JP2013039077A - 食中毒原因大腸菌検出用プライマー及び検出用キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌をLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号:14、50、65及び89で表される塩基配列からなる4つのオリゴヌクレオチドのセットを含むプライマーセット等を提供する。
【選択図】なし
Description
インチミンは、その938アミノ酸中、N末端領域がβ−バレルと呼ばれる樽状構造を呈し、この領域がインチミンの2量体を構成するとともに菌の外膜に突き刺さった状態で、C末端側280アミノ酸領域を菌体外に突出する状態をとる。このC末端側280アミノ酸領域がTir分子に結合する機能を有する。こうして、EHECは、宿主細胞表面の受容体に加えてこのTirとの結合によって細胞に強く接着し、固定された状態で上述のシガ毒素を産生する(非特許文献1)。
EHECの主な生息場所は、哺乳動物や鳥類の腸管内とされており、牛、羊、山羊、豚、鶏、猫、犬などから分離された他、井戸水、河川泥、昆虫(ハエ)などからも分離された。食品の汚染源としては、と畜場における家畜の解体と食肉加工工程において、腸管内容物からの食肉ならびに内臓肉への汚染が主要なものとされているが、調理過程に至るまでの衛生管理や食肉ならびに内臓肉の保存状態も汚染を拡大させる要因となる(非特許文献1)。
しかしながら、このように増菌や分離培養などを経て各種生化学試験などを行う手法は、結果を得るまでに時間を要する。そのため、遺伝子を用いた試験法が注目されており、例えば、EHECに特異的な遺伝子領域(例えばO157などについてはVT、VT1、又はVT2)を増幅し、確認するPCR(Polymerase Chain Reaction)法が広く用いられている(非特許文献3)。
また、eae遺伝子の存在に関係なく、シガ毒素を産生する一群の菌をシガ毒素産生性大腸菌(Shiga-toxin-producing Escherichia coli、以下「STEC」という。)と呼ぶが、現在ではEHECとSTECの区別は明確ではない。
EHECや、STECのうちeae遺伝子を有するものも、EHECと同様にインチミンを介して宿主細胞に強く結合して毒性を発揮するので、インチミン又はeae遺伝子を検出すれば、同様の作用機序で食中毒を引き起こす大腸菌をまとめて検出することが可能である。
まず、標的DNAについて、3'末端側からF3c、F2c、F1cという3つの領域を、標的DNAの5'末端側に向かってB1、B2、B3という領域をそれぞれ規定し、この6領域に対し、4種類のプライマー、すなわちFIP、F3、BIPおよびB3を設計する。ここで、F3c、F2c、F1cの各領域に相補的な領域はそれぞれF3、F2、F1と呼び、またB1、B2、B3の各領域に相補的な領域はそれぞれB1c、B2c、B3cと呼ぶ。
FIPは、標的DNAのF2c領域と相補的なF2領域を3’末端側にもち、5’末端側に標的DNAのF1c領域と同じ配列をもつように設計されたプライマーである。
F3は、標的DNAのF3c領域と相補的なF3領域をもつように設計されたプライマーである。
BIPは、標的DNAのB2c領域と相補的なB2領域を3’末端側にもち、5’末端側に標的遺伝子のB1c領域と同じ配列をもつように設計されたプライマーである。
B3は、標的DNAのB3c領域と相補的なB3領域をもつように設計されたプライマーである。
FIPおよびBIPに制限酵素部位を導入すると、反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に1つのバンドとして観察することができる。なお、標的DNAに制限酵素部位があれば、プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくても同様の効果が得られる。
標的DNAを、4つのプライマー、鎖置換型DNAポリメラーゼ、及び基質(dNTPs)と反応バッファー中で反応させることにより、等温(約60〜65℃)で、極めて高い増幅効率及び極めて高い特異性をもって増幅される。鎖置換型DNAポリメラーゼは、PCR法で用いられる耐熱性DNAポリメラーゼに比較して安価である。また、鎖置換型DNAポリメラーゼは、鋳型DNAの二本鎖をほどきながらDNA合成を行うので、LAMP法ではPCR法のように熱変性によって二本鎖DNAを一本鎖DNAにする必要がない。
増幅反応の副産物としてピロリン酸マグネシウムが生成されるので、反応バッファーの白濁を目視で確認することにより、標的遺伝子の有無を判定することもできる。
さらに、B1領域とB2領域の間、又はF1領域とF2領域の間に相補的な配列をもつループプライマー(それぞれLBプライマー、LFプライマーと称する。)を用いることにより、DNA合成の起点を増やして増幅効率を上昇させることができる。
以上は、標的がDNAである場合について記載したが、標的がRNAである場合は、反応バッファーに逆転写酵素を加えることでDNAと同様に増幅反応を行うことができる(以上、非特許文献7)。
これまで、食中毒原因大腸菌のeae遺伝子を特異的にLAMP法で検出するための標的配列及びプライマーは見出されていなかった。
すなわち、本発明は、
〔1〕eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌をLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、以下の(a)〜(d)のいずれかのオリゴヌクレオチドのセットを含む、プライマーセット:
(a)それぞれ配列番号:14、50、65及び89で表される塩基配列からなる4つのオリゴヌクレオチドのセット;
(b)(a)の4つのオリゴヌクレオチドのそれぞれの相補鎖である4つのオリゴヌクレオチドのセット;
(c)(a)又は(b)に記載の4つオリゴヌクレオチドとそれぞれストリンジェントな条件でハイブリダイズする4つのオリゴヌクレオチドのセット;及び
(d)(a)〜(c)のいずれかのオリゴヌクレオチドのセットに含まれるオリゴヌクレオチドの少なくとも1つにおいて1から数個の塩基が欠失、付加又は置換され、且つLAMP法用プライマーセットとして機能するオリゴヌクレオチドのセット;
〔2〕さらに、(e)〜(h)のいずれかのオリゴヌクレオチドを含む、上記〔1〕に記載のプライマーセット:
(e)配列番号:99で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;
(f)(e)のオリゴヌクレオチドの相補鎖であるオリゴヌクレオチド;及び
(g)(e)又は(f)に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド;及び
(h)(e)〜(g)のいずれかのオリゴヌクレオチドにおいて1から数個の塩基が欠失、付加又は置換され、且つLAMP法用プライマーとして機能するオリゴヌクレオチド;
〔3〕前記食中毒原因大腸菌が、腸管出血性大腸菌(EHEC)、腸管病原性大腸菌(EPEC)、及び視が毒素産生性大腸菌(STEC)からなる群より選択されるいずれかの大腸菌である、上記〔1〕または〔2〕に記載のプライマーセット;
〔4〕上記〔1〕から〔3〕のいずれか1項に記載のプライマーセットを含む、eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌の検出用キット;
〔5〕eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌を検出する方法であって、
試料中の核酸を抽出する工程と、
LAMP法により、GenBankのAccession No.AF530557の642位から877位に含まれる領域を検出する工程と、
を含む方法;及び
〔6〕前記LAMP法において上記〔1〕から〔3〕のいずれか1項に記載のプライマーセットを使用する、上記〔5〕に記載の方法
に関する。
本発明者は、国際的な遺伝子データベース(GenBank、EMBL及びDDBJ)を使用して、eae遺伝子の塩基配列をすべて収集し、1塩基でも異なるものは別の配列として整理したところ、全部で83通りの配列を得た。このeae遺伝子の塩基配列は、例えばGenBankのデータベースなどから入手可能であり、AF530555、AF530557、AJ579305などの登録番号を有している。これらを比較して、配列が互いに100%保存されている領域と95%以上保存されている領域を特定した。これらの領域のうち、約250塩基長の領域で、且つその5分の4以上が100%保存されており、残りの5分の1が95%以上保存されている領域を特定した。このような領域は複数箇所特定できたが、それらから特異的な配列を特定し、LAMPプライマーを設計した。
プライマーの設計にあたっては上記塩基配列を標的に、各領域のTm値が約58〜65℃になる部分を選択し、またF2〜B2領域間が120bp程度になるようにした。LAMPプライマーの設計の上でポイントとなるこれら幾つかの条件を満たす領域を絞り込みeae遺伝子検出用プライマーを設定した。
例えば、配列番号:14、50、65及び89で表される塩基配列と相補的な配列からなる4つのオリゴヌクレオチドを含むセットも、GenBank登録番号AF530557において642位〜877位の領域を特異的に検出することができる。
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、5%Denhardt's Solution(0.1%Ficoll(Pharmacia社)、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%ウシ血清アルブミンを含む)と、0.5%SDSと、100μg/mlサケ精子DNAを含む6×SSC溶液(1×SSCは0.15M NaCl、15mM クエン酸ナトリウム)中において65℃で洗浄する条件をいう。ストリンジェンシーは塩濃度(イオン強度)、温度等によって制御することができ、ストリンジェンシーがより高い条件、即ち塩濃度がより低く、温度がより高い条件では、相同性が十分に高いDNAのみがハイブリダイズする。従って、かかる条件下で、上記第一の態様における各オリゴヌクレオチドと、それぞれストリンジェントな条件でハイブリダイズする4つのオリゴヌクレオチドは、第一の態様におけるプライマーセットと同様に、LAMP法のプライマーとして機能する。当業者であれば、温度や塩濃度を調整することによって、ストリンジェントな条件を適宜選択することができる。
1から数個とは、例えば、1個、2個、3個、4個、又は5個から選択することができ、欠失、付加又は置換される部位は、オリゴヌクレオチドの5'末端又は3'末端でもよいし、末端以外の部分であってもよい。
各プライマーに、例えば、制限酵素部位を導入してもよい。制限酵素部位を導入すると、LAMP法の反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に1つのバンドとして検出することができる。
(i)配列番号:99で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;
(ii)(i)のオリゴヌクレオチドの相補鎖であるオリゴヌクレオチド;
(iii)(i)又は(ii)に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド;及び
(iv)(i)〜(iii)のいずれかのオリゴヌクレオチドにおいて1から数個の塩基が欠失、付加又は置換され、且つLAMP法用プライマーとして機能するオリゴヌクレオチド。
配列番号:99で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、LAMP法において、ループプライマーであるLBプライマーとして機能する。ループプライマーとは、LAMP法において、ダンベル構造の5'末端側のループの1本鎖部分(B1領域とB2領域の間、またはF1領域とF2領域の間)に相補的な配列を有するプライマーである。
LAMP法は、FIP、BIP、F3、B3の4つのプライマーで実施することができるが、ループプライマーを用いることにより、DNA合成の起点を増やして増幅効率を上昇させることが可能である。
かかるLBプライマーの相補鎖であるオリゴヌクレオチド(ii)、オリゴヌクレオチド(i)又は(ii)とストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド(iii)、(i)〜(iii)のオリゴヌクレオチドにおいて1から数個の塩基が欠失、付加又は置換され、且つLAMP法用プライマーとして機能するオリゴヌクレオチド(iv)も、LBプライマーとして機能する。
本明細書において、食中毒原因大腸菌の検出用キットは、本発明に係るプライマーセットを含み、eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌の検出に適している。かかるキットは、例えば、プライマーセットのほか、反応溶液、鎖置換型DNAポリメラーゼ、蒸留水、陽性コントロール、陰性コンロトール、取扱説明書等を含んでいてもよい。さらに、試料から核酸を抽出するための試薬や器具、各種反応用チューブ、チップ等を備えていてもよい。
また、食品中の腸管出血性大腸菌を培養して測定する場合には、増菌用培地を備えていてもよい。
かかるキットを用いれば、例えば、反応チューブに試料を添加して、LAMP用のリアルタイム濁度測定装置にセットすることにより、増幅及び増幅産物の検出を効率よく行うことができる。
本明細書において、eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌を検出する方法は、試料中の核酸を抽出する工程と、LAMP法により、eae遺伝子のうち、GenBank登録番号AF530557における642位〜877位に含まれる領域を検出する工程と、を含む。
試料は、例えば、食肉、野菜、果物、乳製品、魚介類等の各種食品検体、土壌、河川・湖沼の水等の環境検体、ヒト、ウシ、ウマ等の動物由来の組織、糞便等の検体とすることができる。
これらの試料から核酸を抽出する工程は、公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができるが、例えば、DNAをアルカリ熱抽出する方法で行うことができる。この場合、例えば、試料をアルカリ溶液中で加熱し、遠心処理を行った後、上清をLAMP法に使用する。LAMP法に供する前に核酸の濃縮を行ってもよい。
核酸の抽出は、LysozymeやProteinase Kなどによって菌体を処理してから加熱する方法で行ってもよい。さらに、フェノール/クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心処理によりさらなる精製を行ってもよい。
また、核酸抽出に先立って、増菌培養、菌の濃縮、分離等を行ってもよい。具体的には寒天培地上で増菌培養し、形成されたコロニーからDNAを抽出する。菌の濃縮、分離は、ろ過、遠心分離などを用いた公知の方法に従って行うことができる。
LAMP反応試薬は、例えば、栄研化学社から市販されているLoopamp DNA増幅試薬キット(但し、プライマーセットを除く)を使用してもよい。この場合、反応液の例は次のとおりである。
2倍濃度反応用緩衝液:40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4、0.2% Tween20、1.6M Betaine;
各終濃度2.8mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP;
DNAポリメラーゼ:Bst DNA Polymerase 8 units/μl;
本発明の各プライマー(終濃度):FIPおよびBIP各40μM、F3およびB3各5μM、LB 20μM。
LAMP反応液としては、例えば、滅菌蒸留水を4.5μl、2倍濃度反応用緩衝液を12.5μl、FIP、BIP、F3、 B3、LBの各プライマーを1μl加え、DNAポリメラーゼ1μl、検体液(鋳型DNA)2μlを加え、全量25μlとする。
10倍濃度反応用緩衝液:200mM Tris-HCl(pH8.8)、100mM KCl、100mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、1% Triton X-100;50mM MgSO4;
各終濃度25mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP(例えばニッポンジーン社製 dNTPs Mixture (25mM each));
5M Betaine (例えばSigma社製);
DNAポリメラーゼ:Bst DNA polymerase Large fragment 8units/μl;
本発明の各プライマー(終濃度):FIPおよびBIP各40μM、F3およびB3各5μM、LB 20μM。
この場合、LAMP反応液としては、例えば、滅菌蒸留水を2.1μl、10倍濃度反応用緩衝液を2.5μl、MgSO4 を3.0μl、Betaineを8.0μl、dNTPs Mixtureを1.4μl、FIP、BIP、F3、B3、LBの各プライマーを1μl加え、DNAポリメラーゼ1μl、検体液(鋳型DNA)2μlを加え、全量25μlとする。
陽性コントロール及び/又は陰性コントロールを使用し、コントロールの濁度の変化と、試料の濁度の変化とを比較することにより、反応が適切に進行したかどうかを確認し、検査の精度を上げることができる。
EHEC、STEC、及びEPECのeae遺伝子と他の大腸菌の塩基配列とを比較し、eae遺伝子に特異的なLAMPプライマーを設計した。設計したプライマーセットにおけるプライマーの配列は以下のとおりである。プライマーは、HPLCで精製したものを用いた。
LAMP反応に用いる各試薬の濃度の内容は次のとおりであるが、LAMP反応試薬は栄研化学社製のLoopamp DNA増幅試薬キットを用い、栄研化学社のDNA増幅試薬キットLMP204の添付説明書に従って実験を行った。
2倍濃度反応用緩衝液:40mM Tris-HCl(pH8.8)、20mM KCl、20mM (NH4)2SO4、16mM MgSO4、0.2% Tween20、1.6M Betaine。
各終濃度2.8mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP。
DNAポリメラーゼ:Bst DNA Polymerase 8 units/μl。
プライマー(終濃度):FIP、BIP 各40μM、F3、B3 各5μM、LB 各20μM。
これらの菌株は、いずれも本発明者の研究室で保存されている株であり、O157A、O157B(いずれも本発明者の研究室で使用している名前)、A29及びB31は、実際に食中毒の原因となった株である。87-1、4-2、1-1、17-2、54-1、14-5は、健康な牛の糞便から単離し、stx遺伝子とeae遺伝子を保有することを確認している。
また、コントロールで用いた株のうち、9-1、13-4、18-1は、健康な牛の糞便から単離し、stx遺伝子を保有するが、eae遺伝子を保有しないことを確認している。sample E及び34-105は、食肉の検査で牛肉表面から分離された株であり、stx遺伝子を保有するが、eae遺伝子を保有しないことを確認している。FU-1、MC-1、KR-1、IW-1は、浮腫病と呼ばれる豚の大腸菌症を発症した豚から分離された株であり、浮腫病の株に特異的なシガ毒素遺伝子stx-eを保有するが、eae遺伝子を保有しないことを確認している。
濁度測定装置は、LAMP反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムによる白濁を経時的に観察することが可能で、濁度が上昇するものをeae遺伝子について陽性(+)、濁度の上昇が認められないものを陰性(−)とした。
プライマーセット32及び25を用いた結果を図1−5、及び以下の表に示した。
図1〜3及び5の各レーンは以下のとおりである。
プライマーセット32は、LBを加えない場合(図1)も加えた場合も(図3上段及び図4)、eae遺伝子を保有するEHECのみに、増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムの白濁が観察され、eae遺伝子を保有しないSTECでは白濁を生じなかった。
プライマーセット25は、eae遺伝子を保有しないSTECでは白濁を生じなかったが、eae遺伝子を保有するSTECについて白濁が明瞭でないものが存在した(図2)。特にLBを加えた場合に白濁が十分に生じない傾向が見られた(図3下段)。
なお、他のプライマーセットは、偽陽性、偽陰性が多く見られ、eae遺伝子を特異的に検出するのに適していなかった。
配列番号27〜50は、BIPプライマーのDNA配列を示す。
配列番号51〜69、100及び102〜104は、F3プライマーのDNA配列を示す。
配列番号70〜89及び105は、B3プライマーのDNA配列を示す。
配列番号90〜93は、LFプライマーのDNA配列を示す。
配列番号94〜99は、LBプライマーのDNA配列を示す。
Claims (6)
- eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌をLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、以下の(a)〜(d)のいずれかのオリゴヌクレオチドのセットを含む、プライマーセット:
(a)それぞれ配列番号:14、50、65及び89で表される塩基配列からなる4つのオリゴヌクレオチドのセット;
(b)(a)の4つのオリゴヌクレオチドのそれぞれの相補鎖である4つのオリゴヌクレオチドのセット;
(c)(a)又は(b)に記載の4つオリゴヌクレオチドとそれぞれストリンジェントな条件でハイブリダイズする4つのオリゴヌクレオチドのセット;及び
(d)(a)〜(c)のいずれかのオリゴヌクレオチドのセットに含まれるオリゴヌクレオチドの少なくとも1つにおいて1から数個の塩基が欠失、付加又は置換され、且つLAMP法用プライマーセットとして機能するオリゴヌクレオチドのセット。 - さらに、(e)〜(h)のいずれかのオリゴヌクレオチドを含む、請求項1に記載のプライマーセット:
(e)配列番号:99で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;
(f)(e)のオリゴヌクレオチドの相補鎖であるオリゴヌクレオチド;及び
(g)(e)又は(f)に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド;及び
(h)(e)〜(g)のいずれかのオリゴヌクレオチドにおいて1から数個の塩基が欠失、付加又は置換され、且つLAMP法用プライマーとして機能するオリゴヌクレオチド。 - 前記食中毒原因大腸菌が、腸管出血性大腸菌(EHEC)、腸管病原性大腸菌(EPEC)、及び視が毒素産生性大腸菌(STEC)からなる群より選択されるいずれかの大腸菌である、請求項1または2に記載のプライマーセット。
- 請求項1から3のいずれか1項に記載のプライマーセットを含む、eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌の検出用キット。
- eae遺伝子を有する食中毒原因大腸菌を検出する方法であって、
試料中の核酸を抽出する工程と、
LAMP法により、GenBankのAccession No.AF530557の642位から877位に含まれる領域を検出する工程と、
を含む方法。 - 前記LAMP法において請求項1から3のいずれか1項に記載のプライマーセットを使用する、請求項5に記載の方法。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104450896A (zh) * | 2014-11-24 | 2015-03-25 | 武汉明曼基因工程有限公司 | 一种大肠菌群的快速检测试剂盒及其应用 |
CN110129316A (zh) * | 2018-02-05 | 2019-08-16 | 北京智德医学检验所有限公司 | 一种用于检测眼内液中4种革兰氏阴性细菌的lamp引物组合及应用 |
CN111518934A (zh) * | 2020-05-21 | 2020-08-11 | 四川大学 | 大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法及试剂盒 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002090538A1 (fr) * | 2001-05-08 | 2002-11-14 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Procede de synthese d'acide nucleique |
JP2004081054A (ja) * | 2002-08-26 | 2004-03-18 | Eiken Chem Co Ltd | 腸管出血性大腸菌ベロトキシン検出のためのプライマーおよびそれを用いた腸管出血性大腸菌の同定法 |
JP2004519225A (ja) * | 2001-01-08 | 2004-07-02 | バイオテコン ダイアグノステック ゲーエムベーハー | 病原性細菌の検出方法 |
JP2008005837A (ja) * | 2006-06-02 | 2008-01-17 | Toyobo Co Ltd | 微生物の識別方法、及び該方法に使用するプライマー並びに識別キット |
WO2011018762A1 (en) * | 2009-08-11 | 2011-02-17 | Agence Nationale Chargee De La Securite Sanitaire De L'alimentation, De L'environnement Et Du Travail | An assay for determining a molecular risk assessment of a complex polymicrobial sample suspected to contain an ehec |
-
2011
- 2011-08-16 JP JP2011178084A patent/JP5979657B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004519225A (ja) * | 2001-01-08 | 2004-07-02 | バイオテコン ダイアグノステック ゲーエムベーハー | 病原性細菌の検出方法 |
WO2002090538A1 (fr) * | 2001-05-08 | 2002-11-14 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Procede de synthese d'acide nucleique |
JP2004081054A (ja) * | 2002-08-26 | 2004-03-18 | Eiken Chem Co Ltd | 腸管出血性大腸菌ベロトキシン検出のためのプライマーおよびそれを用いた腸管出血性大腸菌の同定法 |
JP2008005837A (ja) * | 2006-06-02 | 2008-01-17 | Toyobo Co Ltd | 微生物の識別方法、及び該方法に使用するプライマー並びに識別キット |
WO2011018762A1 (en) * | 2009-08-11 | 2011-02-17 | Agence Nationale Chargee De La Securite Sanitaire De L'alimentation, De L'environnement Et Du Travail | An assay for determining a molecular risk assessment of a complex polymicrobial sample suspected to contain an ehec |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6016003970; ウイルス Vol.54, No.1, 2004, p.107-112 * |
JPN6016003983; LAMP法プライマー設計の手引き , 200407, 栄研化学株式会社 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104450896A (zh) * | 2014-11-24 | 2015-03-25 | 武汉明曼基因工程有限公司 | 一种大肠菌群的快速检测试剂盒及其应用 |
CN110129316A (zh) * | 2018-02-05 | 2019-08-16 | 北京智德医学检验所有限公司 | 一种用于检测眼内液中4种革兰氏阴性细菌的lamp引物组合及应用 |
CN111518934A (zh) * | 2020-05-21 | 2020-08-11 | 四川大学 | 大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法及试剂盒 |
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