CN106367413B

CN106367413B - 一种核酸的扩增方法及应用

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Publication number: CN106367413B
Application number: CN201610804835.1A
Authority: CN
Inventors: 张岩; 盖伟; 邢婉丽; 冀元凯; 程京
Original assignee: CapitalBio Corp
Current assignee: CapitalBio Corp
Priority date: 2016-09-05
Filing date: 2016-09-05
Publication date: 2019-08-06
Anticipated expiration: 2036-09-05
Also published as: CN106367413A

Abstract

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种核酸的扩增方法及应用。本发明提供的方法先对待测物进行RPA预扩增，然后再进行LAMP扩增，从而能够在恒温条件下对待测物放大后进行多重检测，检测的灵敏度较高。实验表明，采用本发明提供的方法进行扩增，能够同时对10个目的基因进行检测，最低检测限为20copies/μL。

Description

一种核酸的扩增方法及应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种核酸的扩增方法及应用。

背景技术

重组酶聚合酶扩增法(RPA)是在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术；该技术利用重组酶入侵、单链结合蛋白绑定DNA单链和DNA聚合酶扩增代替了传统PCR的热循环解链过程，实现在恒温下的核酸快速扩增。RPA技术只需要一对简单的引物就能实现等温扩增，但是重组酶扩增的产物的量大多不高，很难被检测到。且目前尚未有报道称能够以RPA技术进行多重扩增。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年日本荣研化学株式会社开发的替代PCR核酸扩增方法。LAMP作为一种分子生物学检测技术，具有高特异性、高敏感性、简单、便捷及成本低的特点，已广泛用于临床疾病的诊断、流行性细菌或病毒的定性定量检测、动物胚胎性别鉴定及基因芯片开发等领域。该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，LAMP反应在恒温水浴箱便可完成。每个扩增对象需要6条引物才能实现扩增，体系比较复杂，因此无法在一个体系中实现对多个扩增对象的同时扩增或多重的环介导等温扩增。并且，在实际研发实验过程中发现在样本含量极低的领域，LAMP技术的灵敏度无法达到检测要求，

上述两种方法都不能够同时对多个检测对象进行检测，而在目前的临床检测中，对高通量检测的要求越来越高，如果能够在恒温条件下实现对待测样品的多重检测，将大幅提高临床的检测效率，且降低对检测条件的要求。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种核酸的扩增方法及应用，本发明提供的方法能够实现恒温条件下对待测样品进行多重扩增，提高灵敏度。

本发明提供的核酸的扩增方法为，待测样品经RPA预扩增后，进行LAMP扩增；其中RPA预扩增为多重扩增或单重扩增，LAMP扩增为单重扩增。

RPA预扩增使用的扩增引物为后续LAMP对应的引物。

本发明通过RPA预扩增对待测样品中的DNA进行富集。本发明所述的单重扩增是指对某一特定基因片段进行扩增的过程。多重扩增则是至对多个目的基因在同一反应体系中进行扩增的过程。RPA预扩增可采用单重扩增，也可采用多重扩增。为了能够实现对目的基因的高通量检测，RPA预扩增优选采用多重扩增。样品经RPA预扩增后，获得预扩增产物，将预扩增体系进行分装，然后在分装后的体系中，分别针对不同的目的基因进行LAMP扩增。并且，RPA扩增后产物的检测往往只能使用电泳法，这就为快速简便的检测带来了操作上的困难，本发明在RPA之后进行LAMP扩增，是检测结果能够通过颜色反应进行判别，从而能够实现检测结果判别的可视化。

本发明采用的RPA预扩增的体系中包括：RPA预扩增引物、待测样品、SSB蛋白、UvsX蛋白、UvsY蛋白、DNA聚合酶和反应缓冲液。

本发明中，RPA预扩增的引物为LAMP扩增引物中的F3、B3。

RPA预扩增的目的是对目的基因的含量进行富集，其引物可以单独设计也可使用LAMP扩增引物中的外引物对其进行扩增。如单独设计，其扩增所得片段应包括以F3、B3为引物扩增得到的片段。为避免引入新的引物对后续LAMP扩增产生未知干扰，本发明以LAMP扩增引物中的F3、B3作为RPA预扩增的引物。并且，多重RPA使用的引物与后续LAMP部分引物一致，也解决了RPA本身要求的引物过长(30bp～35bp)不方便设计、容易形成自身二级结构等的缺陷。

我们引入RPA技术在LAMP检测前进行多重指标一管内的预扩增，并且多重引物使用的是LAMP引物对中的F3、B3引物，有效的避免引入新的引物干扰后续LAMP反应的风险。RPA技术要求引物的长度在30bp～35bp，实际我们所使用的F3、B3引物只有20bp左右，降低了过长引物容易产生二级结构等干扰扩增的风险。

本发明提供的方法不仅适用于样本中普通待测物的检测，更加适合待测物含量较低的样品。例如，菌血症患者血液内细菌的含量较低、或者一些需要检测脑脊液的患者，其脑脊液中菌类的含量也极低。这种情况下，普通的LAMP技术或RPA技术无法完成快速准确的检测。

临床中常需进行检测的标本为脑脊液或血液。本发明所述的待测样品为脑脊液的cDNA或血液的cDNA。

由于脑脊液中基因的表达量都不高，还有一些特殊的基因在血液中的表达量也非常低，普通的LAMP技术的灵敏度不足，很难通过直接进行LAMP的方法检测到这些目的基因。对待测样品进行RPA预扩增后，目的基因的量得到了富集，从而使得通过LAMP技术对其进行检测的技术得以实施。

所述SSB蛋白、UvsX蛋白、UvsY蛋白、DNA聚合酶的质量比为800:60:50：50。

所述SSB蛋白在反应体系中的浓度为800ng/μL；

所述UvsX蛋白在反应体系中的浓度为60ng/μL；

所述UvsY蛋白在反应体系中的浓度为50ng/μL；

所述DNA聚合酶在反应体系中的浓度为50ng/μL。

所述反应缓冲液中包括：Tris、醋酸钾、醋酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶、磷酸肌酸和RecQ蛋白。

反应缓冲液中各组分的浓度为：

一些实施例中，各组分的浓度为：

Tris	50mM
		醋酸钾	50mM
醋酸镁	10mM
		二硫苏糖醇	6.25mM
聚乙二醇	7.5％(w/v)
		ATP	7.5mM
dNTPs	1.5mM
		肌酸激酶	3.5μg/U
磷酸肌酸	37.5mM
		RecQ蛋白	10ng/μL

作为优选，RPA反应体系的体系为9.5μL；其中：

RPA反应以镁离子启动反应。

作为优选，镁离子来自醋酸镁。

醋酸镁的浓度为280mM，加入反应体系的体积为0.5μL。

本发明中，RPA预扩增的温度为37℃～42℃，时间为15min～40min。

一些实施例中，RPA预扩增的温度为37℃，15min。

实验表明，37℃，15min的扩增所得产物的浓度便足以进行LAMP扩增。

以本发明提供的RPA反应体系和RPA反应条件进行扩增，能够获得足够量的预扩增产物，所述预扩增产物可用于LAMP扩增。优选的，本发明所述的RPA预扩增为多重扩增，所述多重扩增为2～10重扩增。经实验表明，RPA预扩增最多能够实现10重的稳定扩增，即在同一体系中，实现对10个目的基因的同时扩增，扩增结果特异性良好。

本发明所述的LAMP扩增的体系中包括：RPA预扩增的产物、LAMP扩增引物、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、甜菜碱、染料、Mg²⁺和BSA。

所述Mg²⁺的来源为硫酸镁。

所述反应缓冲液为ThermoPol Buffer；优选为10×ThermoPol Buffer。

所述染料为EvaGreen、SYBR green I或钙黄绿素。

本发明中采用的染料为EvaGreen，优选为20×的EvaGreen。

LAMP扩增体系中各组分的加入量为：

RPA预扩增的产物	5μL
		10×ThermoPol Buffer	5.5μL
甜菜碱	8.7μL
		BSA	0.5μL
MgSO<sub>4</sub>	0.5μL
		20×EvaGreen	1.6μL
Bst DNA聚合酶	2.2μL
		LAMP引物组	1.09μL

LAMP扩增体系中，甜菜碱的浓度为5mol/L；BSA的浓度为50mg/mL；MgSO₄的浓度为400mmo/L；Bst DNA聚合酶的浓度为8U/μL。

LAMP扩增的程序为：37℃～42℃，3min～5min；然后63℃～67℃，40min～60min。

本发明实施例中，LAMP扩增的程序为：反应条件37℃3min，65℃50min。

LAMP引物组针对靶基因的特异保守区域设计，由6条引物组成，包括内引物(FIP/BIP)、外引物(F3/B3)和环引物(LF/LB)。其中，FIP/BIP分别为上下游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。F3/B3分别为上下游外部引物，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。LF/LB分别为上下游环引物，与扩增过程中形成的茎环结构结合的区域在F2和F1之间。这样的设计可以保证引物具有更高的特异性，从而避免在检测过程中出现假阳性。

本发明提供的方法，对待测样品进行RPA预扩增后再进行LAMP扩增，解决了RPA扩增产物无法进行检测的问题，也解决了LAMP扩增无法进行多重扩增，且扩增灵敏度不高的问题。以本发明提供的方法能够在恒温条件下实现对待测样品的多重、快速、可视化检测。降低了对检测中对实验仪器的要求。

本发明提供了一种核酸扩增试剂盒，包括RPA扩增试剂和LAMP扩增试剂。

其中，RPA扩增试剂包括：

SSB蛋白、UvsX蛋白、UvsY蛋白、DNA聚合酶和反应缓冲液；

反应缓冲液中各组分的浓度为：

一些实施例中，各组分的浓度为：

RPA反应以镁离子启动反应，故而RPA扩增试剂中还包括含有镁离子溶液。

作为优选，镁离子来自醋酸镁；醋酸镁的浓度为280mM。

其中，LAMP扩增试剂包括：反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、甜菜碱、染料、Mg²⁺和BSA；

所述反应缓冲液为ThermoPol Buffer；

所述染料为EvaGreen、SYBR green I或钙黄绿素。

所述Mg²⁺的来源为硫酸镁。

所述反应缓冲液为ThermoPol Buffer；优选为10×ThermoPol Buffer。

所述染料为EvaGreen、SYBR green I或钙黄绿素。

本发明中采用的染料为EvaGreen，优选为20×的EvaGreen。

本发明提供的试剂盒中包含采用本发明提供的方法对目的基因进行扩增所需的试剂。

本发明提供的核酸扩增试剂盒在低浓度核酸成分样本检测中的应用。

所述低浓度核酸成分样本为血液或脑脊液。

菌血症是指外界的细菌经由体表的入口或是感染的入口进入血液系统后，在人体血液内繁殖并随血流在全身播散血液中出现微生物。菌血症多是细菌由局部病灶入血，主要发生在炎症的早期阶段。严重的菌血症多为多种细菌感染所致，且治疗过程中如不能确定是哪些细菌的感染导致的菌血症，用药通常无法起到良好的作用。且耐药性的产生通常也会导致用药效果不佳。如果能够在用药前，就检测到究竟是何种细菌导致的感染，而又已经对哪些药物产生了耐药性，则可大幅提高用药的效果，减少患者的痛苦。但由于菌血症患者血液中细菌的含量较低，微生物培养所需的周期十分长；耐药基因更是十分不易检测，目前尚没有很好的方法能够实现分子层面的检测。

基于本发明提供的方法，本发明提供的试剂盒能够用于菌血症适用药物的筛选。

具体的，菌血症适用药物的筛选方法，包括：

步骤1：以待测样品的cDNA为模板，对待测样品中的菌类特异性基因和/或人体耐药基因进行RPA预扩增，获得预扩增产物；

步骤2：以预扩增产物为模板，对其中的菌类特异性基因和/或人体耐药基因进行进行LAMP扩增；

步骤3：根据扩增结果，判断适用药物；

所述RPA预扩增为多重扩增，所述LAMP扩增为单重扩增。

扩增结果的检测采用恒温扩增微流控芯片核酸分析仪。

本发明的一个实施例中，对菌血症常见细菌和耐药基因同时进行检测，细菌包括：sau(金色葡萄球菌)、recA(鲍曼不动杆菌)、pae(铜绿假单胞菌)、mtb(结核分枝杆菌)、kpn(肺炎克雷伯菌)、ef0027(粪肠球菌)；耐药基因包括：mecA、Imp、VanA、Ompk35。

此实施例中，以LAMP扩增的F3、B3引物对待扩增的菌类特异性基因、人体耐药基因进行RPA预扩增；

将所得扩增产物分装后，分别针对各待扩增的菌类特异性基因、人体耐药基因进行LAMP扩增；

根据扩增后显色的结果，判断存在的菌类和耐受的药物，据此判断使用的药物。

此实施例中，RPA预扩增的模板为患者血液cDNA，扩增各基因所采用的LAMP引物如表3：

表3，扩增引物

RPA预扩增的反应温度为37℃，时间为15min。

RPA预扩增体系中，各引物的浓度如表4：

表4RPA预扩增引物浓度(_μM/μL)

	sau	recA	pae	mtb	kpn	ef0027	mecA	Imp	VanA	Ompk35
											F3	2.5	2.5	2	1.5	1	2.5	1	1	2.5	1
B3	2.5	2.5	2	1.5	1	2.5	1	1	2.5	1

LAMP扩增的反应温度为37℃，3min；然后65℃，50min。

脑脊液中也可能存在多种细菌，从而对患者的健康状况产生影响。基于本发明提供的方法，本发明提供的试剂盒能够用于鉴别脑脊液中存在的细菌，并检测药物耐受情况。

具体的，脑脊液中细菌及耐药基因的检测方法，包括：

步骤3：根据扩增结果，判断适用药物；

所述RPA预扩增为多重扩增，所述LAMP扩增为单重扩增。

扩增结果的检测采用恒温扩增微流控芯片核酸分析仪。

本发明的一个实施例中，对脑脊液中可能存在的细菌和耐药基因同时进行检测，细菌包括：Oxa23(鲍氏不动杆菌)、VanA(耐万古霉素)、kpn(肺炎克雷伯杆菌)、mtb(结核分枝杆菌)；耐药基因包括：Imp(碳青霉烯酶耐药基因)、ef0027(动物源粪肠球菌耐药基因)。

此实施例中，RPA预扩增的模板为患者脑脊液cDNA，扩增各基因所采用的LAMP引物如表1：

表1，扩增引物

RPA预扩增的反应温度为37℃，时间为15min。

RPA预扩增体系中，各引物的浓度如表2：

表2RPA预扩增引物浓度(_μM/μL)

	Oxa-23	Imp	VanA	ef0027	kpn	mtb
							F3	1	1	2.5	1	1	1
B3	1	1	2.5	1	1	1

LAMP扩增的反应温度为37℃，3min；然后65℃，50min。

本发明提供了一种核酸的扩增方法及应用，本发明提供的方法先对待测物进行RPA预扩增，然后在进行LAMP扩增，从而能够在恒温条件下对待测物进行多重检测，检测的灵敏度较高。实验表明，采用本发明提供的方法进行扩增，能够同时对10个目的基因进行检测，最低检测限为20copies/μL。本发明提供的方法能够用于筛选菌血症患者的适用药物。

具体实施方式

本发明提供了一种核酸的扩增方法及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1准确性

1、标准品溶液的配制

分别制备以下靶标耐药基因的质粒，菌种使用真实菌株提取的核酸。

sau(金色葡萄球菌)、recA(鲍曼不动杆菌)、pae(铜绿假单胞菌)、mtb(结核分枝杆菌)、kpn(肺炎克雷伯菌)、ef0027(粪肠球菌)；mecA、Imp、VanA、Ompk35。

将上述基因片段混合，并作出标记，制得标准品溶液10份，分别为：

A：含有sau的基因片段；

B：含有sau、recAD基因片段

C:含有sau、recA、pae的基因片段。

D:含有sau、recA、pae、mtb的基因片段。

E:含有sau、recA、pae、mtb、kpn的基因片段。

F:含有sau、recA、pae、mtb、kpn、ef0027的基因片段。

G:含有sau、recA、pae、mtb、kpn、ef0027、mecA的基因片段。

H:含有sau、recA、pae、mtb、kpn、ef0027、mecA、Imp的基因片段。

I:含有sau、recA、pae、mtb、kpn、ef0027、mecA、Imp、VanA的基因片段。

J：含有sau、recA、pae、mtb、kpn、ef0027、mecA、Imp、VanA、Ompk35的基因片段。

2、引物设计：

分别针对上述10个基因设计LAMP引物，引物如表5所示。

表5，扩增引物

3、扩增

分别以标准品A～G为待测样品，进行扩增RPA预扩增，然后进行LAMP扩增。

RPA预扩增的体系为：

ddH<sub>2</sub>O	1.9μL
		上游引物	0.8μL
下游引物	0.8μL
		Rehydration buffer	5μL
模板	1μL
		醋酸镁	0.5μL
total	9.5μL

配制好上述混合液后，加入到含有冻干粉的管内，震荡混匀。

RPA预扩增体系中，各引物的浓度如表6：

表6RPA预扩增引物浓度(_μM/μL)

LAMP扩增的体系为：

10×ThermoPol Buffer	/	5.5μL
			甜菜碱	5M	8.7μL
BSA	50mg/mL	0.5μL
			MgSO<sub>4</sub>	400mM	0.5μL
20×EvaGreen	/	1.6μL
			Bst DNA聚合酶	8U/μL	2.2μL
预扩增产物	/	5μL
			LAMP引物组	/	1.09μL

1、分别以10种标准品为待测目标，配制上述RPA体系，加入到冻干试剂反应管中，混匀；

2、各体系分别加入0.5μL的醋酸镁MgAc(280mM)至管盖中，颠倒混匀，瞬时离心；

3、37℃孵育15min；

4、预扩增产物分装并标记，5μL一份，每种标准品的扩增产物各10份。

5、配制Lamp体系50μL，每种标准品的扩曾产物皆分别采用10种目标基因进行检测；配制好的所得LAMP体系进入微流控碟式芯片；

6、Lamp扩增：37℃3min，65℃50min。

实验重复三次，统计扩增结果，如表7，其中+表示阳性；-表示阴性。

表7扩增结果

标准品

sau

recA

pae

mtb

kpn

ef0027

mecA

Imp

VanA

Ompk35

A

+

—

B

+

—

C

+

—

D

+

—

E

+

—

F

+

—

G

+

—

H

+

—

I

+

—

J

+

表7所示，扩增结果与实际情况完全相符，准确性可达100％，其中未见假阳性现象产生。

实施例2灵敏性

分别以实施例1配制的标准品A和J检测本发明提供方法的灵敏性。引物设计和扩增方法如实施例1。具体为：

将标准品A以Qubit荧光剂进行浓度定量，然后进行梯度稀释，结果显示，本发明提供方法对标准品A的最低检测限为20copies/μL。

调整标准品J中各模板基因的浓度，使其终浓度皆为20copies/μL；再次进行扩增，各基因皆能够被准确的检测出。

实施例3

取菌血症患者的血液，现有技术鉴定为阳性感染的菌种为：肺炎克雷伯菌；患者药敏实验结果为耐碳青霉烯类药物。提取cDNA作为扩增模板。

以实施例1中设计的引物和扩增方法对其进行扩增。检测的目的基因包括6种菌类特异性基因和4种耐药基因。

首先以F3、B3引物对cDNA进行RPA预扩增，然后将预扩增产物分装，分别以表5引物进行LAMP扩增，以恒温扩增微流控芯片核酸分析仪检测扩增信号，观测扩增曲线。

扩增结果显示，其中阳性感染的菌种为肺炎克雷伯菌；患者抗性基因为Imp。Imp基因检出，对应的耐药是碳青霉烯类药物，此处检测结果与预期一致。

实施例4

取另一例患者的脑脊液样本，提取cDNA作为扩增模板。现有技术鉴定为阳性感染的菌种为：粪肠球菌；耐药性检测未检出耐药。

以实施例1中扩增方法对其进行扩增，检测的目的基因包括4种菌类特异性基因和2种耐药基因。

扩增引物如表8所示，引物浓度如表9所示：

表8，扩增引物

表9预扩增引物浓度(_μM/μL)

	Oxa-23	Imp	VanA	ef0027	kpn	mtb
							F3	1	1	2.5	1	1	1
B3	1	1	2.5	1	1	1

首先以F3、B3引物对cDNA进行RPA预扩增，然后将预扩增产物分装，分别以表8引物进行LAMP扩增，以恒温扩增微流控芯片核酸分析仪检测扩增信号，观测扩增曲线。

扩增结果显示，其中阳性感染的菌种为：粪肠球菌；患者抗性基因未检出，与预期完全一致。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种非诊断目的的核酸的扩增方法，其特征在于，待测样品经RPA预扩增后，进行LAMP扩增；

所述RPA预扩增为单重扩增或多重扩增，所述LAMP扩增为单重扩增；

所述RPA预扩增的引物为LAMP扩增引物中的F3、B3；

所述核酸为菌血症病原细菌标志基因和人体耐药基因。

2.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述RPA预扩增的体系中包括：RPA预扩增引物、待测样品、SSB蛋白、UvsX蛋白、UvsY蛋白、DNA聚合酶和反应缓冲液。

3.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述RPA预扩增的温度为37℃～42℃，时间为15min～40min。

4.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述LAMP扩增的体系中包括：所述RPA预扩增的产物、LAMP扩增引物、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、甜菜碱、染料、Mg²⁺和BSA。

5.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述LAMP扩增的程序为：37℃～42℃，3min～5min；然后63℃～67℃，40min～60min。