CN105986043A - H5亚型高致病性禽流感病毒核酸快速检测方法 - Google Patents

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陈继明
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Abstract

本发明属于生物技术领域，它确立了H5亚型高致病性禽流感病毒核酸快速检测方法，含有三个技术要点：确立了核酸检测所需要的引物序列；确立了检测反应种类；确立了检测反应体系和反应条件。该核酸检测方法可以用于H5亚型禽流感病毒的科学研究，也可以用于动物或人的临床诊断检测。

Description

H5 亚型高致病性禽流感病毒核酸快速检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域；具体说来，本发明确立了H5亚型高致病性禽流感病毒的快速检测方法，用于H5亚型禽流感病毒的快速检测，在体外诊断、兽医、食品安全、生物安全等领域有较大的使用价值。
背景技术
禽流感根据致病性的不同，可以分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。其中，高致病性禽流感是由H5和H7亚型的某些毒株引起的疾病。
病毒核酸检测是病毒检测重要方法之一。目前，国内外对H5亚型高致病性禽流感病毒的各种核酸检测方法，包括农业行业标准或国家标准，耗费时间都比较长，如农业行业标准（禽流感病毒RT-PCR检测方法，NY/T 772–2013）至少需要2 h，国家标准（H5 亚型禽流感病毒荧光RT-PCR 检测方法，GB/T 19438.2–2004）至少需要1.2 h，目前没有比这些方法效率更高的检测方法。
发明内容
本发明针对上述现有H5亚型高致病性禽流感病毒检测技术的不足，开展了深入研究和测试，建立了基于重组酶聚合酶扩增技术的H5亚型高致病性禽流感病毒核酸快速检测方法，仅需20 min即可完成检测。该方法包括以下三个方面内容：
（一）确立了核酸检测所需要的引物序列，针对H5亚型禽流感病毒HA基因中保守区域，设计引物序列，其中上游引物序列含有30个碱基，序列为agggaggatggcaaggaatggtagatggtt（即序列表中SEQ ID NO.1），下游上游引物序列含有30个碱基，序列为gctgtagtcggactttgtcataaaggttct（即序列表中SEQ ID NO.2）；
（二）确立了基于重组酶聚合酶扩增技术的快速检测方法；
（三）确立了检测反应体系和反应条件，在聚合酶链式反应管中依次加入纯水9.2 μl、反应缓冲液29.5 μl（含有dATP、dGTP、dTTP、dCTP等四种核苷酸）、第一步所合成的上游引物2.4 μl（浓度为10 μmol/L）、第一步所合成的下游引物2.4 μl（浓度为10 μmol/L）、酶混合物[逆转录酶、能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶]1.0 μl、RNA酶抑制剂1.0 μl、需要检测的流感病毒核酸2.0 μl（从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的）、醋酸镁（280 mmol/L）2.5 μl；然后将反应体系密闭，置于恒温仪（或水浴锅）上进行反应，反应条件为40℃ 20 min；反应结束后，在反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约为345 bp的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
具体实施方式
下面通过实施例，说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于这个实施例。
本实施例用重组酶聚合酶扩增技术，对H5亚型高致病性禽流感病毒进行核酸快速检测，包括如下步骤：
第一步（合成引物）：按照本发明指定的核酸序列（即序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2），人工合成重组酶聚合酶扩增反应所需要的上游引物和下游引物；
第二步（配置反应体系）：在聚合酶链式反应管中依次加入纯水9.2 μl、反应缓冲液29.5 μl（含有dATP、dGTP、dTTP、dCTP等四种核苷酸）、第一步所合成的上游引物2.4 μl（浓度为10 μmol/L）、第一步所合成的下游引物2.4 μl（浓度为10 μmol/L）、酶混合物[逆转录酶、能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶]1.0 μl、RNA酶抑制剂1.0 μl、需要检测的流感病毒核酸2.0 μl（从临床样品或其他样品中用核酸提取试剂盒提取的）、醋酸镁（280 mmol/L）2.5 μl；
第三步（反应）：将第二步配置好的反应体系密闭后，置于恒温仪（或水浴锅）上进行反应，反应条件为40℃ 20 min；
第四步（结果检测）：在第三步的反应产物中加入含有颜色的核酸电泳缓冲液，进行琼脂糖核酸凝胶电泳，如果出现大小约为345 bp的核酸电泳条带，则判断为阳性，否则判断为阴性。
实际应用结果：对96份H5亚型高致病性禽流感病毒标准阳性临床样品进行检测，以及300份标准阴性样品，用上述H5亚型高致病性禽流感病毒快速核酸检测技术进行检测，结果显示该技术的灵敏度为100.0%，特异性为100.0%。
<110> 中国动物卫生与流行病学中心
<120> H5亚型高致病性禽流感病毒核酸快速检测方法
<160> 2
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据H5亚型禽流感病毒的基因组中保守的核酸序列而设计，作为H5亚型禽流感病毒核酸检测所需要的上游引物
<400> 1
agggaggatggcaaggaatggtagatggtt 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据H5亚型禽流感病毒的基因组中保守的核酸序列而设计，作为H5亚型禽流感病毒核酸检测所需要的下游引物
<400> 2
gctgtagtcggactttgtcataaaggttct 30

Claims (5)

1.H5亚型高致病性禽流感病毒核酸快速检测方法，采用重组酶聚合酶扩增反应，其特征是可以检出所有H5亚型禽流感病毒。
2.H5亚型高致病性禽流感病毒核酸快速检测方法，其特征有两个：一是可以检出所有H5亚型禽流感病毒；二是采用重组酶聚合酶扩增反应。
3.H5亚型高致病性禽流感病毒核酸快速检测方法，其特征有三个：一是可以检出所有H5亚型禽流感病毒；二是采用针对H5亚型禽流感病毒HA基因保守的区域而设计的一对引物；三是采用重组酶聚合酶扩增反应。
4.H5亚型高致病性禽流感病毒核酸快速检测方法，可采用重组酶聚合酶扩增反应，其特征有两个：一是可以检出所有H5亚型禽流感病毒；二是检测反应采用的一条引物的序列为agggaggatggcaaggaatggtagatggtt，或与gctgtagtcggactttgtcataaaggttct序列有10个或10个以上的碱基序列相同的序列（本段文字中，引物序列均为5撇端至3撇端，a、t、g、c表示相应的碱基）。
5.H5亚型高致病性禽流感病毒核酸快速检测方法，其特征有两个：一是采用重组酶聚合酶扩增反应；二是检测反应采用的两条引物，其序列分别为agggaggatggcaaggaatggtagatggtt和gctgtagtcggactttgtcataaaggttct，或与这两个序列有10个或10个以上的碱基序列相同的序列（本段文字中，引物序列均为5撇端至3 撇端，a、t、g、c表示相应的碱基）。
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