈ１Ｎ１）分離株及び他の標本、又は、複数のインフルエンザの時期に患者から採取した分離株が含まれていた。ＦｌｕＢの臨床試料は６つの異なる分離株又は標本を示す。臨床試料は、増幅前に、非特異的方法（QiAmp RNA extraction kits、製造業者が推奨する条件を用いて）を用いて試料中の核酸を精製して処理した。臨床試料から単離された核酸を含有する溶出物の５μｌのアリコートを反応ごとに用いた。

ＦｌｕＡ試験の結果を表７に示し、ＦｌｕＢ試験の結果を表８に示した。表７の結果は、ＴＭＡベースの及びＰＣＲベースアッセイでは、陽性の又は陰性の標本について矛盾のない結果が得られたことを示し、また、ＴＭＡベースアッセイの陽性試料についての発生時間が、ＩＣを含むＴＭＡベースアッセイを用いて試験した試料Ａ１以外は、一貫してＰＣＲベースアッセイで試験したのと同様の試料よりも迅速であったことを示す。陰性標本（Ａ１１）はＴＭＡベースアッセイでＩＣについて陽性結果をもたらし、その結果は、Ａ型インフルエンザウイルスについて真に陰性であったことを示す。表８の結果は同様に、ＴＭＡベース及びＰＣＲベースアッセイは、陽性のＴＭＡベースアッセイの発生時間が、ＰＣＲベースアッセイよりも迅速であったこと以外は標本について矛盾のない結果をもたらした。完全なアッセイを行うのに要する合計時間、すなわち、単に増幅反応で検出されたシグナルの発生時間だけではない、上記時間は、同様の標的についてのＰＣＲベースアッセイ（約１２０分）と比較して、ＦｌｕＡ及びＦｌｕｔＢ共にＴＭＡベースアッセイの方が短かった（約４５分）。

化学発光プローブを用いたインフルエンザウイルスの増幅配列の検出
本実施例は、Ａ型インフルエンザウイルス又はＢ型インフルエンザウイルス核酸の転写関連増幅の後にＡ型インフルエンザウイルス又はＢ型インフルエンザウイルスの増幅配列に特異的なＡＥ標識プローブを用いた増幅産物の検出をすることを含んだアッセイを示す。アンプリコンにハイブリダイズするプローブは、均一系アッセイフォーマットで検出される化学発光シグナルを発する。

ＴＭＡベースのＦｌｕＡアッセイでは、標準的なＴＭＡ反応を行って、２つのプライマー（配列番号７、９又は１１を配列番号２１、２２又は２４と組み合わせた）の異なる組み合わせを用いて、５００，０００コピーのＦｌｕＡ標的ＲＮＡ（配列番号１の転写物）の配列を増幅した。増幅の前に、第７〜８間の残基をＡＥで標識した配列番号２６のプローブのハイブリダイゼーションをＴＭＡ反応で産生したアンプリコンの検出のために用いた。陰性コントロールは、ＦｌｕＡ標的ＲＮＡを含まない反応混合物中で同一に行ったアッセイである。増幅の前に、アンプリコンをＡＥ標識プローブにハイブリダイゼーション試薬中に６０℃３０分でハイブリダイズさせた後、室温で５分間冷却した。その後、非結合のプローブ中のＡＥラベルを、選択試薬を用いて６０℃１０分間の後１５分間室温でインキュベートして選択的に加水分解した。化学発光シグナルを、検出試薬Ｉを用いて誘導して、その後検出試薬ＩＩで中和して、化学発光を照度計（LEADER（登録商標） HC, Gen-Prove Incorporated）で相対発光量（ＲＬＵ））として、実質的に上記したように検出した（米国特許第５，２８３，１７４号及び第５，６５６，７４４号、Ａｒｎｏｌｄら及び米国特許第５，６５８，７３７号、Ｎｅｌｓｏｎら第２５欄第２７〜４６行目；Nelson et al., 1996, Biochem. 35:8429- 8438 at 8432）。アッセイの結果を表９に示す。均一系化学発光検出システムはまた、ＦｌｕＡ特異的増幅オリゴマーの異なる組み合わせを用いることにより転写関連増幅の後にＡ型インフルエンザウイルス核酸を検出することも示す。

ＦｌｕＢ標的配列に特異的なプローブは、同様に、Ｂ型インフルエンザウイルス配列を特異的に検出することが示される。これらのアッセイでは、合成ＲＮＡ標的（配列番号３３を２ｐｍｏｌ／反応）を、（第８〜９の残基が標識された）配列番号４８、（第９〜１０の残基が標識された）配列番号４９及び（第７〜８の残基が標識された）配列番号５０のＡＥ標識プローブで、ＴＭＡ反応混合物を模倣する混合物中で混合して、実質的に上記のように検出工程を行った。すなわち、ＦｌｕＢ標的配列の検出を、開始ＲＮＡ標識からのアンプリケーション（amplication）なしに直接行った。これらのアッセイ（各条件ｎ＝５）の平均的な結果を表１０に示す。これらの結果は、Ｂ型インフルエンザウイルス標的配列が、ＴＭＡベースアッセイの増幅に起因する結果と類似の条件でＡＥ標識プローブを用いて検出されることを示す。

インフルエンザウイルス検出のためのＴＭＡベースアッセイ
本実施例は、ＴＭＡベースのＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイが、インフルエンザウイルス検出を手動又は自動化装置を用いて行った場合に同程度の結果をもたらすことを示す。ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイはともに、当該方法の工程を、各アッセイがアッセイの各標的、Ａ型インフルエンザウイルス又はＢ型インフルエンザウイルスのための標的特異的オリゴマーを含有する以外は同一条件で行った。

試料は、各アッセイ（ＦｌｕＡアッセイのための配列番号１のＲＮＡ転写物又はＦｌｕＢアッセイのための配列番号３２のＲＮＡ転写物を０、２５０、５００、１０００又は５０００コピー／ｍｌ）のための合成標的を含有するように調製し、各インフルエンザウイルス標的（ＦｌｕＡアッセイに配列番号６及びＦｌｕＢアッセイに配列番号３５）に特異的な標的捕捉プローブ（２００ｐｍｏｌ／ｍｌ）を含有する、０．５ｍｌの最終容量中で標的捕捉試薬（ＴＣＲ）と混合した。標的捕捉を、標的ＲＮＡ、捕捉プローブ及びＴＣＲを含有する混合物を６２℃３０分、その後、３０分間室温でインキュベートした。捕捉したインフルエンザウイルス核酸がついた磁性粒子を、磁場を用いて容器の内部部分から分離して、試料溶液を取り除いた。粒子上の捕捉した標的核酸を１ｍｌ／反応の洗浄溶液で洗浄して、粒子を磁気的に分離して洗浄溶液を取り除いた。捕捉したインフルエンザウイルス標的核酸がついた洗浄した粒子を、７５μｌの適当な増幅オリゴマー（ＦｌｕＡアッセイのための３００ｐｍｏｌ／ｍｌの配列番号１０及び５００ｐｍｏｌ／ｍｌの第１〜３残基にＬＮＡがある配列番号２１；ＦｌｕＢアッセイのための３００ｐｍｏｌ／ｍｌの配列番号３９及び５００ｐｍｏｌ／ｍｌの第１〜３残基にＬＮＡがある配列番号４４）を含有するＴＭＡ用の核酸増幅試薬に懸濁した。ＴＭＡ反応液を６２℃１０分、その後４２℃５分でインキュベートして、ＴＭＡ酵素を加えて混合し、インキュベーションを４２℃６０分間続けた。検出は、アッセイの目的とする標的に特異的なＡＥ標識プローブ（ＦｌｕＡアッセイのための５Ｘ１０^７ＲＬＵ／ｍｌの配列番号２６及びＦｌｕＢアッセイのための５Ｘ１０^７ＲＬＵ／ｍｌの配列番号４８）を用いて、実質的に実施例５に記載したように行い、均一系アッセイフォーマットで発生した化学発光シグナルを検出して測定した。

ＦｌｕＡ及びＦｌｕＢアッセイを、各アッセイ条件に１０複製用いて各々行った。アッセイ工程は、手動又は自動化システムを用いて行った（詳細は米国特許第６，６０５，２１３号及び第６，８４６，４５６号を参照）。これらのアッセイの結果をＦｌｕＡアッセイについては図１に、ＦｌｕＢアッセイについては図２に示す。図１は、手動で行ったアッセイ（白）又は自動化システムを用いて行ったアッセイ（黒）で、各々の試験したＡ型インフルエンザウイルス標的量（２５０〜５０００コピー／ｍｌ）についてＴＭＡベースのＦｌｕＡアッセイで検出されたシグナル（平均ＲＬＵ）のグラフである。図２は、手動で行ったアッセイ（白）又は自動化システムを用いて行ったアッセイ（黒）で、各々の試験したＢ型インフルエンザウイルス標的量（２５０〜５０００コピー／ｍｌ）についてＴＭＡベースのＦｌｕＢアッセイで検出されたシグナル（平均ＲＬＵ）のグラフである。図１及び図２に示された結果は、工程を手動で行っても自動化システムで行っても、双方のＴＭＡベースアッセイは、各々目的とする標的インフルエンザウイルス核酸を２５０コピー／ｍｌ又はそれ以上検出したことを示す。

図１は、異なる量のＡ型インフルエンザウイルス標的（２５０〜５０００コピー／ｍｌ）を、手動で実行するか（白）、又は、自動システムを用いて（黒）行ったＴＭＡベースアッセイで検出されたシグナル（相対発光量、ＲＬＵ）を示す棒グラフである。図２は、異なる量のＢ型インフルエンザウイルス標的（２５０〜５０００コピー／ｍｌ）を、手動で実行するか（白）、又は、自動システムを用いて（黒）行ったＴＭＡベースアッセイで検出されたシグナル（相対発光量、ＲＬＵ）を示す棒グラフである。

Claims

配列番号３〜配列番号１８及び配列番号２１〜配列番号３１、若しくはそれらと完全に相補的な配列、又はそれらのＤＮＡ同等物からなる配列から構成されるＡ型インフルエンザウイルスに特異的な、少なくとも２つの核酸オリゴマーを含み、該核酸オリゴマーが、配列番号７〜配列番号１８からなる配列から選択される少なくとも１のオリゴマー、及び、配列番号２１〜配列番号２４からなる配列から選択される少なくとも１のオリゴマーを含む、組成物。
配列番号２５〜配列番号３１からなる配列から選択される少なくとも１のオリゴマーをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
少なくとも１のオリゴマーが、少なくとも１の２’−メトキシＲＮＡ基を含む、請求項１記載の組成物。
少なくとも１のオリゴマーが、オリゴマーの５’末端に少なくとも１のロックされた核酸（ＬＮＡ）残基を含む、請求項１に記載の組成物。
配列番号２５〜配列番号３１からなる配列から選択されるオリゴマーが、直接的又は間接的にオリゴマー配列に結合した検出可能な標識を含む、請求項２に記載の組成物。
標識が均一系アッセイシステムで検出可能である、請求項５に記載の組成物。
Ａ型インフルエンザウイルスに特異的な少なくとも２つの核酸オリゴマーがキットの形態である、請求項１に記載の組成物。
試料中のＡ型インフルエンザウイルスの核酸を検出する方法であって、以下の：
実質的に等温条件下で増幅産物を産生するために、試料中に含まれるＡ型インフルエンザウイルス核酸中の標的配列を、インビトロで核酸ポリメラーゼを用いて増幅する工程であって、
前記Ａ型インフルエンザウイルスの標的配列が、配列番号７〜配列番号１８からなる配列から選択される少なくとも１のオリゴマー、及び、配列番号２１〜配列番号２４からなる配列から選択される１のオリゴマーを用いて増幅される、工程；ならびに、
前記増幅産物を検出する工程、
を含む、前記方法。
検出工程で、Ａ型インフルエンザウイルスの標的配列の増幅産物を検出するために配列番号２５〜配列番号３１からなる配列から選択される少なくとも１のプローブを用いる、請求項８に記載の方法。
内部調節オリゴマーをもたらす工程；内部調節オリゴマーに含まれる標的配列を増幅する工程；及び、内部調節オリゴマーから作製される増幅産物を検出する工程であって、それにより、前記方法の増幅工程及び検出工程が適当に行われたことを示す前記工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
増幅工程の前に、Ａ型インフルエンザウイルス核酸を含む試料からインフルエンザウイルス核酸を単離する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
請求項１に記載の組成物であって、前記核酸オリゴマーが、以下：配列番号７と配列番号２１；配列番号８と配列番号２１；配列番号９と配列番号２１；配列番号１０と配列番号２１；配列番号１１と配列番号２１；配列番号１２と配列番号２１；配列番号７と配列番号２２；配列番号９と配列番号２２；配列番号１１と配列番号２２；配列番号７と配列番号２４；配列番号９と配列番号２４；および配列番号１１と配列番号２４からなる群より選択される、組成物。
配列番号２９をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
配列番号２６をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
請求項８に記載の方法であって、前記核酸オリゴマーが、以下：配列番号７と配列番号２１；配列番号８と配列番号２１；配列番号９と配列番号２１；配列番号１０と配列番号２１；配列番号１１と配列番号２１；配列番号１２と配列番号２１；配列番号７と配列番号２２；配列番号９と配列番号２２；配列番号１１と配列番号２２；配列番号７と配列番号２４；配列番号９と配列番号２４；および配列番号１１と配列番号２４からなる群より選択される、方法。
配列番号２９をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
配列番号２６をさらに含む、請求項１５に記載の方法。