CN107937608B

CN107937608B - 一种基于rpa技术检测aiv病毒的特异性引物及其应用

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Publication number: CN107937608B
Application number: CN201711321040.6A
Authority: CN
Inventors: 郭效珍; 高月花; 胡峰; 于可响; 刘存霞; 李玉峰; 刘玉山; 史玉颖; 黄兵; 马秀丽; 路晓; 宋敏训
Original assignee: Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shandong Agricultural Seed Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2017-12-12
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: CN107937608A

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物及其应用。本发明所述基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，是根据AIV的H5型N1、N2、N6基因序列设计的引物，该引物体系可特异性的对H5N1、H5N2、H5N6型病毒进行特异性检测。并且本发明基于上述特异性引物，进一步优化建立了适宜于快速准确进行AIV检测的等温扩增基因方法体系，能够快速准确的对AIV病毒进行检出，该方法的最低检出病毒量为0.1LD₅₀，灵敏度与传统RT‑PCR一致，且该方法操作简单、快速，适用于临床生产和实验室的快速诊断。

Description

一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物及其应用。

背景技术

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的一种急性传染病，被世界动物卫生组织列为A类疾病，我国更将其列为一类动物疫病，给养禽业造成巨大经济损失。甲型流感病毒根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原的差异，将血凝素(HA)分为16个亚型(H1-H16)，神经氨酸酶(NA)分为9个亚型(N1-N9)，不同亚型的病毒根据上述分类予以命名。

AIV病毒的常用检测方法包括血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)、琼脂扩散试验、逆转录-环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)、以及RT-PCR法等。上述方法中，HI、琼脂扩散试验等方便虽然检测快捷，但该方法的敏感性较低，通常不适宜于微量病毒的检测；ELISA以及荧光抗体法的检测技术较为成熟，但其敏感性仍然低于RT-PCR方法。RT-PCR方法用于检测AIV病毒具有检测结果敏感性高的优点，但是常规RT-PCR检测必须经过变性、退火、延伸至少三个步骤，不仅过程较为繁琐，而且需要特殊的基因扩增仪器，检测便捷性较差。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。英国公司TwistDxInc以此为基础开发的

核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测，这无疑能大大加快基因扩增的速度。并且该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。此外，由于不需要特殊的温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测，利用RPA技术进行AIV病毒不同亚型的特异性检测，也成为代替RT-PCR检测技术的理想方法。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，并进一步公开了一种基于RPA技术的AIV核酸检测方法。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，所述引物包括：特异性扩增位于AIV HA5型基因的第127-671位点之间片段的引物H5，以及特异性扩增位于NA1型基因的第1033-1460位点之间片段的引物N1，和/或特异性扩增位于NA2型基因的第825-1051位点之间片段的引物N2，和/或特异性扩增位于NA6型基因的第873-1197位点之间片段的引物N6。

进一步的，所述的基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，所述引物包括：

上游引物H5-F：5’-ACACATGCYCARGACATACT-3’；

下游引物H5-R：5’-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3’；以及，

上游引物N1-F：5’-TGTGGTCCRRTGTCCYYTAACG-3’；

下游引物N1-R：5’-TACTTGTCAATGGTGAATGGCAACTC-3’；和/或，

上游引物N2-F：5’-AGCCCRYTGTCAGGAAGTGC-3’；

下游引物N2-R：5’-TAGGRTCYCTRCARTTGCTG-3’；和/或，

上游引物N6-F：5’-GGAGCAKCAGRGATGATCAA-3’；

下游引物N6-R：5’-GATTGAGTGTCGRTYTCTG-3’。

本发明还公开了所述的基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物用于特异性检测AIV病毒的用途。

本发明还公开了一种基于RPA技术的AIV核酸检测方法，包括如下步骤：

(1)RNA提取：按照现有技术方法提取待测组织的RNA；

(2)以步骤(1)提取的RNA为模板，利用权利要求1或2所述的特异性引物进行等温基因扩增，获得扩增产物；

(3)将所述扩增产物进行凝胶电泳，依据凝胶电泳结果进行待测组织病毒类型的判断。

所述步骤(2)中，所述等温基因扩增的反应体系包括：

所述步骤(2)中，所述等温基因扩增的反应的扩增条件为：40℃、扩增反应15min后取出，冷却至室温；混匀后，离心，40℃，反应35min。

所述步骤(1)中，所述RNA提取步骤具体包括：

取待测组织用PBS以1∶10研磨成悬液，装入高压灭菌处理过的1.5mLEP管中，于-80℃反复冻融3次，冻融后以9000×g/min离心10min，随后进行倍比稀释至10^-8；分别取300μL于2mL离心管中，加入900μL TRIZOL试剂，剧烈颠倒60-100次，室温静置10min；

加入200μL氯仿，上下颠倒6-10次，室温静置5min，4℃、10000×g/min离心10min，取上清移入1.5mL离心管中；随后加入同体积的异丙醇，轻轻摇匀，-20℃放30min，于4℃、10000×g/min离心10min；倒掉上清，加入1mL75％的乙醇-DEPC水溶液，4℃、10000×g/min离心5min；去掉上清，于4℃、12000×g/min离心5min，用微量移液器吸去管底部的液体，在超净工作台中干燥5min，随后用适量0.1％DEPC水溶解RNA，-20℃冻存。

所述步骤(1)中，所述乙醇为DEPC水溶液配制的乙醇溶液。

所述步骤(3)中，所述对待测组织病毒类型的判断标准为：观察凝胶电泳结果，若出现317bp条带，可判断为AIV阳性；若出现545bp和428bp两条带，可判断为H5N1型病毒；若出现545bp和227bp两条带，可判断为H5N2型病毒；若出现545bp和325bp两条带，可判断为H5N6型病毒；若同时出现以上三条或四条带可作相应判断。

本发明还公开了一种基于RPA技术检测AIV病毒亚型的试剂盒，包括所述的特异性引物。

本发明所述基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，是根据AIV的H5型N1、N2、N6基因序列设计的引物，该引物体系可特异性的对H5N1、H5N2、H5N6型病毒进行特异性检测。并且本发明基于上述特异性引物，进一步优化建立了适宜于快速准确进行AIV检测的等温扩增基因方法体系，能够快速准确的对AIV病毒进行检出，该方法的最低检出病毒量为0.1LD₅₀，灵敏度与传统RT-PCR一致，且该方法操作简单、快速，适用于临床生产和实验室的快速诊断。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为本发明AIV病毒检测的检测电泳结果；

图2是禽流感病毒多重RT-PCR检测电泳结果；其中，M-标准DNA分子量2000；1-H5N1/H5N2/H5N6；2-H5N1；3-H5N2；4-H5N6；5-禽流感H9；6-新城疫；7-禽白血病；8-鸡传染性支气管炎；9-禽脑脊髓炎；10-禽气管、脑和肝脏等组织混合物；

图3是禽流感病毒重组酶聚合酶等温检测灵敏度结果；其中，M-标准DNA分子量2000；1-10³LD₅₀；2-10²LD₅₀；3-10LD₅₀；4-1LD₅₀；5-0.1LD₅₀；6-0.01LD₅₀；

图4是禽流感病毒RT-PCR检测灵敏度结果；其中，M-标准DNA分子量2000；1-10³LD₅₀；2-10²LD₅₀；3-10LD₅₀；4-1LD₅₀；5-0.1LD₅₀；6-0.01LD₅₀。

具体实施方式

本发明下述实施例中，所述RT-PCR反应体系是通过常规商品化试剂盒进行组装，DNA Marker DL-2000、TRIZOL，DEPC，均购自TaKaRa公司(大连)；HiscripIIOne Step RT-PCR Kit购自Vazyme公司；TwistAmp DNA Amplification Kits购自TwistDX公司。

实施例1引物设计

本实施例所述的检测AIV的特异性引物，其对应的特异性扩增片段依次位于：

AIV HA(5型)基因的第127-671位点之间，大小为545bp，其序列结构如SEQ IDNo.1所示；

AIV NA(1型)基因的第1033-1460位点之间，大小为428bp，其序列结构如SEQ IDNo.2所示；

AIV NA(2型)基因的第825-1051位点之间，大小为227bp，其序列结构如SEQ IDNo.3所示；

AIV NA(6型)基因的第873-1197位点之间，大小为325bp，其序列结构如SEQ IDNo.4所示。

SEQ ID No.1：

5’-ACACATGCCCAAGACATACTGGAAAAGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAAATGGAGTGAAGCCTCTGATTTTAAAAGATTGTAGTGTAGCAGGATGGCTCCTCGGAAATCCATTGTGTGACGAATTCATTAATGTGCCAGAATGGTCTTACATAGTAGAGAAGGCCAATCCAGCCAATGACCTCTGTTACCCAGGGAATTTCAACGATTATGAAGAATTGAAACACTTATTGAGCAGGATAAACCATTTTGAGAAAATACAGATCATCCCCAAGAAGTCTTGGTCAAACCATAACGCTTCAGCAGGAGTGAGCGCAGCATGTTCATACCAGGGAAATCTCTCCTTCTTCAGAAATGTGGTGTGGCTTATCAAAAAGAACAATACATACCCAACAATAAAGAAAGACTACAACAATACCAACCGAGAAGATCTCTTGATACTGTGGGGGATCCACCATCCTAATGATGAGGCAGAGCAGAAAAAGCTCTATCAAAATCCAAATACCTATATTTCCATTGGGACTTCAACACTAAACCAGAG-3’；

SEQ ID No.2：

5’-TGTGGTCCGATGTCCCCTAACGGGGCATATGGGGTGAAAGGATTTTCATTTAAATACGGCAATGGTGTTTGGATCGGGAGAACCAAAAGCACTAATTCCAGGAGCGGCTTTGAAATGATTTGGGATCCAAATGGGTGGACTGGAACGGACAGTAGCTTCTCGGTGAAACAAGATATCGTAGCAATAACTGATTGGTCAGGATATAGCGGGAGTTTTGTCCAGCATCCAGAACTGACAGGATTAGATTGCATAAGACCTTGTTTTTGGGTTGAGCTAATCAGAGGGCGGCCCAAAGAGAGCACAATTTGGACTAGTGGGAGCAGCATATCCTTTTGTGGTGTAAATAGTGACACTGTGGGTTGGTCTTGGCCAGACGGTGCTGAGTTGCCATTCACCATTGACAAGTA-3’；

SEQ ID No.3：

5’-AGCCCACTGTCAGGAAGTGCTCAGCATATAGAGGAATGCTCCTGTTATCCCCGATACCCAAATGTCAGATGTGTTTGCAGAGACAACTGGAAGGGCTCTAATAGGCCTGTTATAGATATAAATATGGCAGATTATAGCATTGATTCCAGTTATGTGTGCTCAGGACTTGTTGGAGACACACCAAGGAACGATGATGGCTCTAGCAGCAGCAATTGCA GGGATCCTA-3’；

SEQ ID No.4：

5’-GGAGCAGCAGGGATGATCAAATGTGCATGCAGAGACAATTGGAAGGGGGCAAATAGACCAATAATCACTATAGATCCCGAAATGATGACCCACACAAGCAAATACTTGTGTTCAAAAATCTTAACCGACACAAGTCGTCCTAATGACCCCACCAATGGGAACTGCGATGCGCCAATAACAGGAGGGAGTCCAGACCCAGGGGTAAAAGGGTTTGCATTCCTAGACGGGGAGAATTCATGGCTTGGAAGGACAATTAGCAAAGACTCTAGATCAGGCTACGAAATGTTAAAGGTCCCAAATGCAGAAACCGACACTCAATC-3’。

根据GenBank中已登录的AIV H5和N1/N2/N6基因序列，设计得到如下引物：

上游引物H5-F：5’-ACACATGCYCARGACATACT-3’；

下游引物H5-R：5’-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3’；

上游引物N1-F：5’-TGTGGTCCRRTGTCCYYTAACG-3’；

下游引物N1-R：5’-TACTTGTCAATGGTGAATGGCAACTC-3’；

上游引物N2-F：5’-AGCCCRYTGTCAGGAAGTGC-3’；

下游引物N2-R：5’-TAGGRTCYCTRCARTTGCTG-3’；

上游引物N6-F：5’-GGAGCAKCAGRGATGATCAA-3’；

下游引物N6-R：5’-GATTGAGTGTCGRTYTCTG-3’。

实施例2核酸提取

取AIV病毒待测组织，用PBS以1∶10的比例研磨成悬液，装入高压灭菌处理过的1.5mLEP管中，于-80℃反复冻融3次，且冻融后以9000×g/min离心10min，随后进行倍比稀释至10^-8浓度。

随后分别取300μL稀释液于2mL离心管中，加入900μL TRIZOL试剂，剧烈颠倒60-100次后，于室温静置10min；随后加入200μL氯仿，上下颠倒60-100次，并室温静置5min，随后4℃、10000×g/min离心10min，并取上清移入1.5mL离心管中(如果浑浊再加入200μL氯仿，摇匀，放置5min，再次离心取上清)。

离心后加同体积的异丙醇，轻轻摇匀，并于-20℃放30min，4℃、10000×g/min，离心10min，倒掉上清，并加入1mL75％的乙醇(DEPC水配制)，4℃、10000×g/min，离心5min。去掉上清后，于4℃、12000×g/min，离心5min，随后用微量移液器吸去管底部的液体，在超净工作台中干燥5min(不宜太干，否则RNA很难溶解)，并用适量0.1％DEPC水溶解RNA，-20℃冻存。

实施例3重组酶聚合酶等温扩增

按照TwistAmp DNA Amplification Kits试剂盒操作说明进行，以实施例2中提取的RNA为模板进行重组酶聚合酶等温扩增。

PCR反应体系包括：

上游引物，20μmol/μL，1.2μL；

下游引物，20μmol/μL，1.2μL；

Rehydration Buffer，29.5μL；

Template，10μL；

ddH₂O，5.6μL。

漩涡混匀，离心，并加入2.5μL 280mM MgAc，再混匀；放入PCR仪，于40℃、反应15min后取出，并冷却至室温，再次混匀后，离心，并放入PCR仪，于40℃，反应35min。反应结束后，于2％琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，观察结果如附图1所示。

如图1所示的结果，检测样品中若出现545bp和428bp两条带，可判断为H5N1；若出现545bp和227bp两条带，可判断为H5N2；若出现545bp和325bp两条带，可判断为H5N6；若同时出现以上三条或四条带可作相应判断。

实施例4特异性验证

分别用禽流感H5N1/H5N2/H5N6病毒、禽流感H9、新城疫、禽白血病、鸡传染性支气管炎、禽脑脊髓炎、健康禽气管、脑和肝脏等组织混合物样品，按照实施例1-3中步骤分别提取RNA作为模板进行RT-PCR扩增，并通过凝胶电泳检测，实验结果如图2所示。图中结果显示，只有禽流感H5N1/H5N2/H5N6病毒为阳性，其他病毒检测均为阴性，说明本发明所述特异性引物和检测体系的特异性良好。

实施例5灵敏度验证

选择标准AIV毒株气管、脑和肝脏等组织混合物样品以10倍系列稀释，用上述实施例1-3中建立的重组酶聚合酶等温扩增方法进行检测，并与按照RT-PCR方法的检测结果进行对照，结果分别如图3和图4所示。可见，本发明所述检测体系的灵敏度与现有RT-PCR方法均为0.1LD₅₀，灵敏性较好。实施例6临床样品检测

收集禽呼吸道分泌物或排泄物，加入0.8mL PBS(0.01mol/L pH7.2)，充分震荡，按照实施例1-3的方法取上清提取核酸，用建立的方法进行检测，同时与传统的RT-PCR方法进行比较。根据所得结果对比可知，两种方法的符合率为100％，说明本发明所述检测体系结果准确性较高。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110>

<120> 一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物及其应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 545

<212> DNA

<213> AIV HA5

<400> 1

ACACATGCCC AAGACATACT GGAAAAGACA CACAACGGGA AGCTCTGCGA TCTAAATGGA 60

GTGAAGCCTC TGATTTTAAA AGATTGTAGT GTAGCAGGAT GGCTCCTCGG AAATCCATTG 120

TGTGACGAAT TCATTAATGT GCCAGAATGG TCTTACATAG TAGAGAAGGC CAATCCAGCC 180

AATGACCTCT GTTACCCAGG GAATTTCAAC GATTATGAAG AATTGAAACA CTTATTGAGC 240

AGGATAAACC ATTTTGAGAA AATACAGATC ATCCCCAAGA AGTCTTGGTC AAACCATAAC 300

GCTTCAGCAG GAGTGAGCGC AGCATGTTCA TACCAGGGAA ATCTCTCCTT CTTCAGAAAT 360

GTGGTGTGGC TTATCAAAAA GAACAATACA TACCCAACAA TAAAGAAAGA CTACAACAAT 420

ACCAACCGAG AAGATCTCTT GATACTGTGG GGGATCCACC ATCCTAATGA TGAGGCAGAG 480

CAGAAAAAGC TCTATCAAAA TCCAAATACC TATATTTCCA TTGGGACTTC AACACTAAAC 540

CAGAG 545

<210> 2

<211> 407

<212> DNA

<213> AIV NA1

<400> 2

TGTGGTCCGA TGTCCCCTAA CGGGGCATAT GGGGTGAAAG GATTTTCATT TAAATACGGC 60

AATGGTGTTT GGATCGGGAG AACCAAAAGC ACTAATTCCA GGAGCGGCTT TGAAATGATT 120

TGGGATCCAA ATGGGTGGAC TGGAACGGAC AGTAGCTTCT CGGTGAAACA AGATATCGTA 180

GCAATAACTG ATTGGTCAGG ATATAGCGGG AGTTTTGTCC AGCATCCAGA ACTGACAGGA 240

TTAGATTGCA TAAGACCTTG TTTTTGGGTT GAGCTAATCA GAGGGCGGCC CAAAGAGAGC 300

ACAATTTGGA CTAGTGGGAG CAGCATATCC TTTTGTGGTG TAAATAGTGA CACTGTGGGT 360

TGGTCTTGGC CAGACGGTGC TGAGTTGCCA TTCACCATTG ACAAGTA 407

<210> 3

<211> 226

<212> DNA

<213> AIV NA2

<400> 3

AGCCCACTGT CAGGAAGTGC TCAGCATATA GAGGAATGCT CCTGTTATCC CCGATACCCA 60

AATGTCAGAT GTGTTTGCAG AGACAACTGG AAGGGCTCTA ATAGGCCTGT TATAGATATA 120

AATATGGCAG ATTATAGCAT TGATTCCAGT TATGTGTGCT CAGGACTTGT TGGAGACACA 180

CCAAGGAACG ATGATGGCTC TAGCAGCAGC AATTGCAGGG ATCCTA 226

<210> 4

<211> 320

<212> DNA

<213> AIV NA6

<400> 4

GGAGCAGCAG GGATGATCAA ATGTGCATGC AGAGACAATT GGAAGGGGGC AAATAGACCA 60

ATAATCACTA TAGATCCCGA AATGATGACC CACACAAGCA AATACTTGTG TTCAAAAATC 120

TTAACCGACA CAAGTCGTCC TAATGACCCC ACCAATGGGA ACTGCGATGC GCCAATAACA 180

GGAGGGAGTC CAGACCCAGG GGTAAAAGGG TTTGCATTCC TAGACGGGGA GAATTCATGG 240

CTTGGAAGGA CAATTAGCAA AGACTCTAGA TCAGGCTACG AAATGTTAAA GGTCCCAAAT 300

GCAGAAACCG ACACTCAATC 320

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物H5-F

<400> 5

ACACATGCYC ARGACATACT 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物H5-R

<400> 6

CTYTGRTTYA GTGTTGATGT 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物N1-F

<400> 7

TGTGGTCCRR TGTCCYYTAA CG 22

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物N1-R

<400> 8

TACTTGTCAA TGGTGAATGG CAACTC 26

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物N2-F

<400> 9

AGCCCRYTGT CAGGAAGTGC 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物N2-R

<400> 10

TAGGRTCYCT RCARTTGCTG 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物N6-F

<400> 11

GGAGCAKCAG RGATGATCAA 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物N6-R

<400> 12

GATTGAGTGT CGRTYTCTG 19

Claims

1.一种基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物，其特征在于，所述引物包括：

特异性扩增AIV HA5型基因的引物H5，包括：

上游引物H5-F：5’-ACACATGCYCARGACATACT-3’；

下游引物H5-R：5’-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3’；

以及，

特异性扩增NA1型基因的引物N1，包括：

上游引物N1-F：5’-TGTGGTCCRRTGTCCYYTAACG-3’；

下游引物N1-R：5’-TACTTGTCAATGGTGAATGGCAACTC-3’；

和，

特异性扩增NA2型基因的引物N2，包括：

上游引物N2-F：5’-AGCCCRYTGTCAGGAAGTGC-3’；

下游引物N2-R：5’-TAGGRTCYCTRCARTTGCTG-3’；

和，

特异性扩增NA6型基因的引物N6，包括：

上游引物N6-F：5’-GGAGCAKCAGRGATGATCAA-3’；

下游引物N6-R：5’-GATTGAGTGTCGRTYTCTG-3’。

2.权利要求1所述的基于RPA技术检测AIV病毒的特异性引物用于制备特异性检测AIV病毒亚型的试剂盒的用途。

3.一种基于RPA技术检测AIV病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的特异性引物。