CN101460632B - 用于检测人和禽类流感病毒的核酸引物及探针 - Google Patents

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Abstract

提供了用于制备检测人或动物受试者中的流感病毒的动力学聚合酶链式反应(kPCR)检测法中所用的引物和探针的核酸序列。kPCR检测法的起始材料可以是DNA或RNA，检测法可以单重检测方式进行，用于检测单种流感病毒，或以多重检测方式进行，用于检测多种流感病毒。引物和探针可用于检测和定量A型和B型流感病毒(分别为INFA和INFB)，已表明它们可有效检测和定量所有已知的INFA亚型，即H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8和H9。

Description

用于检测人和禽类流感病毒的核酸引物及探针
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)主张于2006年4月28日提交的美国临时专利申请60/795,785的优先权，其内容全部整合在本文中。
技术领域
概括地说，本发明涉及用于检测人和禽类流感病毒的诊断检测法的核酸序列。更具体地，本发明涉及特异检测禽流感A(“INFA”)病毒亚型和人INFA及流感B(“INFB”)病毒株的引物和探针。所述序列可用于在单重检测中检测样品中的流感病毒，或用于在多重检测中对样品中的流感病毒以及其它呼吸道疾病相关的流感病毒进行检测。
发明背景
共有三种类型的流感病毒：INFA、INFB和流感病毒C(“INFC”)。毒性最大的流感病毒是流感病毒A，它可以感染人、鸟、猪、马、海豹、鲸及其它动物。以野生鸟类作为天然宿主的流感病毒被称为禽流感病毒，而以人为天然宿主的流感病毒被称为人流感病毒。经驯养的鸟类，例如火鸡和家鸡，可因禽流感病毒导致致命的病害，通过与感染的驯养鸟类接触而感染了禽流感病毒的其它动物和人类也是如此。驯养的鸟类可通过与感染的野生鸟类、其它感染的动物的直接接触、与含病毒的表面、或污染的食物或水的接触而被禽流感病毒感染。迄今为止，那些具有交叉种而且可感染人的禽流感病毒是近来人流感大流行的原因。通常仅感染人的流感B和流感C病毒的毒性小于流感A。流感B病毒是流感在局部地区流行的原因，而不是造成世界范围内流感流行的原因。毒性最弱的流感C病毒从来没有造成过任何世界范围内人流感的流行。
流感病毒是一种基因组含有8个单链负义RNA节段的有包膜病毒。病毒包膜具有宿主来源的脂双层，脂双层含有两种主要的表面病毒糖蛋白：血凝素(“HA”)和神经氨酸酶(“NA”)，它们是负责病毒附着的蛋白。在包膜中，基质蛋白M1和核蛋白(“NP”)保护病毒的RNA。流感病毒的A、B及C型命名是基于M1基质蛋白和NP的抗原特性。8个RNA节段编码至少10种病毒蛋白：节段1、2和3编码三种病毒聚合酶蛋白；节段4编码HA；节段5编码NP；节段6编码NA；节段7编码M1和M2基质蛋白，其中前者具有离子通道活性，包埋在病毒包膜中；片段8编码非结构蛋白NS1和NS2，其中前者阻断宿主的抗病毒应答，而后者参与病毒颗粒的组装。
通过病毒表面的HA和NA蛋白的亚型可鉴定INFA病毒。INFA病毒有16种不同的HA亚型和9种不同的NA亚型，所有这些亚型均以多种不同组合存在于病毒表面；因此，H5N1病毒在其表面具有HA5蛋白和NA1蛋白。所有INFA病毒的亚型均在鸟类中发现。一般在人类中发现的INFA亚型是H1、H2和H3亚型(H2亚型通常不传播)，以及也已知可感染人的H5、H7和H9亚型。在鸟类中发现的INFA病毒中，H5和H7亚型是毒性最大的；H5和H7亚型的病毒株可进一步分为低致病性禽流感(“LPAI”)或高致病性禽流感(“HPAI”)。HPAI的特征是HAs对多种广泛存在于细胞器和器官系统中的细胞蛋白酶的切割高度敏感；相反，LPAIs需要特定的有活性的细胞外蛋白酶、例如限制在呼吸腔和肠内的胰蛋白酶才可进行切割。在感染HPAI H5或H7病毒的驯养鸟类中，90％到100％的鸟类将死亡。由于LPAI H5和H7病毒可分别进化为HPAI H5和H7病毒，因此LPAI H5和H7病毒在驯养鸟群中的爆发也必须被严密监控。在动物和人类中传播的禽流感病毒的亚型包括H7N7和H3N8病毒，它们可在马中导致疾病，还有H1N1、H1N2和H3N2病毒，它们通常在人类中传播。INFB和INFC病毒未根据亚型进行分类。
自从1997以来，以前只感染鸟类的INFA病毒开始感染人，并具有致命后果。已在1997(H5N1，香港)、1999(H9N2，中国大陆和中国香港)、2002(H7N2，美国维吉尼亚)、2003(H5N1，中国大陆和中国香港；H7N7，荷兰；H9N2，香港；H7N2，美国纽约)；2004(H5N1；泰国和越南；H7N3，加拿大)；及2005(H5N1，泰国和越南)年报道了确切的造成人员死亡的禽流感病毒的爆发。
由于禽IFNA病毒被迁徙的鸟类携带到全世界，并且已知病毒可通过抗原性漂移和变异及遗传漂变而快速变异，因此用于监测禽流感病毒的方法必须具有足够的特异性来检测抗原性和遗传性多变的流感病毒株。
检测禽INFA的传统方法包括噬菌斑测定，例如培养增强的酶联免疫吸收检测法(“CE-ELISA”)，及在鸡胚卵中进行的病毒分离。病毒的血凝素和神经氨酸酶亚型是在检测后通过血清型方法进行测定的。虽然传统方法具有足够的灵敏度，但其过程很耗时；例如，在鸡胚卵中的病毒分离需要1到2周才能获得结果。
为了克服传统方法检测禽INFA时在时间和花费方面的不利因素，开发了使用已知的实时逆转录酶聚合酶链式反应(“实时RT-PCR”)技术，也称为动力学RT-PCR(“kRT-PCR”)的检测方法。这种方法可用来源于INFA和INFB基质及核蛋白基因的序列来检测INFA和INFB。Stone et al.，J.VIROL.METH.117：103-112(2003)；Smithet al.，J.CLIN.VIR.28：51-58(2003)；Ward et al.，J.CLIN.VIR.29：179-188(2004)。对于那些直接检测INFA H5和H7HA亚型的方法，已发现这些方法的结果并不比传统的HA亚型的血清型方法优越。Spackman et al.，J.CLIN.MICROBIOL.40(9)：3256-3260(2002)；Munch et al.，ARCH.VIROL.146：87-97(2001)；Lee&Suarez，J.VIROL.METH.119：151-158(2004)。
为了可检测和治疗人与动物的INFA和IFNB病毒，本领域需要开发可检测所有INFA和INFB病毒株及亚型的高灵敏度的方法。
发明概述
本发明通过提供所设计的、可针对所有INFA和INFB病毒株及INFA亚型的扩增引物与检测探针，满足了本领域对能够检测人或动物受试者中所有INFA和INFB病毒株及亚型的高灵敏度检测法的需求。对于检测禽类INFA，本发明的引物和探针组可检测在各种禽类物种中均保守的HA基因的H5亚型的核酸序列(表1)。对于检测人INFA，本发明的引物和探针组可检测在许多个人样品(multiple humansample)中均保守的基质(M1)基因的核酸序列(表2)。对于检测人INFB，本发明的引物和探针组可检测在许多个人样品中均保守的非结构(NS1和NS2)基因的核酸序列(表3)。由于此处所述的方法可用于开发检测在流感病毒(任何种)任何节段中表达的任何基因的保守核酸序列，因此可理解为本发明的方法并不限定于此处所述的禽类和人类的引物及探针组。
在本发明的一个实施方案中，提供了检测和定量样品中流感病毒的方法，包括使用由SEQ ID NOs.1-11制备的引物和探针进行动力学聚合酶链式反应检测法。
在本发明的一个实施方案中，流感病毒是禽流感病毒A(INFA)，所述的引物和探针由SEQ ID NOs.1-5制备，用于检测和定量禽INFA的H5亚型的全部两个谱系。共有两个禽流感A/H5病毒的谱系：欧亚谱系和美洲谱系。来自这两个谱系的病毒在遗传上是不同的。所有已知的人流感H5感染都是由来自欧亚谱系的高致病性病毒引起的。
在本发明的另外的实施方案中，流感病毒是人流感病毒A(INFA)，所述的引物和探针由SEQ ID NOs.6-8制备，用于检测和定量人INFA的基质基因(matrix gene)，及
在本发明的又一个技术方案中，流感病毒是人流感病毒B(INFB)，所述的引物和探针由SEQ ID NOs.9-11制备，用于检测和定量人INFB的非结构基因。
在本发明更进一步的技术方案中，引物和探针用于动力学聚合酶链式反应检测法(“kPCR”)中，以检测和定量流感病毒。对于kPCR检测法，样品可以是从人或动物受试者获得的DNA样品或从人或动物受试者获得的RNA样品。当起始样品是RNA时，则kPCR检测法是动力学逆转录酶PCR(kRT-PCR)检测法。
本发明的其它方面、有益效果及特征将在下面的描述中列出，显然，本领域技术人员可籍此检验或实施本发明。
附图的简要描述
图1所示的是本发明中INFA基质检测法的检测概况。
图2(a)到(h)所示的是用本发明的pan-INFA基质检测法和USDA-ARS所用的pan-INFA基质检测法针对一系列(a panel of)INFA亚型，对相同的禽病毒储液进行筛选的比较分析结果。
图3所示的是用本发明的禽H5特异检测法和USDA-ARS所用的禽H5特异检测法针对H5N2亚型(美洲谱系)，对相同的禽病毒储液进行筛选的比较分析结果。
图4所示的是用本发明的禽H5特异检测法和USDA-ARS的禽H5特异检测法对相同的包被(armored)RNA(欧亚谱系)的比较分析结果。
发明的详细描述
定义：
下面列出的定义仅用于辅助理解所述和请求保护的本发明；定义和命名并非旨在限制本发明的范围。
如说明书和后附的权利要求中所用的英文原文中的单数形式“a”“an”及“the”包括其复数形式，除非文中另有明确说明。
在本文用法中，术语“疾病流行”是指在同一时间快速传播、而且影响某地区或种群中多个个体的流感爆发。
在本文用法中，术语“疾病大流行”是指在大范围地区传播、而且影响大部分种群的流感的地区流行。
术语“抗原性漂移”是指随时间持续发生的病毒的小改变。对流感病毒而言，抗原性漂移可产生不被针对早期流感病毒株的抗体所识别的、新型禽流感病毒株。抗原性漂移在禽流感病毒中普遍发生。
术语“抗原转变”是指可产生新病毒的突然的巨大的变化。对流感病毒而言，抗原转变可产生新的流感病毒亚型。与抗原性漂移不同，抗原转变不经常发生。
术语“遗传漂变”是指在小型的、分离的种群中基因出现频率的随机波动，它并不是自然选择的结果。
术语“突变”是指基因组DNA序列的任何变化。
术语“同源性”是指由于在某些先前的时间点上，某个性状独特的可遗传的变化所导致的亲缘关系。该术语用来指来源于具有相同起源的共同祖先的DNA、基因或其它性状。
术语“保守的”是指在序列、结构或功能上的相似性。
术语“比对”是指为了进行系统发生分析而将同源分子序列进行并列的任何的系列技术。
术语“共有序列”是指线性的系列核苷酸，通常具有用来确定同源序列的共同特征的缺口和某些简并性。共有序列是理想化序列，其中每个位置均代表多个实际序列比较时出现频率最高的碱基(核苷酸)。
术语“靶标”是指流感A病毒的核酸序列。
术语“样品”是指来自任何受试者的生物样品，它用于检测是否存在一种或多种疾病，例如流感病毒或者其它呼吸道症状或疾病。这种样品可以包括来自皮肤或任何器官、血液、血浆、黏液、唾液等的组织样品。
术语“受试者”是指可获得样品的生物体。在本发明的上下文中，受试者通常是人类患者；但受试者也可以包括诸如猪、马这样的哺乳动物、或者海洋哺乳动物、或者诸如野生鸟类或家禽这样的非哺乳动物。
术语“扩增引物”是指与cDNA或RNA靶标分子互补的寡核苷酸，它可提供底物的3′-OH末端，任何DNA聚合酶均能够以5’到3’方向将核苷酸添加到正在延长的DNA链末端。
术语“探针”是指可在合适的条件下与扩增的靶标核酸选择性杂交的寡核苷酸。探针序列可以为正义(例如，互补)序列(+)或者是编码链/正义链的反义(例如，反向互补)序列(-)。在动力学PCR形式中，检测探针可由具有5’报告染料(R)和3’猝灭染料(Q)的寡核苷酸组成。荧光报告染料(即，FAM(6-羧基荧黄素)等)典型地位于3’末端。在扩增和检测过程中检测探针作为TAQMAN
Figure G2007800151781D0006085439QIETU
探针。
此处所用术语“核酸”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)，适当时候也指核糖核酸(RNA)。该术语也应理解为包括由核苷酸类似物所组成的RNA或DNA的等价物、类似物，以及可应用在所述技术方案中的单链(正义或反义)及双链多核苷酸。表达序列标签(“ESTs”，即，通过测序表达基因的一端或两端而产生的、通常为200到500个核苷酸长度的小片段DNA序列)、染色体、cDNAs、mRNAs和rRNAs是所谓的核酸分子的代表性实施例。
在本文用法中，术语“寡核苷酸”包括多脱氧核糖核苷酸(含2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含D-核糖)、任何其它类型的由嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷组成的多核苷酸，及其它含非核苷酸骨架(例如，可由Anti-Gene Development Group，Corva1lis，Oregon获得的蛋白核酸及合成的序列特异的核酸多聚体，称为NEUGENETM多聚体)或含非标准连接物的多聚体，只要所述多聚体含有可形成如DNA和RNA中的碱基配对和碱基堆积构型中的核酸碱基即可。因此，此处的“寡核苷酸”包括双链和单链DNA、双链和单链RNA及DNA：RNA杂合体，也包括已知的、经修饰的寡核苷酸类型，例如，其中一个或多个天然存在的核苷酸被其类似物替代的寡核苷酸；含核苷酸间修饰的寡核苷酸——例如具有不带电连接物(例如，甲基磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、负电荷连接物(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、及正电荷连接物(例如氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷酸三酯)的寡核苷酸，含侧链基团、例如蛋白质(包括核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多L-赖氨酸等)的寡核苷酸，含嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的寡核苷酸、含螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的寡核苷酸、及含烷化剂的寡核苷酸，等等。在术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”并非旨在从长度的角度将其区分开，这些术语可以互换使用。这些术语仅表示分子的一级结构。本文所用的核苷酸和多核苷酸的符号是根据IUPAC-IUBMB生物化学命名联合委员会(参见http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/icbn)来确定的。
寡核苷酸可通过已知方法合成。通常关于合成寡核苷酸的方法的背景资料包括那些涉及基于使用β-氰乙基磷酸保护基团的5’到3’合成的资料。参见，例如de Napoli et al.，GAZZ CHIM ITAL114：65(1984)；Rosenthal et al.，TETRAHEDRON LETT24：1691(1983)；Belagajeand Brush，NUC ACIDS RES10：6295(1977)；关于描述5’到3’合成溶剂相的文献包括Hayatsu and Khorana，J AM CHEM SOC89：3880(1957)；Gaitand Sheppard，NUC ACIDS RES4：1135(1977)；Cramer and Koster，ANGEW CHEM INT ED ENGL7：473(1968)；和Blackburn et al.，J CHEM SOCPART C，at2438(1967)。另外，Matteucci and Caruthers，J AM CHEM SOC103：3185-91(1981)描述了使用磷酸氯化物(phosphochloridites)来制备寡核苷酸；Beaucage and Caruthers，TETRAHEDRON LETT22：1859-62(1981)和Caruthers等的U.S.Pat.No4,415,732描述了使用亚磷酰胺制备寡核苷酸。Smith，AM BIOTECH LAB，pp.15-24(December1983)描述了自动固相寡脱氧核糖核苷酸合成；T.Horn and M.S.Urdea，DNA5：421-25(1986)描述了用二(氰乙氧基)N，N-二异丙基氨基膦进行固相支持的DNA片段的磷酸化。也可参见在Smith，同上；Warner et al.，DNA3：401-11(1984)；及T.Horn and M.S.Urdea，TETRAHEDRON LETT27：4705-08(1986)中引用的参考文献。
术语“核苷酸”和“核苷”是指不仅包括四种天然DNA核苷碱基——即嘌呤碱基鸟嘌呤(G)和腺嘌呤(A)及嘧啶碱基胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的核苷和核苷酸，也包括含RNA嘌呤碱基尿嘧啶(U)、非天然核苷酸碱基异G和异C、通用碱基、简并碱基和其它修饰核苷酸和核苷。当将G或A引入到寡核苷酸碱基对中时，简并碱基由双重简并嘧啶衍生物6H，8H-3，4-二氢嘧啶并[4，5-c][1，2]嗪-7-酮(P)组成，当将C或T引入到寡核苷酸碱基对中时，简并碱基由双重简并嘌呤衍生物N6-甲氧基-2，6，-二氨基嘌呤(K)组成。通用碱基是可替代四种正常碱基的任一种而不显著影响双螺旋的解链特性或寡核苷酸的功能性生化用途的碱基。通用碱基的例子包括3-硝基吡咯和4-、5-、6-硝基吡咯、及2-脱氧肌苷(dI)，仅有后者被认为是“天然的”通用碱基。虽然dI理论上可结合于所有天然碱基，但它主要编码G。
核苷酸与核苷的修饰包括，但并不限定于，嘌呤或者嘧啶基团的甲基化或者酰基化、用不同的杂环结构替代单个嘧啶环或者嘌呤环体系中的单个或两个环、一个或者多个功能性的保护，譬如，使用诸如乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、异丁酰基、苯甲酰基等这样的保护基团。修饰的核苷及核苷酸也包括糖部分的修饰，譬如，其中一个或多个羟基基团被卤素和/或烃基取代基(在后一种情况中典型地为脂肪族基团)所替代，或者作为醚、胺等来发挥功能。修饰的核苷酸及核苷的实施例包括，但并不限定于，1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲硫基-N6-异戊基腺嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、2-硫胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2，2-二甲基鸟嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-(甲基-氨甲基)尿嘧啶、5-(羧基甲基氨甲基)-尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲基酯、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、queosine、肌苷、1-甲基肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、2-氨基嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、6-硫嘌呤及2，6-二氨基嘌呤。
术语“互补”和“基本上互补”是指核苷酸或核酸间的碱基配对例如，在双链DNA分子的两条链之间、或在寡核苷酸引物和待测序或扩增的单链核酸的引物结合位点之间。互补核苷酸通常是A和T(或A和U)，及G和C。在本发明上下文中，应理解所列出的特定序列的长度是示意性的，并不进行限定，而且覆盖相同图谱位置、但具有少数或更多数目碱基的序列被认为是该序列的等价物，而且包括在本发明的范围内，只要它们可与所列出的序列一样杂交到靶标的相同位置上即可。因为已知在杂交时不需要核酸完全互补，因此，此处所述的探针和引物序列可在不丧失作为特异引物和探针的用途的情况下进行某种程度的修饰。通常，具有80％或更高同源性的序列包括在本发明的范围内。在本领域中已知可通过调整杂交条件以增加或降低严格性，即通过调整杂交温度或缓冲液的盐浓度来获得互补和部分互补的核酸序列的杂交。这种所述序列的微小修饰和为了维持特异性而对杂交条件进行的任何必须调整仅需要常规的实验操作，因此是本领域技术人员已知的。
术语“杂交条件”是指时间、温度和pH，及反应物和试剂必要的量和浓度等条件，它足以使至少一部分互补序列相互退火。在本领域已周知，完成杂交所需的时间、温度和pH条件依赖于被杂交的寡核苷酸探针或引物的长度、寡核苷酸探针或引物与靶标间的互补程度、及在杂交反应混合物中存在的其它物质。每个杂交步骤必需的实际条件是本领域已知的，或在无需过量实验的情况下即可可确定。杂交条件也包括使用兼容性的缓冲液，即对引物、探针和其它组分而言为化学惰性、但仍可使互补碱基对间进行杂交。这种缓冲液的选择在本领域的技术人员的知识范围内。
本领域技术人员应理解，从样品中分离DNA和RNA靶标需要不同的杂交条件。例如，如果样品最初是在碱性缓冲液中被裂解，则双链DNA是变性的，而RNA被破坏。相反，如果样品在含有SDS和蛋白酶K的中性缓冲液中收获，则DNA仍保持双链，从而不能与引物和/或探针杂交，而RNA得到保护而没有降解。
术语“支持物”和“底物”可相互使用，是指寡核苷酸探针或引物、分析物分子或其它化学实体可固定其上的固体或半固体表面。合适的支持物材料包括，但不限定于，典型地用于固相化学合成的支持物，例如用于珠子、薄片和微量滴定孔或板的聚合物材料和塑料，实施例包括但不限定于，聚苯乙烯、聚苯乙烯乳胶、聚氯乙稀、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoide)、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯腈、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯和二乙烯基苯-苯乙烯聚合物；多聚物凝胶；琼脂糖，例如SEPHAROSE
Figure G2007800151781D0010085759QIETU
；葡聚糖，例如SEPHADEX
Figure 2007800151781100002G2007800151781D0010085759QIETU
)；纤维素，例如硝基纤维素；纤维聚合物；多糖；硅酸和硅酸物质；玻璃(特别是可控多孔玻璃)和功能型玻璃；陶瓷和金属。
本文所用术语“标记”是指任何可用于提供可检测(优选地为可定量的)信号的原子或分子，可与核酸或蛋白质通过共价键或非共价相互作用(例如，通过离子或氢键、或通过固定化、吸附等)连接。标记通常通过荧光、化学发光、放射性、比色法、质谱、X射线衍射或吸收、磁力、酶活性等提供所检测的信号。标记的实施例包括荧光团、发色团、放射性原子(特别是32p和125I)、电子致密试剂、酶和具有特定结合物的配体。酶典型地通过其活性进行检测。
本文所用术语“靶标扩增”是指酶介导的过程，能够产生数十亿拷贝数的核酸靶标。本领域已知的酶介导的靶标扩增过程的实施例包括PCR、基于核酸序列的扩增(“NASBA”)、转录介导的扩增(“TMA”)、链置换扩增(“SDA”)，和连接酶链反应(“LCR”)。
最广泛使用的靶标扩增过程是PCR，Mullins等在美国专利4,683,195和Mullis在美国专利4,683,202中最先描述了对DNA的扩增。PCR过程是本领域技术人员所熟知的。在PCR技术中，DNA样品与数过量的摩尔的两个长10-30碱基对、与DNA双螺旋每条链的3’末端互补的寡核苷酸引物、过量的摩尔数的未附着的核苷酸碱基(即，dNTPs)、及可催化利用寡核苷酸引物和dNTPs形成DNA的DNA聚合酶(优选地为对热稳定的Taq聚合酶)在溶液中混合。在两条引物中，一条是正向引物，与变性DNA分析物的一条链的3’末端以5’-3’方向结合，另一条是反向引物，与变性DNA分析物的另一条链的3’末端以3’-5’方向结合。将溶液在94-96℃加热，将双链DNA变性为单链DNA。当溶液冷却时，引物可与已分离的链结合，DNA聚合酶通过向引物添加dNTPs而催化生成分析物的新链。当该过程重复时，从引物合成的延伸产物从其互补分子上分离，每个延伸产物作为模板，通过另一条引物合成互补延伸产物。换句话说，从正向引物合成的延伸产物在分离后，可作为模板，通过反向引物合成互补延伸产物。类似地，从反向引物合成的延伸产物在分离后，可作为模板，通过正向引物合成互补延伸产物。在这种方式下，引物间的DNA区域选择性地在每个重复过程中复制。由于在每个循环后，被扩增的序列均加倍，因此在重复该过程数小时后可获得数十亿拷贝数的理论扩增；所以，极小量的DNA可通过PCR在相对较短的时间内扩增出来。
术语“扩增序列”、“扩增产物”和“扩增子”可互换使用，是指PCR终产物的单链序列。
当进行PCR的起始材料是RNA时，则通过逆转录从RNA制备互补DNA(“cDNA”)。然后用如上所述的PCR程序扩增所得到的cDNA。逆转录酶是本领域技术人员已知的、在逆转录病毒中发现的酶，可从RNA序列，例如，以mRNA或ssRNA序列为模板合成互补的DNA单链。在基因工程中，该酶用于从RNA的纯化制备物(例如mRNA或ssRNA)中产生特定的cDNA分子。用于扩增RNA产物的PCR被称为逆转录酶PCR或“RT-PCR”。
术语“动力学PCR”(kPCR)或“动力学RT-PCR”(kRT-PCR)，也分别称为“实时PCR”和“实时RT-PCR”，是指通过与相同或不同寡核苷酸底物偶联的荧光染料分子和猝灭部分而产生的荧光信号对PCR产物进行检测。通常用于kPCR和kRT-PCR的探针的实施例包括以下探针：
Figure G2007800151781D00111
探针、分子信标探针、
Figure G2007800151781D00112
探针、及
Figure G2007800151781D00113
Green探针。简言之，探针、分子信标探针和探针均具有与探针5’末端连接的荧光报告染料(也称为“荧光剂”)和探针3’末端偶联的猝灭部分。在非杂交状态下，荧光和猝灭分子邻近，从而抑制对探针的荧光信号进行检测；在PCR过程中，当聚合酶对结合探针的模板进行复制时，聚合酶的5’核酸酶活性可切割探针，从而在每个复制循环中增加荧光。
Figure G2007800151781D00116
Green探针与双链DNA结合，并在激发下发射光；因此，随着PCR产物积累，荧光不断增加。
术语“单重检测”是指不与其它任何检测同时进行的单个检测。单重检测包括顺次进行的单个检测。
术语“多重检测”是指同时进行的多个检测，其中检测和分析步骤通常平行进行。在本发明的上下文中，多重检测包括单独、或与其它引物和探针联合使用探针和引物来鉴定，例如流感病毒以及其它一种或多种病毒。应理解在本发明的上下文中，用于内部对照的引物和探针和/或其它呼吸道病毒可与INFA和INFA引物和探针在单个多重检测中同时使用。
以下所述的是所请求保护的发明的优选技术方案和实施例。其它关于所述技术方案的功能、目标或结构方面的其它技术方案及其修饰形式均包括在本申请的权利要求中。
本发明的禽和人INFA和人INFB扩增引物和检测探针是通过比对多个序列而得到的共有序列，其中在序列中引入合适的简并和/或通用探针，以解决在INFA和INFB序列中发现的高简并性。
禽流感A引物和探针组
在本发明的一个技术方案中，提供了可扩增和检测禽INFAH5亚型的禽INFA扩增引物和检测探针。H5引物和探针是基于比对55条禽和人INFA H5序列而设计的(表1)。选择H5亚型是由于这些禽亚型可跨物种来感染人类，不需要在猪之类的中间宿主中进行重排。通过选择HA基因序列最高度保守的区域，而且在合适情况下，包括简并和/或通用碱基，从而将禽H5引物和探针组设计为具有可适用于整个HA区域的高度简并性。本发明中H5引物和探针的特异性具有高度特异性，能够从其余16种禽INFA HA亚型中区分出H5禽INFA亚型。
人流感A引物和探针组：
在本发明的另一个技术方案中，提供了可扩增和检测人INFA M1基质基因序列的人INFA扩增引物和检测探针。INFA基质引物和探针是基于比对来自人INFA的13个亚型的414条人基质蛋白基因序列而设计的。通过选择基质最高度保守的区域，而且在合适情况下，包括简并和/或通用碱基，从而将人INFA引物和探针组设计为具有可适用于整个人INFA基因组的高度简并性。通过这样设计引物和探针，本发明的人INFA基质引物和探针可检测所有已知的人INFA亚型。通过比对人INFA基质序列和禽INFA基质序列发现，也可使用人INFA引物和探针来扩增和检测禽INFA。
实施例4所示的是本发明中的人INFA基质引物和探针在通过kRT-PCR来检测组织培养提取物中H1N1和H5N2的INFA基质检测法中的用途。由于INFA基质检测法可用于检测和扩增所有已知的人INFA亚型，因此应理解并认识到实施例4仅是用于检测INFA亚型的INFA基质检测法的示例，而没有以任何方式去限定该检测法只能用于检测H1N1和H5N2亚型。图2(a)到2(h)(实施例6)也表明本发明的人INFA基质引物和探针在检测流感亚型H1、H3、H4、H6、H7、H8和H9中的用途。
人流感B引物和探针组：
在本发明的进一步技术方案中，提供了扩增和检测人INFB非结构基因(NS1和NS2)的人INFB扩增引物和探针。INFB结构基因引物和探针是基于比对117个人节段8(NS1和NS2)基因序列而设计的(表3)。和上述禽及人INFA引物和探针一样，通过选择非结构基因序列最高度保守的区域，而且在合适情况下，包括简并和/或通用碱基，从而将人INFB引物和探针组设计为具有可适用于整个INFB B基因组的高度简并性。
用途
本发明的引物和探针用于受试者是否感染了特定的INFA或INFB病毒株或亚型的诊断分析，所述的受试者可以是禽或人。这种检测包括任何用于临床样品的核酸扩增试验(NAATS)，包括但不限定于，NAAT，例如PCR、RT-PCR、kPCR、kRT-PCR、Southern印迹分析及线性扩增。在本发明的一个优选技术方案中，在kPCR检测中使用引物和探针来检测任何人或动物受试者中的INFA和INFB。
本发明的引物和探针也可用于检测单个样品的单重检测中，以检测单独的INFA或单独的INFB(实施例4所示的是在单重检测中，将本发明的引物和探针用于检测和定量INFA)，或它们可用于检测人样品的多重检测中，以检测一种或多种INFA和INFB(实施例5，表7所示的是在多重检测中将本发明的引物和探针用于检测和定量INFA和INFA)。INFA和/或INFB引物和探针也与其它扩增引物和检测探针组合用于多重检测中，用于检测伴有其它呼吸道微生物，例如副流感1、2、3和4、RSV A和B、偏肺病毒(metapneumovirus)、腺病毒、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)和肺炎军团菌(Legionella pneumophilia)的INFA和/或INFB(实施例5，表8所示的是本发明的引物和探针在板上以多重形式来检测并定量INFA和INFB)。其它病毒，例如鼻病毒(rhinovirus)、副流感病毒(paraflu)呼吸道合胞病毒(“RSV”)不影响本发明的引物和探针的特异性。
本发明的引物和探针也包括在试剂盒中，所述试剂盒用于医生检测表现出流感症的患者中的人和禽流感病毒。这种试剂盒也包括一个或多个检测禽INFA、人INFA或人INFB的引物和探针组。
如前所述，此处所述的引物和探针是设计为检测受试者是否感染INFA或INFB的引物和探针的示例；因此，在本发明的另一个技术方案中，提供了用来制备检测流感病毒的引物和探针的方法，其包含来源于多个流感病毒株和亚型的共有序列，在适当情况下，序列中可整合了简并和/或通用碱基。
应理解，虽然本发明是结合具体的实施方案进行描述的，但上述描述和以下的实施例均是示例性，并非旨在对本发明的范围进行限定。在本发明范围内的其它方面、改进和修饰对本发明所属领域中的技术人员是显而易见的。
本文中所有涉及的专利文献以及公开出版物均作为参考并入本发明中。
以下列出的实施例为本领域的技术人员提供了如何制备和使用本发明组合物的完整说明和描述。这些实施例是本发明的非限定性实施例。
实验
除非特别说明，本发明的操作使用的是分子生物学、生物化学、微生物学等的常规技术，它们均在本领域技术人员的知识范围内。这些技术在文献中有完整的解释。参见，例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版(1989)；寡核苷酸合成(M.J.Gait，ed.，1984)；肽合成操作(M.Bodanszky and A.Bodanszky，2nded.，Springer-Verlag，New York，NY，1994)；核酸杂交(B.D.Haines & S.J.Higgins，eds.，1984)；酶学方法(Elsevier，Inc.，Burlington，MA)。
在以下实施例中，努力确保数字(例如、量、温度等)的准确性，但在进行所述实验时应考虑实验误差和偏差。除非特别说明，比例(parts)为重量比例(parts by weight)，温度是摄氏度，压力为大气压或近似大气压，所有实验成分均可通过商业途径获得。
所用的确定本发明的引物和探针的共有序列的序列是从流感序列数据库获得。Macken et al.，OPTIONS FOR THE CONTROL OFINFLUENZA IV，pp.103-106(A.D.M.E.Osterhaus，N.Cox & A.W.Hampson(eds.)Amsterdam：Elsevier Science，2001)，可在www.flu.lanl.gov网站获得。Vector NTI AlignX软件(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)用于比对同源性序列。
以下注释用于实施例中：“AV”代表禽；“INFA”代表流感A；“INFB”代表流感B；“H5”代表禽INFA的H5亚型；“M”代表基质蛋白基因(M1和M2)；“Seg8”代表非结构蛋白基因(NS1和NS2)；“Fw”代表正向引物；“Rv”代表反向引物；“P”代表探针；“S”代表正义链；“AS”代表反义链；“Ct”代表循环数阈值(在该循环数处，首次检测到高于背景的显著增加的荧光)。
在MX3000PTM实时PCR系统(Stratagene，La Jolla，CA)中实施下述实施例中所用的kRT-PCR检测法，所述系统可对多达90个样品运行约2.4小时。每轮kRT-PCR包括阳性和阴性对照以及由系列稀释的、经定量的INFA RNA病毒培养提取物所组成的定量标准。标准是使用来自检测区(例如，根据所运行的检测法，包括禽H5区、禽或人基质基因区、或人节段8区)的克隆片段产生的、经定量的RNA转录物所赋予的数值。将由病毒提取物标准所赋数值与每个检测中完成的循环数阈值(Ct)进行比较。每个检测均含有在提取过程中加入作为的样品的内部对照(IC)，用以评估检测过程中抑制剂的有效性和存在。检测的特异性通过检测一系列INFA亚型、普通人呼吸道病原体、及正常人呼吸道组织和体液来确定。
实施例1
禽流感A H5亚型
扩增引物和检测探针序列
表1列出的是设计来扩增和检测禽INFA H5亚型的HA基因序列的扩增引物和检测探针组。图谱定位请参考登录号为AJ867074；序列设计是基于55个禽和人INFA H5序列的比对结果。
表1
 
序列名称 图谱位置 序列5′-3′ 链方向
AV INFA H5(EA)Fw01 1505-1528 CGTATGACTACCCGCAGTATTCAG(SEQ ID NO.1) (+)
AV INFA H5(EA)Rv01 1665-1640 CCATAARGATAGACCAGCTACCATGA(SEQ ID NO.2) (-)
AV INFA H5(A)Fw01 1547-1568 GGGAGGAAATAGACGGAGTCAA(SEQ ID NO.3) (+)
AV INFA H5(A)Rv01 1684-1661 ATGATCCATTAGAGCACATCCAAA(SEQ ID NO.4) (-)
AV INFA H5P 1612-1637 R-ACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGC-Q(SEQ ID NO.5) (+)
实施例2
人流感A M1基质基因
扩增引物和检测探针序列
表2列出的是设计来扩增和检测人和禽INFAM1基因序列的扩增引物和检测探针。图谱定位请参考登录号为AY340090的序列；序列设计是基于414个禽和人INFA基质序列的比对结果。
表2
 
序列名称 图谱位置 序列5′-3′ 链方向
INFA M1 S 32-53 CTTCTAACCGAGGTCGAAACGT(SEQ ID NO.6) (+)
INFA M1 AS 233-215 TGGGCACGGTGAGCGTGAA(SEQ ID NO.7) (-)
INFA M1 P 71-91 R-CCRTCAGGCCCCCTCAAAGCC-Q(SEQ ID NO.8) (+)
实施例3
人流感B片段8
扩增引物和检测探针序列
表3列出的是设计来扩增和检测人INFB节段8(NS1和NS2)基因序列的扩增引物和检测探针。图谱定位请参考登录号为AB120439的序列；序列设计是基于117个人INFB NS1和NS2序列的比对结果。
表3
 
序列名称 图谱位置 序列5′-3′ 链方向
INFB NS S 8-31 ACAACATGACCACAACACAAATTG(SEQ ID NO.9) (+)
INFB NS AS 89-67 CACTCCARAATTCCTGCTTCAAA(SEQ ID NO.10) (-)
INFB NS P 40-60 R-CCRGGAGCAACCAATGCCACC-Q(SEQ ID NO.11) (+)
实施例4
INFA单重基质检测法
在kRT-PCR中使用实施例2中的INFA基质引物和探针在单重检测中检测和扩增来自病毒RNA提取物样品中的H1N1和H5N2。INFA基质检测法对H1N1的结果如表4所示，INFA基质检测法对H5N2的结果如表5所示。如表4和6所示的INFA基质检测法的结果表明引物和探针可从很仅具有低拷贝数的样品中成功检测和扩增H1N1和H5N2。
表6总结了INFA基质检测法对具有不同拷贝数的样品的精确性和线性计算。如表6所示，对具有100个或更多拷贝数的具体INFA亚型的检测率是100％。在图1中利用附图描述了INFA基质检测法的检测概要。
表4
Figure G2007800151781D00171
表5
Figure G2007800151781D00181
表6
 
浓度(拷贝数/孔) 检出％ Log线性差异 循环内％CV 循环间％CV 总％CV
50 38.6％ -0.50 57.47 0 57.47
100 100.0％ 0.01 31.39 12.42 33.75
1000 100.0％ 0.02 17.07 9.26 19.42
10,000 100.0％ 0.01 11.34 4.57 12.23
100,000 100.0％ -0.01 9.82 5.18 11.11
1,000,000 100.0％ -0.03 11.64 6.04 13.12
10,000,000 100.0％ -0.06 15.89 7.19 17.45
100,000,000 100.0％ -0.15 13.67 7.46 15.57
实施例5
多重检测
表7所示的是筛选INFA和INFB的多重检测结果，表8所示的是筛选INFA和INFB的多重检测结果；表8特别显示了其它病毒，例如鼻病毒、副流感病毒和RSV的存在不影响本发明的流感引物和探针的特异性。如前所述，所有检测与阴性和阳性对照同时进行。
表7
Figure G2007800151781D00201
表8
Figure G2007800151781D00211
Figure G2007800151781D00221
实施例6
禽INFA检测法对病毒储液进行比较分析
将本发明的INFA禽H5及基质检测法(实施例1、2和4)与USDA-ARS标准化的禽H5及基质检测法进行比较。对相同的禽病毒储液进行两种形式的INFA检测：(1)pan-INFA检测法，使用一系列10倍稀释的、由一系列INFA亚型分离的核酸进行，所述的一系列INFA亚型包含来自已明确表征的血凝素亚型H1、H3、H4、H5、H6、H7、H8和H9的病毒分离物；(2)H5-特异检测法，使用来自H5N2分离物的病毒提取物稀释液制备的、经定量的标准。
如上述实施例1所述讨论中描述的，来实施本发明的INFA基质和H5特异检测法。pan-INFA基质检测法靶定的是基质基因中约202bp(碱基对)的区域，H5-特异检测法靶定的是血凝素基因的180bp的片段。如前所述，本发明的INFA基质引物和探针设计来检测所有目前已知的INFA亚型序列。
利用一步kRT-PCR检测法进行USDA-ARS INFA基质和H5-特异检测，所用热循环仪是：用Bio-Rad Chromo4TM(Hercules，CA)进行INFA基质检测，用Cepheid
Figure G2007800151781D00222
(Sunnyvale，CA)进行H5-特异检测(参见Spackman et al.，J.CLIN.MICROBIOL.40(9)：3256-3260)。
通过检测来自一系列INFA亚型的高滴度病毒储液的系列稀释液测定本发明和USDA-ARS的pan INFA基质检测法所检测的病毒RNA的最低水平(LoD)，所述的一系列INFA亚型包括：H1、H3、H4、H5、H6、H7、H8和H9。通过定量H5N2流感分离物从1.6x106到30拷贝数的高滴度病毒储液的系列稀释物，来测定H5禽INFA检测法的相对灵敏度。相对于来自克隆的基质片段的RNA转录物来赋值H5N2标准。
图2(a)-2(h)图示说明了pan-INFA基质检测法的结果，每个检测法的终点灵敏度(endpoint sensitivity)的结果列在表9(本发明的检测法在图中标示为“Bayer”检测法；Bayer是本发明的受让人)。图2(a)-2(h)所示的是可获得表9数据的系列稀释液(图2(e)仅显示了针对H6N2亚型的一轮试验)。表9明确表明，在所进行的10个检测中的8个检测中，本发明的INFA基质检测法比USDA-ARS INFA基质检测法具有更高的灵敏度(即，更低的LoD)；具体地是H1N1、H3、H5N2、H7、H8、H9N2和3个H6N2检测中的2个检测。总的来说，本发明的pan-INFA基质检测法对一系列亚型(subtype panel)的系列稀释液均具有最低的LoD(提高1到3个10倍数量级)。另外，多数亚型的定量结果是相似的，但H1亚型例外，对该亚型，其中本发明的pan-INFA基质检测法定量的稀释液中的病毒水平比USDA-ARS pan-INFA基质检测法高约50到100倍。
表9
 
PanINFA基质检测法 H1N1 H3 H4 H5N2 H6N2 H6N2 H6N2 H7 H8 H9N2
本发明 10-5 10-6 10-6 10-4 10-6 10-6 10-6 10-4 10-6 10-6
USDA-ARS 10-2 10-4 10-6 10-3 10-5 10-6 10-5 10-2 10-4 10-4
H5特异检测法的结果如图3和4所示。图3所示的是本发明的H5禽INFA检测法在每个反应中可检测和定量到30个拷贝数，而USDA-ARS H5禽INFA检测法在每个反应中定量到80个拷贝数，这说明本发明的H5禽INFA检测法能够比USDA-ARS的H5禽INFA检测法在更低的Ct值处检测H5N2(美洲谱系)。图4所示的是针对包被的RNA欧亚谱系序列，H5禽INFA检测法和USDA-ARS H5禽INFA检测法的比较，本发明的H5禽INFA检测法可检测104和103拷贝数的稀释液，而USDA-ARSH5禽INFA检测法不能检测这些稀释液。
序列表
<110>SIEMENS MEDICAL SOLUTIONS DIAGNOSTICS
<120>用于检测人和禽类流感病毒的核酸引物及探针
<130>1300-0018PCT
<140>
<141>
<150>60/795,785
<151>2006-04-28
<160>11
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>1
cgtatgacta cccgcagtat tcag      24
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>2
ccataargat agaccagcta ccatga    26
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>3
gggaggaaat agacggagtc aa       22
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>4
atgatccatt agagcacatc caaa     24
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成探针
<400>5
acagtggcga gttccctagc actggc   26
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>6
cttctaaccg aggtcgaaac gt      22
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>7
tgggcacggt gagcgtgaa           19
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成探针
<400>8
ccrtcaggcc ccctcaaagc c        21
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>9
acaacatgac cacaacacaa attg    24
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成引物
<400>10
cactccaraa ttcctgcttc aaa    23
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成探针
<400>11
ccrggagcaa ccaatgccac c     21

Claims (7)

1.下述的引物和探针在制备用于检测和定量样品中流感病毒的方法中所用试剂中的用途，所述方法包括用下述的引物和探针进行动力学聚合酶链式反应检测，其中，所述的引物和探针的序列如SEQ ID NOs.1-5所示，其中，SEQ ID NO：1和3为正向引物，SEQ ID NO：2和4为反向引物，SEQ ID NO：5为探针。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述的流感病毒是禽流感病毒A(INFA)。
3.如权利要求2所述的用途，其中所述的引物和探针检测定量禽INFA的H5亚型。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述的引物和探针用于动力学聚合酶链式反应检测(kPCR)中，以检测和定量流感病毒。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述的样品是从人或动物受试者中获得的DNA样品。
6.如权利要求4所述的用途，其中所述的样品是从人或动物受试者中获得的RNA样品。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述的kPCR检测是动力学逆转录酶PCR(kRT-PCR)检测。
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