CN111518934A - 大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法及试剂盒，所述检测试剂盒包括13套LAMP检测引物，分别为aggR、ast A、bfpB、escV、ipa H、Ita、Itb、pic、stp、sth、stx1A、stx2A和uidA特征基因检测引物，每套均包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，成环引物LoopF和LoopB。通过13套LAMP检测引物的交叉使用，可实现各种致泻型大肠杆菌的毒素基因快速分型检测和普通大肠杆菌基因快速检测，采用环介导等温扩增技术，省去了PCR反应的变性、温度循环等一系列繁琐的过程，节省了反应时间，而且灵敏性比常规PCR高10倍以上；无需电泳检测，直接通过观察颜色变化即可区分阴阳性；整个检测过程只需一个水浴锅即可完成检测，既提高了肉眼的识别率，又可直接用于现场疫病的诊断。
Description
技术领域
本发明涉及大肠杆菌检测技术领域，具体涉及大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法及试剂盒。
背景技术
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)通常被称为大肠杆菌，为人和动物肠道中的正常栖居菌。一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物具有严重致病性。根据其流行病学特征、发病机制及临床特征等，可将致泻性大肠埃希氏菌分为肠致病性大肠埃希氏菌(enteropathogenic E.coli，EPEC)、肠出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagic E.coli，EHEC)、肠产毒大肠埃希氏菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasive E.coli，EIEC)、肠聚集性大肠埃希氏菌(enteroaggregative E.coli，EAEC)。
致泻大肠埃希氏菌所产生的致病物质主要包括定居因子、黏附素、外毒素以及肠毒素等，不同类型的致泻大肠埃希氏菌的侵袭部位以及产生的致病物质均有差别，可经食物和饮用水在人群中广泛传播，造成严重疫情。对致泻大肠埃希氏菌检测与甄别方法为选择性分离、生化鉴定、血清学鉴定等，实验周期较长，且一般实验室很难拥有完备的大肠杆菌诊断血清。
近年已有研究采用单重PCR、多重PCR，实时荧光PCR，基因芯片等技术对致泻大肠埃希氏菌进行检测，以达到检测其毒力基因、不同致病型别区分的目的，这些方法时效性、高效性及灵敏度都较传统方法有较大改善，但是此类方法加样步骤繁琐，需要专业人员操作，需要电泳检测，荧光PCR及基因芯片用到的仪器又比较昂贵，同时检测时间虽然有缩短，但是仍然需要2-4h或更长时间。
发明内容
本发明的目的在于提供大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法，通过设计13套LAMP检测引物，每套LAMP检测引物包括6条引物，通过13套LAMP检测引物的交叉使用，可实现各种致泻型大肠杆菌的毒素基因快速分型检测和普通大肠杆菌基因快速检测。
此外，本发明还提供包括13套LAMP检测引物的试剂盒。
本发明通过下述技术方案实现：
大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法，包括以下步骤：
步骤1)、13套引物设计：分别下载GenBank中发表的大肠杆菌基因aggR、ast A、bfpB、escV、ipa H、Ita、Itb、pic、stp、sth、stx1A、stx2A和uidA，运用引物在线设计软件PrimerExplorerV4分别设计13套LAMP检测引物；
步骤2)、提取细菌的DNA模板；
步骤3)、将引物、DNA模板与检测试剂制成LAMP反应体系，利用LAMP反应体系对目标序列进行LAMP扩增，进行检测，通过颜色变化判定目标序列的类型。
进一步的，13套LAMP检测引物，分别为aggR、ast A、bfpB、escV、ipa H、Ita、Itb、pic、stp、sth、stx1A、stx2A和uidA特征基因检测引物，每套均包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，成环引物LoopF和LoopB，其中，所述aggR的外引物F31和B31的碱基序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，所述aggR的内引物FIP1和BIP1的碱基序列分别如SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4所示，所述aggR的成环引物LoopF1和LoopB1的碱基序列分别如SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6所示；所述ast A的外引物F32和B32的碱基序列分别如SEQ ID No.7、SEQID No.8所示，所述ast A的内引物FIP2和BIP2的碱基序列分别如SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10所示，所述ast A的成环引物LoopF2和LoopB2的碱基序列分别如SEQ ID No.11、SEQID No.12所示；所述bfpB的外引物F33和B33的碱基序列分别如SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14所示，所述bfpB的内引物FIP3和BIP3的碱基序列分别如SEQ ID No.15、SEQ ID No.16所示，所述bfpB的成环引物LoopF3和LoopB3的碱基序列分别如SEQ ID No.17、SEQ IDNo.18所示；所述escV的外引物F34和B34的碱基序列分别如SEQ ID No.19、SEQ ID No.20所示，所述escV的内引物FIP4和BIP4的碱基序列分别如SEQ ID No.21、SEQ ID No.22所示，所述escV的成环引物LoopF4和LoopB4的碱基序列分别如SEQ ID No.23、SEQ ID No.24所示；所述ipa H的外引物F35和B35的碱基序列分别如SEQ ID No.25、SEQ ID No.26所示，所述ipa H的内引物FIP5和BIP5的碱基序列分别如SEQ ID No.27、SEQ ID No.28所示，所述ipaH的成环引物LoopF5和LoopB5的碱基序列分别如SEQ ID No.29、SEQ ID No.30所示；所述Ita的外引物F36和B36的碱基序列分别如SEQ ID No.31、SEQ ID No.32所示，所述Ita的内引物FIP6和BIP6的碱基序列分别如SEQ ID No.33、SEQ ID No.34所示，所述Ita的成环引物LoopF6和LoopB6的碱基序列分别如SEQ ID No.35、SEQ ID No.36所示；所述Itb的外引物F37和B37的碱基序列分别如SEQ ID No.37、SEQ ID No.38所示，所述Itb的内引物FIP7和BIP7的碱基序列分别如SEQ ID No.39、SEQ ID No.40所示，所述Itb的成环引物LoopF7和LoopB7的碱基序列分别如SEQ ID No.41、SEQ ID No.42所示；所述pic的外引物F38和B38的碱基序列分别如SEQ ID No.43、SEQ ID No.44所示，所述pic的内引物FIP8和BIP8的碱基序列分别如SEQ ID No.45、SEQ ID No.46所示，所述pic的成环引物Loop8和LoopB8的碱基序列分别如SEQ ID No.47、SEQ ID No.48所示；所述stp的外引物F39和B39的碱基序列分别如SEQ ID No.49、SEQ ID No.50所示，所述stp的内引物FIP9和BIP9的碱基序列分别如SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52所示，所述stp的成环引物LoopF9和LoopB9的碱基序列分别如SEQ IDNo.53、SEQ ID No.54所示；所述sth的外引物F310和B310的碱基序列分别如SEQ ID No.55、SEQ ID No.56所示，所述sth的内引物FIP10和BIP10的碱基序列分别如SEQ ID No.57、SEQID No.58所示，所述sth的成环引物LoopF10和LoopB10的碱基序列分别如SEQ ID No.59、SEQ ID No.60所示；所述stx1A的外引物F311和B311的碱基序列分别如SEQ ID No.61、SEQID No.62所示，所述stx1A的内引物FIP11和BIP11的碱基序列分别如SEQ ID No.63、SEQ IDNo.64所示，所述stx1A的成环引物LoopF11和LoopB11的碱基序列分别如SEQ ID No.65、SEQID No.66所示；所述stx2A的外引物F312和B312的碱基序列分别如SEQ ID No.67、SEQ IDNo.68所示，所述stx2A的内引物FIP12和BIP12的碱基序列分别如SEQ ID No.69、SEQ IDNo.70所示，所述stx2A的成环引物LoopF12和LoopB12的碱基序列分别如SEQ ID No.71、SEQID No.72所示；所述uidA的外引物F313和B313的碱基序列分别如SEQ ID No.73、SEQ IDNo.74所示，所述uidA的内引物FI13和BIP13的碱基序列分别如SEQ ID No.75、SEQ IDNo.76所示，所述uidA的成环引物LoopF13和LoopB13的碱基序列分别如SEQ ID No.77、SEQID No.78所示。
进一步的，检测试剂包括2xHNB LAMP Mix，Bst2.0 DNAPolymerase，5M Betain和超纯水。
进一步的，LAMP扩增的条件为62℃水浴45min。
由于60～65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，而且也是Bst DNA聚合酶适宜的反映温度，因此按照以上摸索的反应体系，将LAMP体系中各成分混匀，将反应温度分别设定为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃进行多次重复试验，根据电泳结果确定LAMP反应所需的适宜温度为62℃；根据上述摸索的反应体系将体系中各成分混匀后，在适宜的反应温度下分别反应15min、30min、45min、60min、75min、90min，进行多次重复试验，根据电泳结果确定反应所需的适宜时间为75min；在以上LAMP反应体系和反应条件的摸索过程中，每次都必须以超纯水为模板作为阴性对照，以免发生污染，只有在阴性对照成立时，整个实验有效；根据上述确定的反应体系，在适宜反应条件下扩增后，观察颜色变化，为LAMP可视化检测。
进一步的，DNA模板的提取步骤：
步骤11)、取细菌培养物于离心管中离心去上清液；
步骤12)、将菌体沉淀重悬于灭菌的超纯水中，混匀；
步骤13)、采用煮沸法分别制备各细菌的DNA模板。
用于检测大肠杆菌通用型和致病型基因的试剂盒，包括权利要求2所述的13套LAMP检测引物。
进一步的，试剂盒还包括检测试剂和DNA模板。
进一步的，速检测试剂盒中各个因为的浓度均稀释至100μM。
致泻型大肠杆菌按目前国际上的分类主要包括6类，即肠致病性大肠埃希茵(EPEC)、肠产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)和肠集聚性大肠埃希菌(EAEC)以及近来发现的肠产志贺样毒素且具有侵袭力的大肠埃希菌(ESIES)。根据《GB 4789.6-2016食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》要求，判断标准如表1所示：
表1
本发明所述试剂盒包括13套LAMP检测引物，每套LAMP检测引物包括6条引物，通过13套LAMP检测引物的交叉使用，可实现各种致泻型大肠杆菌的毒素(大肠杆菌致病型)基因快速分型检测和普通大肠杆菌(大肠杆菌通用型)基因快速检测。
本发明采用环介导等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification，LAMP)，与传统的PCR技术相比，设计特殊的引物，采用恒温条件进行一部扩增，省去了PCR反应的变性、温度循环等一系列繁琐的过程，节省了反应时间，而且灵敏性比常规PCR高10倍以上。LAMP技术通过6条特异性引物对目的序列的6个区域退火杂交，利用BstDNA聚合酶的催化作用，在反应体系中萘酚添加羟基蓝(HNB)作为指示剂，恒温条件下(60～65℃)温育30～60min，实现对目标序列的批量扩增。由于羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，Mg2+与HNB结合使得反应体系初始颜色为紫罗兰色，随着反应的进行，Mg2+与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去了Mg2+使得体系颜色变为天蓝色，而未反应的体系则仍保持着紫罗兰色，因此无需电泳检测，直接通过观察颜色变化即可区分阴阳性。此法无需PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器，整个检测过程只需一个水浴锅即可完成检测，既提高了肉眼的识别率，又可直接用于现场疫病的诊断。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明所述试剂盒包括13套LAMP检测引物，每套LAMP检测引物包括6条引物，通过13套LAMP检测引物的交叉使用，可实现各种致泻型大肠杆菌的毒素基因快速分型检测和普通大肠杆菌基因快速检测。
2、本发明采用环介导等温扩增技术，与传统的PCR技术相比，设计特殊的引物，采用恒温条件进行一部扩增，省去了PCR反应的变性、扩增，延伸的温度循环等一系列繁琐的过程，且反应体系中采用萘酚添加羟基蓝(HNB)作为指示剂，若反应阳性羟基萘酚蓝失去了Mg2+使得体系颜色变为天蓝色，而未反应的体系则仍保持着紫罗兰色，因此无需电泳检测，直接通过观察颜色变化即可区分阴阳性；从加样到结果判断，整个过程不超过1h，节省了反应时间，而且灵敏性比常规PCR高10倍以上；此法无需PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器，整个检测过程只需一个水浴锅即可完成检测，既提高了肉眼的识别率，又可直接用于现场疫病的诊断。
3、本发明所述检测试剂盒的特异性强，与其他细菌无交叉反应，检测灵敏度达到50fg/μL(约100CFU/ml)，且重复性好。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
大肠杆菌通用型基因现场鉴定方法，包括以下步骤：
步骤1)、113套引物设计：分别下载GenBank中发表的大肠杆菌基因aggR、ast A、bfpB、escV、ipa H、Ita、Itb、pic、stp、sth、stx1A、stx2A和uidA，运用引物在线设计软件PrimerExplorerV4分别设计13套LAMP检测引物；13套LAMP检测引物分别为aggR、ast A、bfpB、escV、ipa H、Ita、Itb、pic、stp(牛)、sth(人)、stx1A、stx2A和uidA特征基因检测引物，每套均包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，成环引物LoopF和LoopB，其中，所述aggR的外引物F31和B31的碱基序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，所述aggR的内引物FIP1和BIP1的碱基序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示，所述aggR的成环引物LoopF1和LoopB1的碱基序列分别如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示；所述ast A的外引物F32和B32的碱基序列分别如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示，所述astA的内引物FIP2和BIP2的碱基序列分别如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示，所述ast A的成环引物LoopF2和LoopB2的碱基序列分别如SEQ ID No.11、SEQ ID No.12所示；所述bfpB的外引物F33和B33的碱基序列分别如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14所示，所述bfpB的内引物FIP3和BIP3的碱基序列分别如SEQ ID No.15、SEQ ID No.16所示，所述bfpB的成环引物LoopF3和LoopB3的碱基序列分别如SEQ ID No.17、SEQ ID No.18所示；所述escV的外引物F34和B34的碱基序列分别如SEQ ID No.19、SEQ ID No.20所示，所述escV的内引物FIP4和BIP4的碱基序列分别如SEQ ID No.21、SEQ ID No.22所示，所述escV的成环引物LoopF4和LoopB4的碱基序列分别如SEQ ID No.23、SEQ ID No.24所示；所述ipa H的外引物F35和B35的碱基序列分别如SEQ ID No.25、SEQ ID No.26所示，所述ipa H的内引物FIP5和BIP5的碱基序列分别如SEQID No.27、SEQ ID No.28所示，所述ipa H的成环引物LoopF5和LoopB5的碱基序列分别如SEQ ID No.29、SEQ ID No.30所示；所述Ita的外引物F36和B36的碱基序列分别如SEQ IDNo.31、SEQ ID No.32所示，所述Ita的内引物FIP6和BIP6的碱基序列分别如SEQ ID No.33、SEQ ID No.34所示，所述Ita的成环引物LoopF6和LoopB6的碱基序列分别如SEQ ID No.35、SEQ ID No.36所示；所述Itb的外引物F37和B37的碱基序列分别如SEQ ID No.37、SEQ IDNo.38所示，所述Itb的内引物FIP7和BIP7的碱基序列分别如SEQ ID No.39、SEQ ID No.40所示，所述Itb的成环引物LoopF7和LoopB7的碱基序列分别如SEQ ID No.41、SEQ ID No.42所示；所述pic的外引物F38和B38的碱基序列分别如SEQ ID No.43、SEQ ID No.44所示，所述pic的内引物FIP8和BIP8的碱基序列分别如SEQ ID No.45、SEQ ID No.46所示，所述pic的成环引物Loop8和LoopB8的碱基序列分别如SEQ ID No.47、SEQ ID No.48所示；所述stp的外引物F39和B39的碱基序列分别如SEQ ID No.49、SEQ ID No.50所示，所述stp的内引物FIP9和BIP9的碱基序列分别如SEQ ID No.51、SEQ ID No.52所示，所述stp的成环引物LoopF9和LoopB9的碱基序列分别如SEQ ID No.53、SEQ ID No.54所示；所述sth的外引物F310和B310的碱基序列分别如SEQ ID No.55、SEQ ID No.56所示，所述sth的内引物FIP10和BIP10的碱基序列分别如SEQ ID No.57、SEQ ID No.58所示，所述sth的成环引物LoopF10和LoopB10的碱基序列分别如SEQ ID No.59、SEQ ID No.60所示；所述stx1A的外引物F311和B311的碱基序列分别如SEQ ID No.61、SEQ ID No.62所示，所述stx1A的内引物FIP11和BIP11的碱基序列分别如SEQ ID No.63、SEQ ID No.64所示，所述stx1A的成环引物LoopF11和LoopB11的碱基序列分别如SEQ ID No.65、SEQ ID No.66所示；所述stx2A的外引物F312和B312的碱基序列分别如SEQ ID No.67、SEQ ID No.68所示，所述stx2A的内引物FIP12和BIP12的碱基序列分别如SEQ ID No.69、SEQ ID No.70所示，所述stx2A的成环引物LoopF12和LoopB12的碱基序列分别如SEQ ID No.71、SEQ ID No.72所示；所述uidA的外引物F313和B313的碱基序列分别如SEQ ID No.73、SEQ ID No.74所示，所述uidA的内引物FI13和BIP13的碱基序列分别如SEQ ID No.75、SEQ ID No.76所示，所述uidA的成环引物LoopF13和LoopB13的碱基序列分别如SEQ ID No.77、SEQ ID No.78所示；
步骤2)、提取细菌的DNA模板：
11)、取lmL细菌培养物于1.5mL离心管中，在冷冻离心机中，4℃，以12000rpm离心5min，弃去上清；
12)、将菌体沉淀重悬于100μL灭菌的超纯水中，用漩涡混合器混匀后；
13)、采用煮沸法分别制备各细菌的DNA模板。步骤如下：100℃沸水中煮沸10min，迅速将其转移值-20℃冷却5min，12000rpm离心5min后，吸取上清转移至无菌EP管中，即可作为模板，-20℃条件下保存备用；
步骤3)、将引物、DNA模板与检测试剂制成LAMP反应体系，利用LAMP反应体系对目标序列进行LAMP扩增，LAMP扩增的条件为62℃水浴45min，进行检测，通过颜色变化判定目标序列的类型，其中，反应结束后观察颜色变化，蓝色为阳性，紫色为阴性，所述检测试剂包括2xHNB LAMP Mix，Bst2.0 DNAPolymerase，5M Betain，超纯水。其中10x LAMP PrimerMix配制和所述LAMP反应体系分别如表2、表3所示：
表2
| 成分 | 体积μL | 浓度(μM) |
| F3 | 2 | 2 |
| B3 | 2 | 2 |
| FIP | 16 | 16 |
| BIP | 16 | 16 |
| LoopF | 4 | 4 |
| LoopB | 4 | 4 |
| 超纯水 | 56 | - |
| Total | 100 | - |
表3
| 成分 | 体积μL |
| 2xHNB LAMP Mix | 12.5 |
| 10x LAMP Primer Mix | 2.5 |
| 5M Betain | 2 |
| DNA模板 | 1 |
| Bst2.0DNAPolymerase | 1 |
| 超纯水 | 6 |
| Total | 25 |
用于检测大肠杆菌通用型和致病型基因的试剂盒，包括上述13套LAMP检测引物。
LAMP特异性检测：
采用煮沸法分别提取大肠杆菌EPEC(Escherichia coli E2348/69)，EHEC(ATCC35150)，EIEC(Escherichia coli strain 39740)，EAEC(Escherichia coli 042)，ETEC(Escherichia coli 24377A)、变形杆菌、葡萄球菌、巴氏杆菌、链球菌、大肠弯曲菌、粪肠球菌和产气肠杆菌的基因组DNA作为模板，应用建立的LAMP体系对各细菌DNA进行LAMP扩增，检测方法的特异性。
检测结果如表4所示：
表4
LAMP和PCR灵敏性检测：
将提取的大肠杆菌的DNA模板用超纯水按照10倍倍比稀释成200ng/gL、20ng/μL、2ng/μL、200pg/μL、20pg/μL、2pg/μL、200fg/μL、20fg/μL，2fg/μL,0.2fg/μL 10个浓度梯度，分别取1μL大肠杆菌不同稀释倍数的DNA模板，按照建立的体系分别进行试验，检测方法的灵敏度。检测结果如表5所示：
表5
| DNA浓度 | 检测结果 | 菌浓度(CFU/ml) | 检测结果 |
| 200ng/μL | + | 10<sup>9</sup> | + |
| 20ng/μL | + | 10<sup>8</sup> | + |
| 2ng/μL | + | 10<sup>7</sup> | + |
| 200pg/μL | + | 10<sup>6</sup> | + |
| 20pg/μL | + | 10<sup>5</sup> | + |
| 200fg/μL | + | 10<sup>4</sup> | + |
| 20fg/μL | + | 10<sup>3</sup> | + |
| 2fg/μL | + | 10<sup>2</sup> | + |
| 0.2fg/μL | - | 10<sup>1</sup> | + |
| 阴性对照 | - | 10<sup>0</sup> | - |
| 阴性对照 | - |
实施例2：
大肠杆菌致病型基因现场鉴定方法，该方法采用的检测方法、检测试剂盒(引物和试剂)与实施例1一致。
一种检测试剂盒，该检测试剂盒包括实施例1中的13套LAMP检测引物，能够用于检测大肠杆菌致病型基因和大肠杆菌通用型基因。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川大学
西藏农牧学院
成都乐助生物科技有限公司
<120> 大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法及试剂盒
<160> 78
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列1(aggR F3)
<400> 1
caatcagatt aagcagcgat 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列2(aggR B3)
<400> 2
atatactctg actcaagcct t 21
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列3(aggR FIP)
<400> 3
atacagaatc gtcagcatca gcgatgccct gatgataata tacg 44
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列4(aggR BIP)
<400> 4
atatcggctg taagcttctt gcaataatag ctagagtcca tc 42
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列5(aggR LoopF)
<400> 5
accaattcgg acaactgc 18
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列6(aggR LoopB)
<400> 6
acacaatcga gaaggactta tc 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列7(astA F3)
<400> 7
gtatcgaaag ggcaatcaaa 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列8(astA B3)
<400> 8
atttcgacag caaatagcc 19
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列9(astA FIP)
<400> 9
agttgtacca gggatcgttc aggaagatag cgagacagg 39
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列10(astA BIP)
<400> 10
cgttggttca cgcctcaagg tgtgatcgtt actgaga 37
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列11(astA LoopF)
<400> 11
ccacctcaat ggcacaaa 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列12(astA LoopB)
<400> 12
tataacgcat tgccgacg 18
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列13(bfpB F3)
<400> 13
tctgtaacta cgatgtcagg 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列14(bfpB B3)
<400> 14
ggtaattgaa ttacggttcc a 21
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列15(bfpB FIP)
<400> 15
ccgctggtaa cagttgacgg actgtattaa gccagtcatc 40
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列16(bfpB BIP)
<400> 16
ccgcaggttg ctgatgactg agccaacaag ttctga 36
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列17(bfpB LoopF)
<400> 17
tactggctgt tgtactggt 19
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列18(bfpB LoopB)
<400> 18
gcagtatggt gtaacgctt 19
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列19(escV F3)
<400> 19
gtggtggata tcattatcgc 20
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列20(escV B3)
<400> 20
attgtacaat ggtgataatg gt 22
<210> 21
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列22(escV FIP)
<400> 21
ggttgtacta acactgagcg acaatcctct tgagctaact tct 43
<210> 22
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列22(escV BIP)
<400> 22
agacttattc tgctgcatca cgaatattac cgccaacaac aa 42
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列23(escV LoopF)
<400> 23
cgtcgtaatc aacaggattg ta 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列24(escV LoopB)
<400> 24
cgggtgacat tatttactcc tt 22
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列25(ipaH F3)
<400> 25
aagaaaccat ctccagca 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列26(ipaH B3)
<400> 26
taacgagact ggcattgt 18
<210> 27
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列27(ipaH FIP)
<400> 27
ttaattcgct ccacggcaat tgtgaacgac tagaacaatg g 41
<210> 28
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列28(ipaH BIP)
<400> 28
tcgaacatgg catctcttga tttttaacgt attaactgtc gagg 44
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列29(ipaH LoopF)
<400> 29
tcttcaccat tattaagcga ct 22
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列30(ipaH LoopB)
<400> 30
ttgagtgagt taccgccta 19
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列31(lta F3)
<400> 31
ttggtgtgat tgatgaacg 19
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列32(lta B3)
<400> 32
ttccctgaga tatattgtgc t 21
<210> 33
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列33(lta FIP)
<400> 33
tggtgatccg gtgggaaatg aatatagctc cggcag 36
<210> 34
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列34(lta BIP)
<400> 34
ttggagagaa gaaccctgga ttatcatctg taattgctct tgat 44
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列35(lta LoopF)
<400> 35
cctgctaatc tgtaaccatc c 21
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列36(lta LoopB)
<400> 36
tcatgcacca caaggttg 18
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列37(ltb F3)
<400> 37
atgttcggaa tatcgcaac 19
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列38(ltb B3)
<400> 38
gattgccgca attgaattg 19
<210> 39
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列39(ltb FIP)
<400> 39
gggacttcga cctgaaatgt tgatatacgg aatcgatggc a 41
<210> 40
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列40(ltb BIP)
<400> 40
gggcagtcaa catatagact ccctcggtca gatatgcgat 40
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列41(ltb LoopF)
<400> 41
cgccgctctt aaatgtaatg 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列42(ltb LoopB)
<400> 42
gccattgaaa ggatgaagga 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列43(pic F3)
<400> 43
tccgtcctta tcatataccg 20
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列44(pic B3)
<400> 44
ttattgctgt ctctgaactt g 21
<210> 45
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列45(pic FIP)
<400> 45
tccgttccga tattgcctat cagaatatca ttggcaccag g 41
<210> 46
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列46(pic BIP)
<400> 46
cgcctgggat atctgagagt aattaacgca tattcttctg gc 42
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列47(pic LoopF)
<400> 47
tttatcgtga tttcgccgaa 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列48(pic LoopB)
<400> 48
cacagacaga ttgctggaat 20
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列49(stp F3)
<400> 49
ataacatgat gcaactcaca a 21
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列50(stp B3)
<400> 50
ttctcagcac caatacatat 20
<210> 51
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列51(stp FIP)
<400> 51
agagtcaagt gattcagttg acgacgggag gtaacatgaa 40
<210> 52
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列52(stp BIP)
<400> 52
ttactgctgt gaactttgtt gtataaagat tccctctatg cttt 44
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列53(stp LoopF)
<400> 53
aaattgccaa cattagcttt 20
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列54(stp LoopB)
<400> 54
tgcctgtgct ggatgtta 18
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列55(sth F3)
<400> 55
gtatagtatg atgttcatca ca 22
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列56(sth B3)
<400> 56
tacaggcatc atcagaatca 20
<210> 57
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列57(sth FIP)
<400> 57
tgaagactct actggtttag caaatgttcg tggatgccat 40
<210> 58
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列58(sth BIP)
<400> 58
aaagtgatcc tgaaagcatg aaaagcagga ttacaacaca att 43
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列59(sth LoopF)
<400> 59
tcctgagcga aaggtgaa 18
<210> 60
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列60(sth LoopB)
<400> 60
agtagcaatt actgctgtg 19
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列61(stx1A F3)
<400> 61
aacatcttca gcagtcatta c 21
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列62(stx1A B3)
<400> 62
gttacattgt ctggtgacag 20
<210> 63
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列63(stx1A FIP)
<400> 63
acggtttgtt actgtgacag ctcatccagt gttgtacgaa 40
<210> 64
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列64(stx1A BIP)
<400> 64
cttgccacag actgcgtcgc cattcgttga ctacttc 37
<210> 65
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列65(stx1A LoopF)
<400> 65
tttcggcaaa tacagaggg 19
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列66(stx1A LoopB)
<400> 66
aggttccact atgcgaca 18
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列67(stx2A F3)
<400> 67
tctggcgtta atggagtt 18
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列68(stx2A B3)
<400> 68
ctctgacacc atcctctc 18
<210> 69
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列69(stx2A FIP)
<400> 69
cgtaaggctt ctgctgtgac ggtaatacaa tgaccagaga tg 42
<210> 70
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列70(stx2A BIP)
<400> 70
ttcgtcaggc actgtctgac agttcagagt gaggtcc 37
<210> 71
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列71(stx2A LoopF)
<400> 71
gcagaactgc tctggatg 18
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列72(stx2A LoopB)
<400> 72
tgctcctgtg tatacgatga 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列73(uidA F3)
<400> 73
cgaacagttc ctgattaacc 20
<210> 74
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列74(uidA B3)
<400> 74
agcagcagtt tcatcaatc 19
<210> 75
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列75(uidA FIP)
<400> 75
ccaatccagt ccattaatgc gtcatgaaga tgcggacttg 40
<210> 76
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列76(uidA BIP)
<400> 76
ctcctaccgt acctcgcatt acgatgccat gttcatctg 39
<210> 77
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列77(uidA LoopF)
<400> 77
gcaccatcag cacgttat 18
<210> 78
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列78(uidA LoopB)
<400> 78
ccttacgctg aagagatgc 19
Claims (8)
1.大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)、13套引物设计：分别下载GenBank中发表的大肠杆菌基因aggR、ast A、bfpB、escV、ipa H、Ita、Itb、pic、stp、sth、stx1A、stx2A和uidA，运用引物在线设计软件PrimerExplorerV4分别设计13套LAMP检测引物；
步骤2)、提取细菌的DNA模板；
步骤3)、将引物、DNA模板与检测试剂制成LAMP反应体系，利用LAMP反应体系对目标序列进行LAMP扩增，进行检测，通过颜色变化判定目标序列的类型。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法，其特征在于，所述13套LAMP检测引物，分别为aggR、ast A、bfpB、escV、ipa H、Ita、Itb、pic、stp、sth、stx1A、stx2A和uidA特征基因检测引物，每套均包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，成环引物LoopF和LoopB，其中，所述aggR的外引物F31和B31的碱基序列分别如SEQ ID No.1、SEQID No.2所示，所述aggR的内引物FIP1和BIP1的碱基序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示，所述aggR的成环引物LoopF1和LoopB1的碱基序列分别如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示；所述ast A的外引物F32和B32的碱基序列分别如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示，所述ast A的内引物FIP2和BIP2的碱基序列分别如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示，所述astA的成环引物LoopF2和LoopB2的碱基序列分别如SEQ ID No.11、SEQ ID No.12所示；所述bfpB的外引物F33和B33的碱基序列分别如SEQ ID No.13、SEQ ID No.14所示，所述bfpB的内引物FIP3和BIP3的碱基序列分别如SEQ ID No.15、SEQ ID No.16所示，所述bfpB的成环引物LoopF3和LoopB3的碱基序列分别如SEQ ID No.17、SEQ ID No.18所示；所述escV的外引物F34和B34的碱基序列分别如SEQ ID No.19、SEQ ID No.20所示，所述escV的内引物FIP4和BIP4的碱基序列分别如SEQ ID No.21、SEQ ID No.22所示，所述escV的成环引物LoopF4和LoopB4的碱基序列分别如SEQ ID No.23、SEQ ID No.24所示；所述ipa H的外引物F35和B35的碱基序列分别如SEQ ID No.25、SEQ ID No.26所示，所述ipa H的内引物FIP5和BIP5的碱基序列分别如SEQ ID No.27、SEQ ID No.28所示，所述ipa H的成环引物LoopF5和LoopB5的碱基序列分别如SEQ ID No.29、SEQ ID No.30所示；所述Ita的外引物F36和B36的碱基序列分别如SEQ ID No.31、SEQ ID No.32所示，所述Ita的内引物FIP6和BIP6的碱基序列分别如SEQ ID No.33、SEQ ID No.34所示，所述Ita的成环引物LoopF6和LoopB6的碱基序列分别如SEQ ID No.35、SEQ ID No.36所示；所述Itb的外引物F37和B37的碱基序列分别如SEQ ID No.37、SEQ ID No.38所示，所述Itb的内引物FIP7和BIP7的碱基序列分别如SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40所示，所述Itb的成环引物LoopF7和LoopB7的碱基序列分别如SEQ IDNo.41、SEQ ID No.42所示；所述pic的外引物F38和B38的碱基序列分别如SEQ ID No.43、SEQ ID No.44所示，所述pic的内引物FIP8和BIP8的碱基序列分别如SEQ ID No.45、SEQ IDNo.46所示，所述pic的成环引物Loop8和LoopB8的碱基序列分别如SEQ ID No.47、SEQ IDNo.48所示；所述stp的外引物F39和B39的碱基序列分别如SEQ ID No.49、SEQ ID No.50所示，所述stp的内引物FIP9和BIP9的碱基序列分别如SEQ ID No.51、SEQ ID No.52所示，所述stp的成环引物LoopF9和LoopB9的碱基序列分别如SEQ ID No.53、SEQ ID No.54所示；所述sth的外引物F310和B310的碱基序列分别如SEQ ID No.55、SEQ ID No.56所示，所述sth的内引物FIP10和BIP10的碱基序列分别如SEQ ID No.57、SEQ ID No.58所示，所述sth的成环引物LoopF10和LoopB10的碱基序列分别如SEQ ID No.59、SEQ ID No.60所示；所述stx1A的外引物F311和B311的碱基序列分别如SEQ ID No.61、SEQ ID No.62所示，所述stx1A的内引物FIP11和BIP11的碱基序列分别如SEQ ID No.63、SEQ ID No.64所示，所述stx1A的成环引物LoopF11和LoopB11的碱基序列分别如SEQ ID No.65、SEQ ID No.66所示；所述stx2A的外引物F312和B312的碱基序列分别如SEQ ID No.67、SEQ ID No.68所示，所述stx2A的内引物FIP12和BIP12的碱基序列分别如SEQ ID No.69、SEQ ID No.70所示，所述stx2A的成环引物LoopF12和LoopB12的碱基序列分别如SEQ ID No.71、SEQ ID No.72所示；所述uidA的外引物F313和B313的碱基序列分别如SEQ ID No.73、SEQ ID No.74所示，所述uidA的内引物FI13和BIP13的碱基序列分别如SEQ ID No.75、SEQ ID No.76所示，所述uidA的成环引物LoopF13和LoopB13的碱基序列分别如SEQ ID No.77、SEQ ID No.78所示。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法，其特征在于，所述检测试剂包括2xHNB LAMP Mix，Bst2.0 DNAPolymerase，5M Betain和超纯水。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法，其特征在于，所述LAMP扩增的条件为62℃水浴45min。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法，其特征在于，所述DNA模板的提取步骤：
步骤11)、取细菌培养物于离心管中离心去上清液；
步骤12)、将菌体沉淀重悬于灭菌的超纯水中，混匀；
步骤13)、采用煮沸法分别制备各细菌的DNA模板。
6.用于检测大肠杆菌通用型和致病型基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的13套LAMP检测引物。
7.根据权利要求6所述的用于检测大肠杆菌通用型和致病型基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测试剂和DNA模板。
8.根据权利要求6所述的用于检测大肠杆菌通用型和致病型基因的试剂盒，其特征在于，所述速检测试剂盒中各个因为的浓度均稀释至100μM。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112391485A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-02-23 | 江西中医药大学 | 用于检测口服药品中大肠杆菌的特异性引物及其检测方法 |
| CN113177548A (zh) * | 2021-05-08 | 2021-07-27 | 四川大学 | 一种针对免疫固定电泳的重点区域识别方法 |
| WO2022193754A1 (zh) * | 2021-03-17 | 2022-09-22 | 深圳先进技术研究院 | 荧光可视化的lamp产物检测方法及其试剂盒和应用 |
Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5189151A (en) * | 1990-05-16 | 1993-02-23 | Bernadette Baudry | Highly specific DNA probe for enteroaggregative escherichia coli |
| CN101665823A (zh) * | 2009-03-20 | 2010-03-10 | 徐君怡 | 致泻性大肠埃希氏菌检测试剂盒及其检测方法 |
| CN101942508A (zh) * | 2010-05-18 | 2011-01-12 | 广州华峰生物科技有限公司 | 大肠杆菌检测试剂盒及其使用方法 |
| JP2013039077A (ja) * | 2011-08-16 | 2013-02-28 | Univ Of Tokyo | 食中毒原因大腸菌検出用プライマー及び検出用キット |
| CN103484546A (zh) * | 2013-09-17 | 2014-01-01 | 北京卓诚惠生生物科技有限公司 | 十四种食源性致病菌多重pcr检测引物组和试剂盒 |
| CN106434901A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-22 | 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 | 多重pcr检测六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的方法 |
| CN106868203A (zh) * | 2017-04-28 | 2017-06-20 | 四川华汉三创生物科技有限公司 | 检测致泻性大肠埃希氏菌的核酸组合及其检测试剂盒与应用 |
| CN106967795A (zh) * | 2017-03-16 | 2017-07-21 | 江苏农牧科技职业学院 | 一种检测st‑ii型产肠毒素大肠杆菌的lamp试剂盒及使用方法 |
| CN107760766A (zh) * | 2017-12-05 | 2018-03-06 | 苏州国科闻普生物科技有限公司 | 多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的方法、试剂盒及其应用 |
| CN109628623A (zh) * | 2019-01-30 | 2019-04-16 | 谱尼测试集团股份有限公司 | 不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量pcr检测技术 |
| KR20190065682A (ko) * | 2017-12-04 | 2019-06-12 | 경희대학교 산학협력단 | icsA 타겟 유전자를 통해 장침습성 대장균을 신속 검출할 수 있는 Singleplex Real-Time PCR 키트 개발 |
| CN110093429A (zh) * | 2019-01-30 | 2019-08-06 | 宁波大学 | 一种腹泻性致病菌的高通量定量检测试剂盒 |
| CN110982916A (zh) * | 2020-01-02 | 2020-04-10 | 刘思洁 | 用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的引物组合及检测试剂盒 |
-
2020
- 2020-05-21 CN CN202010436029.XA patent/CN111518934A/zh active Pending
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5189151A (en) * | 1990-05-16 | 1993-02-23 | Bernadette Baudry | Highly specific DNA probe for enteroaggregative escherichia coli |
| CN101665823A (zh) * | 2009-03-20 | 2010-03-10 | 徐君怡 | 致泻性大肠埃希氏菌检测试剂盒及其检测方法 |
| CN101942508A (zh) * | 2010-05-18 | 2011-01-12 | 广州华峰生物科技有限公司 | 大肠杆菌检测试剂盒及其使用方法 |
| JP2013039077A (ja) * | 2011-08-16 | 2013-02-28 | Univ Of Tokyo | 食中毒原因大腸菌検出用プライマー及び検出用キット |
| CN103484546A (zh) * | 2013-09-17 | 2014-01-01 | 北京卓诚惠生生物科技有限公司 | 十四种食源性致病菌多重pcr检测引物组和试剂盒 |
| CN106434901A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-22 | 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 | 多重pcr检测六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的方法 |
| CN106967795A (zh) * | 2017-03-16 | 2017-07-21 | 江苏农牧科技职业学院 | 一种检测st‑ii型产肠毒素大肠杆菌的lamp试剂盒及使用方法 |
| CN106868203A (zh) * | 2017-04-28 | 2017-06-20 | 四川华汉三创生物科技有限公司 | 检测致泻性大肠埃希氏菌的核酸组合及其检测试剂盒与应用 |
| KR20190065682A (ko) * | 2017-12-04 | 2019-06-12 | 경희대학교 산학협력단 | icsA 타겟 유전자를 통해 장침습성 대장균을 신속 검출할 수 있는 Singleplex Real-Time PCR 키트 개발 |
| CN107760766A (zh) * | 2017-12-05 | 2018-03-06 | 苏州国科闻普生物科技有限公司 | 多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的方法、试剂盒及其应用 |
| CN109628623A (zh) * | 2019-01-30 | 2019-04-16 | 谱尼测试集团股份有限公司 | 不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量pcr检测技术 |
| CN110093429A (zh) * | 2019-01-30 | 2019-08-06 | 宁波大学 | 一种腹泻性致病菌的高通量定量检测试剂盒 |
| CN110982916A (zh) * | 2020-01-02 | 2020-04-10 | 刘思洁 | 用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的引物组合及检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| QINGLIANG CHEN 等: "apid genetic typing of diarrheagenic Escherichia coli using a two-tube modified molecular beacon based multiplex real-time PCR assay and its clinical application", 《ANN CLIN MICROBIOL ANTIMICROB》 * |
| 叶珍珍 等: "致泻性大肠埃希菌分子分型技术的研究进展", 《中国卫生检验杂志》 * |
| 谭贵良 等: "《现代分子生物学及组学技术在食品安全检测中的应用》", 30 June 2014, 中山大学出版社 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112391485A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-02-23 | 江西中医药大学 | 用于检测口服药品中大肠杆菌的特异性引物及其检测方法 |
| WO2022193754A1 (zh) * | 2021-03-17 | 2022-09-22 | 深圳先进技术研究院 | 荧光可视化的lamp产物检测方法及其试剂盒和应用 |
| CN113177548A (zh) * | 2021-05-08 | 2021-07-27 | 四川大学 | 一种针对免疫固定电泳的重点区域识别方法 |
| CN113177548B (zh) * | 2021-05-08 | 2022-07-08 | 四川大学 | 一种针对免疫固定电泳的重点区域识别方法 |
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