CN110129316A - 一种用于检测眼内液中4种革兰氏阴性细菌的lamp引物组合及应用 - Google Patents

一种用于检测眼内液中4种革兰氏阴性细菌的lamp引物组合及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测眼内液中4种革兰氏阴性细菌的LAMP引物组合及应用。本发明首先提供了一种引物组合，由序列1至序列24所示的24种DNA分子组成。所述引物组合可应用于检测待测菌是否为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌或鲍曼不动杆菌，可应用于检测待测样本中是否含有大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌和/或肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌。本发明提供的引物组合检测眼内液中4种革兰氏阴性细菌，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。

Description

一种用于检测眼内液中4种革兰氏阴性细菌的LAMP引物组合 及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测眼内液中4种革兰氏阴性细菌的LAMP引物组合及应用。
背景技术
细菌是外源性眼内炎的主要致病菌，大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是引起外源性眼内炎的主要4种革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌，直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌。铜绿假单胞菌原称绿脓杆菌，是一种常见的条件致病菌，是眼科感染的主要病原菌之一。肺炎克雷伯菌是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌(俗称肺炎杆菌)，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95％以上，是临床分离及医院感染的重要致病菌之一。鲍曼不动杆菌为非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，属于条件致病菌，该菌是医院感染的重要病原菌，国内资料表明，鲍曼不动杆菌约占临床分离的不动杆菌的70％以上。
目前临床针对革兰氏阴性细菌的检测方法主要是分离培养、涂片镜检和血清学检测。这些检测方法繁琐，检测时间长，灵敏度低，容易发生漏检和错检，无法满足快速检测的要求。近几年发展起来的分子检测技术，特别是PCR技术，在微生物快速鉴定和检测方面的应用，为细菌的快速检测开辟了新的途径。但是，PCR存在检测时间长、易污染、假阳性率高的缺点，使其应用受到限制。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术，其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测细菌。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测眼内液中常见的革兰氏阴性细菌。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种引物组合，可为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)：
(a1)由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ和引物组Ⅳ组成；
(a2)所述引物组Ⅰ；
(a3)由“所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ和所述引物组Ⅳ中的任意一个、任意两个或三个”和所述引物组Ⅰ组成；
(a4)由所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ和所述引物组Ⅳ中的任意两个或任意三个组成；
(a5)所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ或所述引物组Ⅳ。
所述引物组Ⅰ可由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；
所述引物Ⅰ-F3可为如下(b1)或(b2)；
(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-B3可为如下(b3)或(b4)；
(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-FIP可为如下(b5)或(b6)；
(b5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(b6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-BIP可为如下(b7)或(b8)；
(b7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(b8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-LF可为如下(b9)或(b10)；
(b9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(b10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-LB可为如下(b11)或(b12)；
(b11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(b12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。
所述引物组Ⅱ可由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB组成；
所述引物Ⅱ-F3可为如下(c1)或(c2)；
(c1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(c2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-B3可为如下(c3)或(c4)；
(c3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(c4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-FIP可为如下(c5)或(c6)；
(c5)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(c6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-BIP可为如下(c7)或(c8)；
(c7)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(c8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-LF可为如下(c9)或(c 10)；
(c9)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(c10)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-LB可为如下(c11)或(c12)；
(c11)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(c12)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子。
所述引物组Ⅲ可由引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB组成；
所述引物Ⅲ-F3可为如下(d1)或(d2)；
(d1)序列表的序列13所示的单链DNA分子；
(d2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-B3可为如下(d3)或(d4)；
(d3)序列表的序列14所示的单链DNA分子；
(d4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-FIP可为如下(d5)或(d6)；
(d5)序列表的序列15所示的单链DNA分子；
(d6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-BIP可为如下(d7)或(d8)；
(d7)序列表的序列16所示的单链DNA分子；
(d8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-LF可为如下(d9)或(d10)；
(d9)序列表的序列17所示的单链DNA分子；
(d10)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-LB可为如下(d11)或(d12)；
(d11)序列表的序列18所示的单链DNA分子；
(d12)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子。
所述引物组Ⅳ可由引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB组成；
所述引物Ⅳ-F3可为如下(e1)或(e2)；
(e1)序列表的序列19所示的单链DNA分子；
(e2)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-B3可为如下(e3)或(e4)；
(e3)序列表的序列20所示的单链DNA分子；
(e4)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-FIP可为如下(e5)或(e6)；
(e5)序列表的序列21所示的单链DNA分子；
(e6)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-BIP可为如下(e7)或(e8)；
(e7)序列表的序列22所示的单链DNA分子；
(e8)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-LF可为如下(e9)或(e10)；
(e9)序列表的序列23所示的单链DNA分子；
(e10)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-LB可为如下(e11)或(e12)；
(e11)序列表的序列24所示的单链DNA分子；
(e12)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的DNA分子。
所述引物组Ⅰ中，引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物组Ⅱ中，引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物组Ⅲ中，引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
所述引物组Ⅳ中，引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。
本发明还保护所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途可为如下(h1)或(h2)：
(h1)鉴定大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌和/或肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌；
(h2)用于检测待测样本中是否含有大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌和/或肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌。
本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途可为如下(h1)或(h2)：
(h1)鉴定大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌和/或肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌；
(h2)用于检测待测样本中是否含有大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌和/或肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种检测待测菌是否为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌或鲍曼不动杆菌的方法，可包括如下步骤：
(1)提取待测菌的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为大肠杆菌；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为铜绿假单胞菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为肺炎克雷伯氏菌；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为鲍曼不动杆菌。
本发明还保护一种检测待测样本中是否含有大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌和/或肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的方法，可包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别采用所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有大肠杆菌；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有铜绿假单胞菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有肺炎克雷伯氏菌；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有鲍曼不动杆菌。
以上任一所述方法中，环介导等温扩增反应体系(10μL)可为：1μL10×ThermoPolBuffer、1.6μL浓度为5M的甜菜碱、0.1μL浓度为50mg/mL的BSA水溶液、0.4μL浓度为100mM的MgSO4水溶液、0.3μL 20×EvaGreen、0.15μL浓度为100mM的dNTPs(每种)、0.4μL浓度为8U/mL的Bst DNA聚合酶大片段、模板(约50pg-50ng)、1μL引物混合物，补水至10μL。引物混合物即引物组中的各条引物组成的混合物。10×ThermoPol Buffer具体可为Thermo公司的产品。20×EvaGreen具体可为合肥博美生物公司的产品。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅰ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅱ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅲ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，采用所述引物组Ⅳ时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。
以上任一所述方法中，环介导等温扩增反应条件为：65℃恒温50min。
本发明还保护所述引物组合在检测待测菌是否为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌或鲍曼不动杆菌中的应用。
本发明还保护所述引物组合在检测待测样本中是否含有大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌和/或肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌中的应用。
上述任一所述待测样本可为眼部抽吸物样本(即眼内液)。
上述任一所述大肠杆菌和铜绿假单胞菌具体可记载与如下文献中：吴伟，何梅凤，唐细兰，等.眼部细菌感染病原菌分布及耐药性分析[J].中国医院药学杂志，2010，30(20):1786-1788.。上述任一所述肺炎克雷伯氏菌具体可记载与如下文献中：张志明，李建平，朱建伟.16S rRNA在检测肺炎克雷伯菌引起血流感染中的应用[J].中国热带医学，2011，11(3):272-273.。上述任一所述鲍曼不动杆菌具体可记载与如下文献中：张晓千，时文化，史团省，等.PCR-Tag荧光技术在检测鲍曼不动杆菌中的初步应用[J].郑州大学学报(理学版)，2013，45(1)：90-94.。
上述任一所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌ATCC No.25922。上述任一所述铜绿假单胞菌具体可为铜绿假单胞菌ATCC No.27853。上述任一所述肺炎克雷伯氏菌具体可为肺炎克雷伯氏菌ATCC No.700603。上述任一所述鲍曼不动杆菌具体可为鲍曼不动杆菌ATCCNo.19606。这些菌株均保藏于美国模式培养物集存库(简称ATCC，地址：American TypeCulture Collection(ATCC)10801University Boulevard Manassas,VA 20110USA)，公众可从美国模式培养物集存库获得该菌株。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术，其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测眼内液中常见的4种革兰氏阴性细菌。LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势。
本发明提供的引物组合用于检测眼内液中常见的4种革兰氏阴性细菌，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。
附图说明
图1为实施例2的检测结果。
图2为实施例4的检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
10×ThermoPol Buffer为Thermo公司的产品。20×EvaGreen为合肥博美生物公司的产品。
下述实施例中的大肠杆菌和铜绿假单胞菌均记载与如下文献中：吴伟，何梅凤，唐细兰，等.眼部细菌感染病原菌分布及耐药性分析[J].中国医院药学杂志，2010，30(20):1786-1788.。
下述实施例中的肺炎克雷伯氏菌记载与如下文献中：张志明，李建平，朱建伟.16SrRNA在检测肺炎克雷伯菌引起血流感染中的应用[J].中国热带医学，2011，11(3):272-273.。
下述实施例中的鲍曼不动杆菌记载与如下文献中：张晓千，时文化，史团省，等.PCR-Tag荧光技术在检测鲍曼不动杆菌中的初步应用[J].郑州大学学报(理学版)，2013，45(1)：90-94.。
实施例1、试剂盒的制备
试剂盒由四个LAMP引物组组成，每个引物组用于检测眼内液中1种革兰氏阴性细菌。
用于检测大肠杆菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列1)：GGCATCGTGGTGATTGATGA；
外引物B3(序列2)：GGTTCGTTGGCAATACTCCA；
内引物FIP(序列3)：TCTTTCGGCTTGTTGCCCGCCTGCTGTCGGCTTTAACCTC；
内引物BIP(序列4)：TACAGCGAAGAGGCAGTCAACGTTTTGGTTTTTGTCACGCGCTATC；
环引物LF(序列5)：TTCGAAACCAATGCCTAAAGA；
环引物LB(序列6)：GCGCACTTACAGGCGATT。
用于检测铜绿假单胞菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列7)：CAAggTgTTCATCCACgA；
外引物B3(序列8)：CgCTCCAgCgCTTTTCC；
内引物FIP(序列9)：ACTCgTCgCCCATCTCgATggACTgAACgCCggTAACCA；
内引物BIP(序列10)：gCACgAgAgCAACgAgATgCgTCTgggCCATgACCAC；
环引物LF(序列11)：TgTAgATCggCgACATgTg；
环引物LB(序列12)：CATCAgCCATgCCggggTC。
用于检测肺炎克雷伯氏菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列13)：ATACAAAAACACCAgTgTAgg；
外引物B3(序列14)：gCCgCCAgTTTgTTTCAg；
内引物FIP(序列15)：CgTTgAgATTTgCgAAgTACCAAgAATCAAATATgCTgCAAATgTg；
内引物BIP(序列16)：CAAACgCATAATAAgCAggTgATTTCggAggTgATgTTTTCggTC；
环引物LF(序列17)：TgCCCggCCATC；
环引物LB(序列18)：ATCATATCgTTCggCT。
用于检测鲍曼不动杆菌引物组如下(5’→3’)：
外引物F3(序列19)：TCAGAAACTAAAGTTAAAGTCGT；
外引物B3(序列20)：GATATTACGTTCAATTTCTTCAGC；
内引物FIP(序列21)：CCTAGTTGGTTAGTACCTTTACCGTAAGAACAAAATGGCTCCTCC；
内引物BIP(序列22)：TACAACAGGATATCGTACAGAAAGCTTGGCCAATTTTATTGCCTTGA；
环引物LF(序列23)：AGAATTTGGAAAATAGCTTCTTT；
环引物LB(序列24)：TGGTGCATGGTATTCATA。
用于检测大肠杆菌的引物组命名为引物组Ⅰ。用于检测铜绿假单胞菌的引物组命名为引物组Ⅱ。用于检测肺炎克雷伯氏菌的引物组命名为引物组Ⅲ。用于检测鲍曼不动杆菌的引物组命名为引物组Ⅳ。
实施例2、特异性
待测样本1：大肠杆菌。
待测样本2：铜绿假单胞菌。
待测样本3：肺炎克雷伯氏菌。
待测样本4：鲍曼不动杆菌。
各个待测样本分别进行如下步骤：
1、提取待测样本的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，分别采用实施例1制备的各个引物组进行环介导等温扩增。
反应体系(10μL)：1μL 10×ThermoPol Buffer、1.6μL浓度为5M的甜菜碱、0.1μL浓度为50mg/mL的BSA水溶液、0.4μL浓度为100mM的MgSO4水溶液、0.3μL20×EvaGreen、0.15μL浓度为100mM的dNTPs(每种)、0.4μL浓度为8U/mL的Bst DNA聚合酶大片段、待测样本的基因组DNA(在50pg-50ng之间)、1μL引物混合物，补水至10μL。引物混合物即引物组中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。以循环数为横坐标，荧光信号强度为纵坐标，绘制扩增曲线。
按照上述方法，将待测样本的基因组DNA替换为灭菌超纯水，其它步骤均不变，作为阴性对照。
采用引物组Ⅰ的结果见图1中A。只有当待测样本为大肠杆菌的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本2、3、4的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组Ⅱ的结果见图1中B。只有当待测样本为铜绿假单胞菌的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本1、3、4的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组Ⅲ的结果见图1中C。只有当待测样本为肺炎克雷伯氏菌的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本1、2、4的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组Ⅳ的结果见图1中D。只有当待测样本为鲍曼不动杆菌的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本1、2、3的时候均不显示阳性扩增曲线。
以上结果表明，本发明提供的四个引物组分别对其靶标菌具有很高的特异性。
实施例3、灵敏度
待测样本1：大肠杆菌。
待测样本2：铜绿假单胞菌。
待测样本3：肺炎克雷伯氏菌。
待测样本4：鲍曼不动杆菌。
各个待测样本分别进行如下步骤：
1、提取待测样本的基因组DNA，用无菌水进行梯度稀释，得到各个稀释液。
2、以步骤1得到的稀释液为模板，分别采用实施例1制备的引物组进行环介导等温扩增。
待测样本为待测样本1时，采用引物组Ⅰ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本2时，采用引物组Ⅱ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本3时，采用引物组Ⅲ进行环介导等温扩增。待测样本为待测样本4时，采用引物组Ⅳ进行环介导等温扩增。
反应体系(10μL)：1μL 10×ThermoPol Buffer、1.6μL浓度为5M的甜菜碱、0.1μL浓度为50mg/mL的BSA水溶液、0.4μL浓度为100mM的MgSO4水溶液、0.3μL20×EvaGreen、0.15μL浓度为100mM的dNTPs(每种)、0.4μL浓度为8U/mL的Bst DNA聚合酶大片段、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数为104个、103个、5×102个或102个)、1μL引物混合物，补水至10μL。引物混合物即引物组中的各条引物组成的混合物。反应体系中，外引物F3和外引物B3的终浓度均为0.5μM，内引物FIP和内引物BIP的终浓度均为2μM，环引物LF和环引物LB的终浓度均为1μM。
反应条件：65℃恒温50min。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。以循环数为横坐标，荧光信号强度为纵坐标，绘制扩增曲线。
如果在50min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现阳性扩增曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。
引物组Ⅰ检测靶标菌的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系，引物组Ⅱ检测靶标菌的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系，引物组Ⅲ检测靶标菌的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系，引物组Ⅳ检测靶标菌的灵敏度为5×102个拷贝数/反应体系。
实施例4、应用
待测样本为样本一、样本二、样本三、样本四或样本五：
样本一：临床鉴定为大肠杆菌阳性的眼部抽吸物样本(简称大肠杆菌阳性样本)。
样本二：临床鉴定为铜绿假单胞菌阳性的眼部抽吸物样本(简称铜绿假单胞菌阳性样本)。
样本三：临床鉴定为肺炎克雷伯氏菌阳性的眼部抽吸物样本(简称肺炎克雷伯氏菌阳性样本)。
样本四：临床鉴定为鲍曼不动杆菌阳性的眼部抽吸物样本(简称鲍曼不动杆菌阳性样本)。
样本五：临床鉴定不存在大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌的健康者的眼部抽吸物样本(简称健康者样本)。
1、提取待测样本的总DNA。
2、以步骤1提取的总DNA为模板，分别采用实施例1制备的各个引物组进行环介导等温扩增。
反应体系与反应条件均同实施例2。
反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。以循环数为横坐标，荧光信号强度为纵坐标，绘制扩增曲线。
按照上述方法，将待测样本的总DNA替换为灭菌超纯水，其它步骤均不变，作为阴性对照。
当检测样本一时，按照上述方法，将待测样本的总DNA替换为大肠杆菌的基因组DNA，其它步骤均不变，作为阳性对照。
当检测样本二时，按照上述方法，将待测样本的总DNA替换为铜绿假单胞菌的基因组DNA，其它步骤均不变，作为阳性对照。
当检测样本三时，按照上述方法，将待测样本的总DNA替换为肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA，其它步骤均不变，作为阳性对照。
当检测样本四时，按照上述方法，将待测样本的总DNA替换为鲍曼不动杆菌的基因组DNA，其它步骤均不变，作为阳性对照。
采用引物组Ⅰ的结果见图2中A。只有当待测样本为样本一的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本二、三、四、五的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组Ⅱ的结果见图2中B。只有当待测样本为样本二的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本一、三、四、五的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组Ⅲ的结果见图2中C。只有当待测样本为样本三的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本一、二、四、五的时候均不显示阳性扩增曲线。
采用引物组Ⅳ的结果见图2中D。只有当待测样本为样本四的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为“S型”扩增曲线)。当待测样本为待测样本一、二、三、五的时候均不显示阳性扩增曲线。
以上结果表明，利用本发明提供的引物组合进行眼内液中4种革兰氏阴性细菌的检测，结果准确可靠。
<110> 北京智德臻和医学检验所有限公司
<120> 一种用于检测眼内液中4种革兰氏阴性细菌的LAMP引物组合及应用
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
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tggtgcatgg tattcata 18

Claims (8)

1.引物组合，为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)：
(a1)由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ和引物组Ⅳ组成；
(a2)所述引物组Ⅰ；
(a3)由“所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ和所述引物组Ⅳ中的任意一个、任意两个或三个”和所述引物组Ⅰ组成；
(a4)由所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ和所述引物组Ⅳ中的任意两个或任意三个组成；
(a5)所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ或所述引物组Ⅳ；
所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；
所述引物Ⅰ-F3为如下(b1)或(b2)；
(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-B3为如下(b3)或(b4)；
(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-FIP为如下(b5)或(b6)；
(b5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(b6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-BIP为如下(b7)或(b8)；
(b7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(b8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-LF为如下(b9)或(b10)；
(b9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(b10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅰ-LB为如下(b11)或(b12)；
(b11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(b12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
所述引物组Ⅱ由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB组成；
所述引物Ⅱ-F3为如下(c1)或(c2)；
(c1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(c2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-B3为如下(c3)或(c4)；
(c3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(c4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-FIP为如下(c5)或(c6)；
(c5)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(c6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-BIP为如下(c7)或(c8)；
(c7)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(c8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-LF为如下(c9)或(c 10)；
(c9)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(c10)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅱ-LB为如下(c11)或(c12)；
(c11)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(c12)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子；
所述引物组Ⅲ由引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB组成；
所述引物Ⅲ-F3为如下(d1)或(d2)；
(d1)序列表的序列13所示的单链DNA分子；
(d2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-B3为如下(d3)或(d4)；
(d3)序列表的序列14所示的单链DNA分子；
(d4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-FIP为如下(d5)或(d6)；
(d5)序列表的序列15所示的单链DNA分子；
(d6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-BIP为如下(d7)或(d8)；
(d7)序列表的序列16所示的单链DNA分子；
(d8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-LF为如下(d9)或(d10)；
(d9)序列表的序列17所示的单链DNA分子；
(d10)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅲ-LB为如下(d11)或(d12)；
(d11)序列表的序列18所示的单链DNA分子；
(d12)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子；
所述引物组Ⅳ由引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB组成；
所述引物Ⅳ-F3为如下(e1)或(e2)；
(e1)序列表的序列19所示的单链DNA分子；
(e2)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-B3为如下(e3)或(e4)；
(e3)序列表的序列20所示的单链DNA分子；
(e4)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-FIP为如下(e5)或(e6)；
(e5)序列表的序列21所示的单链DNA分子；
(e6)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-BIP为如下(e7)或(e8)；
(e7)序列表的序列22所示的单链DNA分子；
(e8)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-LF为如下(e9)或(e10)；
(e9)序列表的序列23所示的单链DNA分子；
(e10)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ⅳ-LB为如下(e11)或(e12)；
(e11)序列表的序列24所示的单链DNA分子；
(e12)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的DNA分子。
2.权利要求1所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(h1)或(h2)：
(h1)鉴定大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌和/或肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌；
(h2)用于检测待测样本中是否含有大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌和/或肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌。
3.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(h1)或(h2)：
(h1)鉴定大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌和/或肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌；
(h2)用于检测待测样本中是否含有大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌和/或肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
5.一种检测待测菌是否为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌或鲍曼不动杆菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测菌的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为大肠杆菌；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为铜绿假单胞菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为肺炎克雷伯氏菌；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为鲍曼不动杆菌。
6.一种检测待测样本中是否含有大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌和/或肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总DNA；
(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的每个引物组进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物组Ⅰ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有大肠杆菌；
如果采用所述引物组Ⅱ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有铜绿假单胞菌；
如果采用所述引物组Ⅲ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有肺炎克雷伯氏菌；
如果采用所述引物组Ⅳ可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有鲍曼不动杆菌。
7.权利要求1所述引物组合在检测待测菌是否为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌或鲍曼不动杆菌中的应用。
8.权利要求1所述引物组合在检测待测样本中是否含有大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌和/或肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌中的应用。
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