CN107760766A - 多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的方法、试剂盒及其应用 Download PDF

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CN107760766A CN201711270007.5A CN201711270007A CN107760766A CN 107760766 A CN107760766 A CN 107760766A CN 201711270007 A CN201711270007 A CN 201711270007A CN 107760766 A CN107760766 A CN 107760766A
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Abstract

本发明公开了一种多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的试剂盒，其包括可分别特异性扩增EPEC或EHEC的eae基因、EPEC或EHEC的escV基因、EPEC的bfpB基因、EHEC的stx1或stx2基因、ETEC的lt、sth或stp基因、EAEC的aggR、astA或pic基因、以及内质控IAC基因的引物探针组。并且，本发明还公开了一种应用上述试剂盒快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的方法和应用。本发明实现了十四重实时荧光定量PCR在同一反应管内同时检测食品中五种致泻大肠埃希氏菌的方法，可对这五种DEC国标中的所有特征性基因全部检测，防止漏检以及假阴性现象，具有检测时间短、操作简便、结果易于判读、灵敏度高、特异性好等优点。

Description

多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的方法、试剂盒及 其应用
技术领域
本发明涉及一种生物检测技术领域。更具体地说，本发明涉及一种多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的方法、试剂盒及其应用。
背景技术
致泻大肠埃希氏菌(DEC)是一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠杆菌的统称，常见的致泻大肠埃希氏菌主要包括致肠道致病性大肠埃希氏菌(EnteropathogenicEscherichia coli，EPEC)、产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shigatoxin-producingEscherichia coli，STEC)包括肠道出血性大肠埃希氏菌(EnterohemorrhagicEscherichia coli，EHEC)、产肠毒素大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)、肠道集聚性大肠埃希氏菌(Enteroaggregative Escherichia coli，EAEC)、肠道侵袭性大肠埃希氏菌(Enteroinvasive Escherichia coli，EIEC)，它们可通过污染食物引起人类发病。致泻大肠埃希氏菌感染多发于婴幼儿，近年来在成人腹泻患者中的检出率也有所增加，成为部分地区腹泻的主要病原菌，因此受到了广泛的关注。
传统检测大肠杆菌的方法需要先分离再培养，然后用经典的方法鉴定，不仅操作繁琐、耗时长、而且容易污染。免疫学方法虽然简单、方便、特异性较好，但是仍有交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等缺点。聚合酶链式反应(PCR)技术虽具有准确、灵敏、快速的特点，但是常规PCR技术的后电泳容易导致污染，易产生假阳性，使检测结果不准确等不足。荧光定量PCR技术具有准确性高、重现性好等特点，已广泛用于基因表达研究、病原体检测、SNP分析及基因分型等诸多领域。此方法采用完全闭管检测，省去了对PCR产物后处理，避免了交叉污染，结果判断由计算机完成，简化了操作步骤，并加强了结果的可靠性。多重实时荧光定量PCR可以做到在一管反应中同时扩增多个目标基因，并且可以同时快速检测。
现有的使用多重PCR方法对大肠埃希氏菌进行检测的方法虽然不少，但都存在一定的问题。专利“一种多重PCR检测六类大肠杆菌的试剂盒及其制备方法”(CN 105779605A)报道了可以同时检测六种大肠杆菌的方法，但是它是使用普通多重PCR然后再跑胶的方法，这样不仅会存在扩增片段相近条带无法区分开的现象，而且会出现在PCR结束后跑胶过程中因开盖等引起污染，同时操作步骤复杂，在实际应用中存在缺陷；专利“致泻大肠埃希氏菌检测试剂盒及其检测方法”(CN 102605068A)报道了可以同时检测四种致泻大肠埃希氏菌的方法，它用的是普通PCR然后再(DHPLC)变性高效液相色谱的方法，其同样存在PCR结束后因开盖引起污染问题，并且色谱法对操作人员和仪器等要求也较高，成本较大；专利“致泻性大肠杆菌检测试剂盒及其检测分型方法”(CN 103215358A)是运用荧光定量PCR的方法，但其需要分成两管进行检测，并且检测致病基因不全，也不能较好的达到快速、简便检测的目的。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的试剂盒，其包括十四种引物和荧光探针的混合液，可以同时检测eae、escV、bfpB、stx1、stx2、stp、sth、lt、aggR、astA、pic、invE、ipaH这十三个致泻大肠埃希氏菌的特征性基因与一种内质控基因。本发明试剂盒具有检测时间短、操作简便、结果易于判读、灵敏度高、特异性好等优点，可应用于致泻大肠埃希氏菌的快速检测。
本发明还有一个目的是提供一种多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的方法，其基于实时荧光定量PCR方法，实现了十四重实时荧光定量PCR在同一反应管内同时检测食品中五种致泻大肠埃希氏菌的方法，可对这五种DEC国标中的所有特征性基因全部检测，防止漏检现象，提高检测效率。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的试剂盒，其包括可特异性扩增致泻大肠埃希氏菌基因的引物探针组，其中所述引物探针组包括：
可特异性扩增肠道致病性大肠埃希氏菌或肠道出血性大肠埃希氏菌的eae基因的引物探针组；
可特异性扩增肠道致病性大肠埃希氏菌或肠道出血性大肠埃希氏菌的escV基因的引物探针组；
可特异性扩增肠道致病性大肠埃希氏菌的bfpB基因的引物探针组；
可特异性扩增肠道出血性大肠埃希氏菌的stx1或stx2基因的引物探针组；
可特异性扩增产肠毒素大肠埃希氏菌的lt、sth或stp基因的引物探针组；
可特异性扩增肠道集聚性大肠埃希氏菌的aggR、astA或pic基因的引物探针组；
可特异性扩增肠道侵袭性大肠埃希氏菌的invE或ipaH基因的物探针组。
常见致泻大肠埃希氏菌的13个致病基因或种属特异性基因，包括EPEC的bfpB、eae和escV基因；EHEC的stx1、stx2、eae和escV基因；ETEC的lt、sth和stp基因；EAEC的aggR、astA和pic基因以及EIEC的invE和ipaH基因，因此本申请文件通过对上述致泻大肠埃希氏菌中的所有特征性基因全部检测，防止漏检。
优选的是，其中，试剂盒还包括内质控IAC(Internal amplification control)，作为监测整个多重反应体系，避免由于样品中存在抑制剂、仪器故障、Taq酶的活性低、操作水平差等问题引起的假阴性结果。
其中所述内质控的引物探针组为：
IAC-F：5’-TCCAGGGCGAAAGTAAACGT-3’；和
IAC-R：5’-GGCGAGCCGTACGAACAC-3’；和
IAC-Probe：5’-CCCAGTTGGCTGATCACTTTCG-3’。
优选的是，其中，可特异性扩增肠道致病性大肠埃希氏菌或肠道出血性大肠埃希氏菌的eae基因的引物探针组为：
第一eae基因引物探针组，其包括：
eae-1F：5’-TGGTACGGGTAATGAAAATGATCTC-3’；和
eae-1R：5’-CGTAACGGCTGCCTGATAATG-3’；和
eae-probe：5’-AAACCGTGGTCTCAGCAAATTGAGCCA-3’；
或，第二eae基因引物探针组，其包括：
eae-2F：5’-AATGCAGTTCCGTTATCAGTTTGA-3’；和
eae-2R：5’-GGCTGCCTGATAATGTTCTTAACTC-3’；和
eae-probe：5’-AAACCGTGGTCTCAGCAAATTGAGCCA-3’；
可特异性扩增肠道致病性大肠埃希氏菌或肠道出血性大肠埃希氏菌的escV基因的引物探针组为：
第一escV基因引物探针组，其包括：
escV-1F：5’-CGCGCAGGCGTTATTGA-3’；和
escV-1R：5’-TTCATCGCCCCGTCCAT-3’；和
escV-probe：5’-CCGCTTGAGGCAAAAGTTCTTCGC-3’；
或，第二escV基因引物探针组，其包括：
escV-2F：5’-GTGCTCGTTTTTCCCTTGATG-3’；和
escV-2R：5’-CCCCGTCCATTGAACCATAA-3’；和
escV-probe：5’-CCGCTTGAGGCAAAAGTTCTTCGC-3’；
可特异性扩增肠道致病性大肠埃希氏菌的bfpb基因的引物探针组为：
第一bfpB基因引物探针组，其包括：
bfpB-1F：5’-CTTGCTCGGGTAATGGATTTTATAA-3’；和
bfpB-1R：5’-GTTTTGCTTACCATATCACTGCTTTT-3’；和
bfpB-probe：5’-ATATTCTGCATGCTGACACCTCATTGCTGA-3’；
或，第二bfpB基因引物探针组，其包括：
bfpB-2F：5’-GGCAGGTATTCACTTTTCTTATTGTG-3’；和
bfpB-2R：5’-CCCAGAGGTGTACTTGATCTCAGA-3’；和
bfpB-probe：5’-ATATTCTGCATGCTGACACCTCATTGCTGA-3’；
可特异性扩增肠道出血性大肠埃希氏菌的stx1基因的引物探针组为：
第一stx1基因引物探针组，其包括：
stx1-1F：5’-CATTCGTTGACTACTTCTTATCTGGATT-3’-3’；和
stx1-1R：5’-GCTGTCACAGTAACAAACCGTAACA-3’-3’；和
stx1-1Probe：5’-AACCTCACTGACGCAGTCTGTGGCAA-3’；
或，第二stx1基因引物探针组，其包括：
stx1-2F：5’-GCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAG-3’；和
stx1-2R：5’-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3’；和
stx1-2Probe：5’-CCATGATAGTCAGGCAGGACACTACTCAACC-3’；
可特异性扩增肠道出血性大肠埃希氏菌的stx2基因的引物探针组为：
第一stx2基因引物探针组，其包括：
stx2-1F：5’-GGACCACATCGGTGTCTGTTATT-3’；和
stx2-1R：5’-CGCGCCTGATAGACATCAAG-3’；和
stx2-1Probe：5’-CCCGCCGGGCAGTTATTTTGC-3’；
或，第二stx2基因引物探针组，其包括：
stx2-2F：5’-AGCAGTTATACCACTCTGCAACGT-3’；和
stx2-2R：5’-AACGCCAGATATGATGAAACCA-3’；和
stx2-2Probe：5’-AACGTTCCGGAATGCAAATCAGTCGTC-3’；
可特异性扩增产肠毒素大肠埃希氏菌的lt基因的引物探针组为：
第一lt基因引物探针组，其包括：
lt-1F：TGTTATAGCGACAGCACCAAATATG-3’；和
lt-1R：TGGTATTCCACCTAACGCAGAA-3’；和
lt-probe：AGGCGTATACAGCCCTCACCCATATGA-3’；
或，第二lt基因引物探针组，其包括：
lt-2F：5’-GCTTTGTCAGATATGATGACGGATAT-3’；和
lt-2R：5’-ACACGATACCATCCATATATCTGAGAATA-3’；和
lt-probe：5’-AGGCGTATACAGCCCTCACCCATATGA-3’；
可特异性扩增产肠毒素大肠埃希氏菌的sth基因的引物探针组为：
第一sth基因引物探针组，其包括：
sth-1F：5’-CCGGAGGTAATATGAAGAAATCAATAT-3’；和
sth-1R：5’-GCTTTCAGGACCACTTTTATTACTTTTT-3’；和
sth-probe：TGTCTTTTTCACCTTTCGCTCAGGATGC-3’；
或，第二sth基因引物探针组，其包括：
sth-2F：5’-AATGCCATGTTCCGGAGGTA-3’；和
sth-2R：5’-CTACTATTCATGCTTTCAGGACCACTT-3’；和
sth-probe：5’-TGTCTTTTTCACCTTTCGCTCAGGATGC-3’；
可特异性扩增产肠毒素大肠埃希氏菌的stp基因的引物探针组为：
第一stp基因引物探针组，其包括：
stp-1F：5’-CTTTCCCCTCTTTTAGTCAGTCAACT-3’；和
stp-R：5’-GCAGTAAAATGTGTTGTTCATATTTTCTG-3’；和
stp-probe：5’-TGACTCTTCAAAAGAGAAAA-3’；
或，第二stp基因引物探针组，其包括：
stp-2F：5’-GGGAGGTAACATGAAAAAGCTAATGT-3’；和
stp-R：5’-GCAGTAAAATGTGTTGTTCATATTTTCTG-3’；和
stp-probe：5’-TGACTCTTCAAAAGAGAAAA-3’；
可特异性扩增肠道集聚性大肠埃希氏菌的aggR基因的引物探针组为：
aggR-1F：5’-CAGCGATACATTAAGACGCCTAAAG-3’；和
aggR-1R：5’-CGTCAGCATCAGCTACAATTATTCC-3’；和
aggR-probe：5’-AGTTGTCCGAATTGGTC-3’；
可特异性扩增肠道集聚性大肠埃希氏菌的astA基因的引物探针组为：
第一astA基因引物探针组，其包括：
astA-F：5’-ATGTGCTGACTGAACTGAAAAACC-3’；和
astA-1R：5’-TTCAGGTCGCGAGTGACG-3’；和
astA-probe：5’-TCTGAACGATATCCTCATCGCCTGTGTG-3’；
或，第二astA基因引物探针组，其包括：
astA-F：5’-ATGTGCTGACTGAACTGAAAAACC-3’；和
astA-2R：5’-TTGTAGTCCTTCCATGACACG-3’；和
astA-probe：5’-TCTGAACGATATCCTCATCGCCTGTGTG-3’；
可特异性扩增肠道集聚性大肠埃希氏菌的pic基因的引物探针组为：
第一pic基因引物探针组，其包括：
pic-1F：5’-CAGTGAACCGACGATTGGAA-3’；和
pic-1R：5’-GGTCTGGCTGTTGAGTATCATG-3’；和
pic-probe：5’-CCTTTGGTGGTACCGGCACTCCA-3’；
或，第二pic基因引物探针组，其包括：
pic-2F：5’-GGCTCAGGATACAAATGTCAGTGA-3’；和
pic-2R：5’-CCATAGCTGGCAGATTTCAGAATA-3’；和
pic-probe：5’-CCTTTGGTGGTACCGGCACTCCA-3’；
可特异性扩增肠道侵袭性大肠埃希氏菌的invE基因的物探针组为：
第一invE基因引物探针组，其包括：
invE-1F：5’-AGAATCTGTCTCGCGCGAAA-3’；和
invE-1R：5’-TCTGACGCGATTGGAAATAGAG-3’；和
invE-probe：5’-CCTTTCAGGCAGCAAGCGTTCCA-3’；
或，第二invE基因引物探针组，其包括：
invE-2F：5’-GACATAGCCAAAAAAGAGAATCTGTCT-3’；和
invE-2R：5’-TCATTAAAGTTAAGTTCTGACGCGATT-3’；和
invE-probe：5’-CCTTTCAGGCAGCAAGCGTTCCA-3’；
可特异性扩增肠道侵袭性大肠埃希氏菌的ipaH基因的物探针组为：
第一ipaH基因引物探针组，其包括：
ipaH-1F：5’-CGTGAACAGGTCGCTGCAT-3’；和
ipaH-1R：5’-TGGACCAGGAGGGTTTTCC-3’；和
ipaH-probe：5’-ACCGTGTCGCGCTCACATGGA-3’；
或，第二ipaH基因引物探针组，其包括：
ipaH-2F：5’-CGCAATACCTCCGGATTCC-3’；和
ipaH-2R：5’-AAAGGCCTTCTGATGCCTGAT-3’；和
ipaH-probe：5’-ACCGTGTCGCGCTCACATGGA-3’。
并且，上述引物和探针均不存在严重的发卡结构及二聚体结构。
优选的是，其中，所述eae-probe、escV-probe、bfpB-probe、stx1-1Probe、stx1-2Probe、stx2-1Probe、stx2-2Probe、lt-probe、sth-probe、stp-probe、aggR-probe、astA-probe、pic-probe、invE-probe、ipaH-probe的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团。其中连接至探针5’端的荧光基团可发出荧光信号，连接至探针3’端的淬灭基团可以抑制荧光基团发出的荧光信号。在实时荧光定量PCR反应过程中，淬灭基团与荧光基团相互分离，荧光基团可以发出荧光信号，通过检测荧光信号的积累可以对未知模板进行定量分析。
优选的是，其中，所述荧光基团选自FAM、JOE、NED、ROX、CY3、CY5、VIC和TAMRA中的任意一种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2和NFQ-MGB中的任意一种。
优选的是，其中，试剂盒还包括PCR缓冲液、Taq酶、四种dNTP混合液和MgCl2；
其中，所述Taq酶浓度为0.03-0.1U/μL，所述四种dNTP混合液的浓度为0.1～0.4mmol/L；此外，Taq酶是Mg2+依赖性酶，对Mg2+浓度变化非常敏感，Mg2+的浓度除影响酶活性外，也影响引物的退火，模板与PCR产物的解链温度，产物的特异性引物二聚体的形成等，由此，在本申请文件PCR反应工作液中MgCl2的浓度为2～6mmol/L，以获得最佳的PCR扩增产率。
所述引物探针组中每个引物对的浓度为0.1～1μmol/L，每条探针的浓度范围为0.01～0.1μmol/L。
优选的是，其中，所述Taq酶的浓度为0.05U/μL；所述四种dNTP混合液的浓度为0.2mmol/L，在PCR反应工作液中MgCl2的浓度为为3mmol/L。
本发明的目的还可以进一步由一种应用所述试剂盒快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的方法的方法来实现，该方法包括如下步骤：
步骤1：提取待测样品的基因组；
步骤2：在荧光PCR仪上，采用试剂盒对所述基因组进行荧光定量PCR扩增反应；
PCR扩增反应步骤如下：
95℃预变性15min；95℃变性15s，55℃退火30s，70℃延伸30s，共45个循环；4℃降温30s；
步骤3：分析荧光PCR仪的检测数据，并以达到预设阈值时所需的循环次数Ct值对检测结果进行判断。
优选的是，其中，所述荧光PCR仪的检测通道包括：
检测IAC-Probe的荧光信号的第一通道，用于监控整个多重PCR反应体系；检测lt-probe、sth-probe、stp-probe荧光信号的第二通道，用于检测ETEC；检测bfpB-probe、eae-probe、escV-probe、stx1-1Probe、stx1-2Probe、stx2-1Probe、stx2-2Probe的荧光信号的第三通道，用于检测EPEC和EHEC；检测aggR-probe、astA-probe和pic-probe的荧光基团的第四通道，用于检测EAEC；检测invE-probe和ipaH-probe的荧光信号的第五通道，用于检测EIEC。
本发明的还有一目的是提供一种利用所述试剂盒或方法在检测致泻大肠埃希氏菌中的应用，其中所述致泻大肠埃希氏菌包括肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道出血性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌和肠道集聚性大肠埃希氏菌。
本发明至少包括以下有益效果：
(1)检测覆盖全面，对国标中所有的致泻大肠埃希氏菌的致病基因或特征性基因全部检测，防止漏检，并且可在3个小时内快速获得检测结果，节省成本。
(2)预防假阴性结果。本申请文件通过在反应体系中加入了阳性内对照，可以有效预防假阴性结果。
(3)利用荧光定量PCR方法检测特异性好，灵敏度高，操作简便，结果易于判读。
(4)应用广泛。本方法可用于对于食品等的致泻大肠埃希氏菌的检测，以防止食品污染，避免由此引起的腹泻，还可以应用于临床样本的检测研究。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的一个实施例中十四重qPCR检测致泻大肠埃希氏菌的结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
根据本发明的一种实现形式，一种多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的试剂盒包括：可特异性扩增致泻大肠埃希氏菌基因的引物探针组，其中所述引物探针组包括：
可特异性扩增肠道致病性大肠埃希氏菌或肠道出血性大肠埃希氏菌的eae基因的引物探针组；
可特异性扩增肠道致病性大肠埃希氏菌或肠道出血性大肠埃希氏菌的escV基因的引物探针组；
可特异性扩增肠道致病性大肠埃希氏菌的bfpB基因的引物探针组；
可特异性扩增肠道出血性大肠埃希氏菌的stx1或stx2基因的引物探针组；
可特异性扩增产肠毒素大肠埃希氏菌的lt、sth或stp基因的引物探针组；
可特异性扩增肠道集聚性大肠埃希氏菌的aggR、astA或pic基因的引物探针组；
可特异性扩增肠道侵袭性大肠埃希氏菌的invE或ipaH基因的物探针组。
在这种技术方案中，通过检测常见致泻大肠埃希氏菌的13个致病基因或种属特异性基因，包括EPEC的bfpB、eae和escV基因；EHEC的stx1、stx2、eae和escV基因；ETEC的lt、sth和stp基因；EAEC的aggR、astA和pic基因以及EIEC的invE和ipaH基因，可实现对致泻大肠埃希氏菌中的所有特征性基因的检测，结果准确率高。
在另一实例中，
试剂盒还包括内质控IAC(Internal amplification control)，作为监测整个多重反应体系，避免由于样品中存在抑制剂、仪器故障、Taq酶的活性低、操作水平差等问题引起的假阴性结果。
其中所述内质控的引物探针组为：
IAC-F：5’-TCCAGGGCGAAAGTAAACGT-3’；和
IAC-R：5’-GGCGAGCCGTACGAACAC-3’；和
IAC-Probe：5’-CCCAGTTGGCTGATCACTTTCG-3’。
并且，这种方式只是一种较佳实例的说明，但并不局限于此。在实施本发明时，可以根据使用者的需求添加不同的质控因子，以达到对PCR扩增反应进行监控的作用。
在另一实例中，与EPEC的bfpB、eae和escV基因；EHEC的stx1、stx2、eae和escV基因；ETEC的lt、sth和stp基因；EAEC的aggR、astA和pic基因以及EIEC的invE和ipaH基因所有能用到的引物探针组如下表所示：
表1致泻大肠埃希氏菌各特异性基因的可选择的扩增引物探针组
并且，上述引物和探针均不存在严重的发卡结构及二聚体结构。
上述实例中，SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO29、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.39、SEQ IDNO.44、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.61的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团。其中连接至探针5’端的荧光基团可发出荧光信号，连接至探针3’端的淬灭基团可以抑制荧光基团发出的荧光信号。在实时荧光定量PCR反应过程中，淬灭基团与荧光基团相互分离，荧光基团可以发出荧光信号，通过检测荧光信号的积累可以对未知模板进行定量分析。并且，这种方式只是一种较佳实例的说明，但并不局限于此。在实施本发明时，可以根据使用者的需求实施探针的不同态样。
在另一实例中，所述荧光基团选自FAM、JOE、NED、ROX、CY3、CY5、VIC和TAMRA中的任意一种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2和NFQ-MGB中的任意一种。并且，这种方式只是一种较佳实例的说明，但并不局限于此。在实施本发明时，可以根据使用者的需求选择不同的荧光基团。
在另一实例中，本申请文件致泻大肠埃希氏菌检测试剂盒的反应体系包括去离子水、PCR缓冲液、Taq酶、4种dNTP混合液、MgCl2、引物探针组合。其中，所述Taq酶浓度为0.03-0.1U/μL，优选为0.05U/μL；所述四种dNTP混合液的浓度为0.1～0.4mmol/L，优选为0.2mmol/L；PCR反应工作液中MgCl2的工作浓度为2～6mmol/L，优选为3mmol/L；每个引物对的浓度为0.1～1μmol/L，每条探针的浓度范围为0.01～0.1μmol/L。
在另一实例中，一种应用所述试剂盒快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的方法的方法包括如下步骤：
步骤1：提取待测样品的基因组，其中，样品类型不限，只要能对其中的核酸进行提取即可进行检测。提取核酸可以采用煮沸法使菌体破裂而获得DNA，也可利用商业试剂盒进行提取。
步骤2：在荧光PCR仪上，采用本申请文件所述试剂盒对所述基因组进行荧光定量PCR扩增反应；
在本实例中，PCR反应体系为25μL，其中PCR反应配方20μL，模板(即待检测样品)为5μL，对于其他体积的PCR反应体系，可对模板加入量进行等比例调节。
在本实例中，PCR扩增反应步骤如下：
95℃预变性15min；95℃变性15s，55℃退火30s，70℃延伸30s，共45个循环；4℃降温30s；
步骤3：对荧光定量PCR反应体系的荧光强度进行测量分析，以达到设定的阈值时所需的循环次数Ct值作为结果判断的标准。
在另一实例中，所述荧光PCR仪的检测通道包括：
检测IAC-Probe的荧光信号的第一通道，用于监控整个多重PCR反应体系；检测lt-probe、sth-probe、stp-probe荧光信号的第二通道，用于检测ETEC；检测bfpB-probe、eae-probe、escV-probe、stx1-1Probe、stx1-2Probe、stx2-1Probe、stx2-2Probe的荧光信号的第三通道，用于检测EPEC和EHEC；检测aggR-probe、astA-probe和pic-probe的荧光基团的第四通道，用于检测EAEC；检测invE-probe和ipaH-probe的荧光信号的第五通道，用于检测EIEC。
在本实例中，将所有针对这五种致泻大肠埃希氏菌的特征性基因的引物探针放到一管PCR中，就可以做到对任意一种致泻大肠埃希氏菌的检测。具体的，首先判断第一通道中IAC-Probe是否有荧光信号，若有，则其余四个通道中，无论哪一个有足够荧光信号，就可以认为样本中含有致泻大肠埃希氏菌，并能判断其种类。若第一通道中IAC-Probe无荧光信号，则判定检测结果为假阴性。此外，如果需要更加详细的信息，比如携带哪个致病基因及拷贝数等，我们也可以相应调整PCR反应体系，分成多管进行检测，即可获得想要信息。
下面提供一种利用所述试剂盒或方法在检测致泻大肠埃希氏菌中的应用实例。然而，它不被认为是限制性的。
在本实例中，为了精确评价改方法的性能，我们将致泻大肠埃希氏菌相关基因稀释至10000个拷贝/PCR反应进行实验。
本实例选择的引物对信息如下表：
表2致泻大肠埃希氏菌各特异性基因的扩增引物探针组
对本实例荧光定量PCR反应体系的荧光强度进行测量分析，以达到预设阈值时所需的循环次数Ct值作为结果判断的标准。参照图1，本实例可实现对五种致泻大肠埃希氏菌的分型检测。并且，本实例对五种致泻大肠埃希氏菌的快速分型检测耗时不到3h，且其中需要手工操作的时间低于30min，检测效率高。
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌试剂盒和方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
如上所述，根据本发明，提供了一种十四重qPCR检测五种致泻大肠埃希氏菌的检测试剂盒和检测方法，可快速、简便、灵敏、特异的应用于致泻大肠埃希氏菌的检测。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
发明名称：多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的方法、试剂盒及其应用；
SEQ ID No.1（stp-1F）:5'-CTTTCCCCTCTTTTAGTCAGTCAACT-3'；
SEQ ID No.2（stp-R）：5'-GCAGTAAAATGTGTTGTTCATATTTTCTG-3'；
SEQ ID No.3（stp-probe）：5'-TGACTCTTCAAAAGAGAAAA-3'；
SEQ ID No.4（stp-2F）：5'-GGGAGGTAACATGAAAAAGCTAATGT-3'；
SEQ ID No.5（sth-1F）：5'-CCGGAGGTAATATGAAGAAATCAATAT-3'；
SEQ ID No.6（sth-1R）：5'-GCTTTCAGGACCACTTTTATTACTTTTT-3'；
SEQ ID No.7（sth-probe）：5'-TGTCTTTTTCACCTTTCGCTCAGGATGC-3'；
SEQ ID No.8（sth-2F）：5'-AATGCCATGTTCCGGAGGTA-3'；
SEQ ID No.9（sth-2R）：5'-CTACTATTCATGCTTTCAGGACCACTT-3'；
SEQ ID No.10（lt-1F）：5'-TGTTATAGCGACAGCACCAAATATG-3'；
SEQ ID No.11（lt-1R）：5'-TGGTATTCCACCTAACGCAGAA-3'；
SEQ ID No.12（lt-probe）：5'-AGGCGTATACAGCCCTCACCCATATGA-3'；
SEQ ID No.13（lt-2F）：5'-GCTTTGTCAGATATGATGACGGATAT-3'；
SEQ ID No.14（lt-2R）：5'-ACACGATACCATCCATATATCTGAGAATA-3'；
SEQ ID No.15（stx1-1F）：5'-CATTCGTTGACTACTTCTTATCTGGATT-3'；
SEQ ID No.16（stx1-1R）：5'-GCTGTCACAGTAACAAACCGTAACA-3'；
SEQ ID No.17（stx1-1Probe）：5'-AACCTCACTGACGCAGTCTGTGGCAA-3'；
SEQ ID No.18（stx1-2F）：5'-GCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAG-3'；
SEQ ID No.19（stx1-2R）：5'-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3'；
SEQ ID No.20（stx1-2Probe）：5'-CCATGATAGTCAGGCAGGACACTACTCAACC-3'；
SEQ ID No.21（stx2-1F）：5'-GGACCACATCGGTGTCTGTTATT-3'；
SEQ ID No.22（stx2-1R）：5'-CGCGCCTGATAGACATCAAG-3'；
SEQ ID No.23（stx2-1Probe）：5'-CCCGCCGGGCAGTTATTTTGC-3'；
SEQ ID No.24（stx2-2F）：5'-AGCAGTTATACCACTCTGCAACGT-3'；
SEQ ID No.25（stx2-2R）：5'-AACGCCAGATATGATGAAACCA-3'；
SEQ ID No.26（stx2-2Probe）：5'-AACGTTCCGGAATGCAAATCAGTCGTC-3'；
SEQ ID No.27（escV-1F）：5'-CGCGCAGGCGTTATTGA-3'；
SEQ ID No.28（escV-1R）：5'-TTCATCGCCCCGTCCAT-3'；
SEQ ID No.29（escV-probe）：5'-CCGCTTGAGGCAAAAGTTCTTCGC-3'；
SEQ ID No.30（escV-2F）：5'-GTGCTCGTTTTTCCCTTGATG-3'；
SEQ ID No.31（escV-2R）：5'-CCCCGTCCATTGAACCATAA-3'；
SEQ ID No.32（eae-1F）：5'-TGGTACGGGTAATGAAAATGATCTC-3'；
SEQ ID No.33（eae-1R）：5'-CGTAACGGCTGCCTGATAATG-3'；
SEQ ID No.34（eae-probe）：5'-AAACCGTGGTCTCAGCAAATTGAGCCA-3'；
SEQ ID No.35（eae-2F）：5'-AATGCAGTTCCGTTATCAGTTTGA-3'；
SEQ ID No.36（eae-2R）：5'-GGCTGCCTGATAATGTTCTTAACTC-3'；
SEQ ID No.37（bfpB-1F）：5'-CTTGCTCGGGTAATGGATTTTATAA-3'；
SEQ ID No.38（bfpB-1R）：5'-GTTTTGCTTACCATATCACTGCTTTT-3'；
SEQ ID No.39（bfpB-probe）：5'-ATATTCTGCATGCTGACACCTCATTGCTGA-3'；
SEQ ID No.40（bfpB-2F）：5'-GGCAGGTATTCACTTTTCTTATTGTG-3'；
SEQ ID No.41（bfpB-2R）：5'-CCCAGAGGTGTACTTGATCTCAGA-3'；
SEQ ID No.42（aggR-1F）：5'-CAGCGATACATTAAGACGCCTAAAG-3'；
SEQ ID No.43（aggR-1R）：5'-CGTCAGCATCAGCTACAATTATTCC-3'；
SEQ ID No.44（aggR-probe）：5'-AGTTGTCCGAATTGGTC-3'；
SEQ ID No.45（pic-1F）：5'-CAGTGAACCGACGATTGGAA-3'；
SEQ ID No.46（pic-1R）：5'-GGTCTGGCTGTTGAGTATCATG-3'；
SEQ ID No.47（pic-probe）：5'-CCTTTGGTGGTACCGGCACTCCA-3'；
SEQ ID No.48（pic-2F）：5'-GGCTCAGGATACAAATGTCAGTGA-3'；
SEQ ID No.49（pic-2R）：5'-CCATAGCTGGCAGATTTCAGAATA-3'；
SEQ ID No.50（astA-F）：5'-ATGTGCTGACTGAACTGAAAAACC-3'；
SEQ ID No.51（astA-1R）：5'-TTCAGGTCGCGAGTGACG-3'；
SEQ ID No.52（astA-probe）：5'-TCTGAACGATATCCTCATCGCCTGTGTG-3'；
SEQ ID No.53（astA-2R）：5'-TTGTAGTCCTTCCATGACACG-3'；
SEQ ID No.54（invE-1F）：5'-AGAATCTGTCTCGCGCGAAA-3'；
SEQ ID No.55（invE-1R）：5'-TCTGACGCGATTGGAAATAGAG-3'；
SEQ ID No.56（invE-probe）：5'-CCTTTCAGGCAGCAAGCGTTCCA-3'；
SEQ ID No.57（invE-2F）：5'-GACATAGCCAAAAAAGAGAATCTGTCT-3'；
SEQ ID No.58（invE-2R）：5'-TCATTAAAGTTAAGTTCTGACGCGATT-3'；
SEQ ID No.59（ipaH-1F）：5'-CGTGAACAGGTCGCTGCAT-3'；
SEQ ID No.60（ipaH-1R）：5'-TGGACCAGGAGGGTTTTCC-3'；
SEQ ID No.61（ipaH-probe）：5'-ACCGTGTCGCGCTCACATGGA-3'；
SEQ ID No.62（ipaH-2F）：5'-CGCAATACCTCCGGATTCC-3'；
SEQ ID No.63（ipaH-2R）：5'-AAAGGCCTTCTGATGCCTGAT-3'；
SEQ ID No.64（IAC-F）：5'-TCCAGGGCGAAAGTAAACGT-3’-3'；
SEQ ID No.65（IAC-R）：5'-GGCGAGCCGTACGAACAC-3’-3'；
SEQ ID No.66（IAC-Probe）：5'-CCCAGTTGGCTGATCACTTTCG-3’。

Claims (10)

1.一种多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的试剂盒，其特征在于，包括：可特异性扩增致泻大肠埃希氏菌基因的引物探针组，其中所述引物探针组包括：
可特异性扩增肠道致病性大肠埃希氏菌或肠道出血性大肠埃希氏菌的eae基因的引物探针组；
可特异性扩增肠道致病性大肠埃希氏菌或肠道出血性大肠埃希氏菌的escV基因的引物探针组；
可特异性扩增肠道致病性大肠埃希氏菌的bfpB基因的引物探针组；
可特异性扩增肠道出血性大肠埃希氏菌的stx1或stx2基因的引物探针组；
可特异性扩增产肠毒素大肠埃希氏菌的lt、sth或stp基因的引物探针组；
可特异性扩增肠道集聚性大肠埃希氏菌的aggR、astA或pic基因的引物探针组；
可特异性扩增肠道侵袭性大肠埃希氏菌的invE或ipaH基因的物探针组。
2.如权利要求1所述的多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的试剂盒，其特征在于，还包括内质控IAC，其中所述内质控的引物探针组为：
IAC-F：5’-TCCAGGGCGAAAGTAAACGT-3’；和
IAC-R：5’-GGCGAGCCGTACGAACAC-3’；和
IAC-Probe：5’-CCCAGTTGGCTGATCACTTTCG-3’。
3.如权利要求1所述的多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的试剂盒，其特征在于，
可特异性扩增肠道致病性大肠埃希氏菌或肠道出血性大肠埃希氏菌的eae基因的引物探针组为：
第一eae基因引物探针组，其包括：
eae-1F：5’-TGGTACGGGTAATGAAAATGATCTC-3’；和
eae-1R：5’-CGTAACGGCTGCCTGATAATG-3’；和
eae-probe：5’-AAACCGTGGTCTCAGCAAATTGAGCCA-3’；
或，第二eae基因引物探针组，其包括：
eae-2F：5’-AATGCAGTTCCGTTATCAGTTTGA-3’；和
eae-2R：5’-GGCTGCCTGATAATGTTCTTAACTC-3’；和
eae-probe：5’-AAACCGTGGTCTCAGCAAATTGAGCCA-3’；
可特异性扩增肠道致病性大肠埃希氏菌或肠道出血性大肠埃希氏菌的escV基因的引物探针组为：
第一escV基因引物探针组，其包括：
escV-1F：5’-CGCGCAGGCGTTATTGA-3’；和
escV-1R：5’-TTCATCGCCCCGTCCAT-3’；和
escV-probe：5’-CCGCTTGAGGCAAAAGTTCTTCGC-3’；
或，第二escV基因引物探针组，其包括：
escV-2F：5’-GTGCTCGTTTTTCCCTTGATG-3’；和
escV-2R：5’-CCCCGTCCATTGAACCATAA-3’；和
escV-probe：5’-CCGCTTGAGGCAAAAGTTCTTCGC-3’；
可特异性扩增肠道致病性大肠埃希氏菌的bfpb基因的引物探针组为：
第一bfpB基因引物探针组，其包括：
bfpB-1F：5’-CTTGCTCGGGTAATGGATTTTATAA-3’；和
bfpB-1R：5’-GTTTTGCTTACCATATCACTGCTTTT-3’；和
bfpB-probe：5’-ATATTCTGCATGCTGACACCTCATTGCTGA-3’；
或，第二bfpB基因引物探针组，其包括：
bfpB-2F：5’-GGCAGGTATTCACTTTTCTTATTGTG-3’；和
bfpB-2R：5’-CCCAGAGGTGTACTTGATCTCAGA-3’；和
bfpB-probe：5’-ATATTCTGCATGCTGACACCTCATTGCTGA-3’；
可特异性扩增肠道出血性大肠埃希氏菌的stx1基因的引物探针组为：
第一stx1基因引物探针组，其包括：
stx1-1F：5’-CATTCGTTGACTACTTCTTATCTGGATT-3’；和
stx1-1R：5’-GCTGTCACAGTAACAAACCGTAACA-3’；和
stx1-1Probe：5’-AACCTCACTGACGCAGTCTGTGGCAA-3’；
或，第二stx1基因引物探针组，其包括：
stx1-2F：5’-GCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAG-3’；和
stx1-2R：5’-AGAAATTCTTCCTACACGAACAGAGTC-3’；和
stx1-2Probe：5’-CCATGATAGTCAGGCAGGACACTACTCAACC-3’；
可特异性扩增肠道出血性大肠埃希氏菌的stx2基因的引物探针组为：
第一stx2基因引物探针组，其包括：
stx2-1F：5’-GGACCACATCGGTGTCTGTTATT-3’；和
stx2-1R：5’-CGCGCCTGATAGACATCAAG-3’；和
stx2-1Probe：5’-CCCGCCGGGCAGTTATTTTGC-3’；
或，第二stx2基因引物探针组，其包括：
stx2-2F：5’-AGCAGTTATACCACTCTGCAACGT-3’；和
stx2-2R：5’-AACGCCAGATATGATGAAACCA-3’；和
stx2-2Probe：5’-AACGTTCCGGAATGCAAATCAGTCGTC-3’；
可特异性扩增产肠毒素大肠埃希氏菌的lt基因的引物探针组为：
第一lt基因引物探针组，其包括：
lt-1F：5’-TGTTATAGCGACAGCACCAAATATG-3’；和
lt-1R：5’-TGGTATTCCACCTAACGCAGAA-3’；和
lt-probe：5’-AGGCGTATACAGCCCTCACCCATATGA-3’；
或，第二lt基因引物探针组，其包括：
lt-2F：5’-GCTTTGTCAGATATGATGACGGATAT-3’；和
lt-2R：5’-ACACGATACCATCCATATATCTGAGAATA-3’；和
lt-probe：5’-AGGCGTATACAGCCCTCACCCATATGA-3’；
可特异性扩增产肠毒素大肠埃希氏菌的sth基因的引物探针组为：
第一sth基因引物探针组，其包括：
sth-1F：5’-CCGGAGGTAATATGAAGAAATCAATAT-3’；和
sth-1R：5’-GCTTTCAGGACCACTTTTATTACTTTTT-3’；和
sth-probe：5’-TGTCTTTTTCACCTTTCGCTCAGGATGC-3’；
或，第二sth基因引物探针组，其包括：
sth-2F：5’-AATGCCATGTTCCGGAGGTA-3’；和
sth-2R：5’-CTACTATTCATGCTTTCAGGACCACTT-3’；和
sth-probe：5’-TGTCTTTTTCACCTTTCGCTCAGGATGC-3’；
可特异性扩增产肠毒素大肠埃希氏菌的stp基因的引物探针组为：
第一stp基因引物探针组，其包括：
stp-1F：5’-CTTTCCCCTCTTTTAGTCAGTCAACT-3’；和
stp-R：5’-GCAGTAAAATGTGTTGTTCATATTTTCTG-3’；和
stp-probe：5’-TGACTCTTCAAAAGAGAAAA-3’；
或，第二stp基因引物探针组，其包括：
stp-2F：5’-GGGAGGTAACATGAAAAAGCTAATGT-3’；和
stp-R：5’-GCAGTAAAATGTGTTGTTCATATTTTCTG-3’；和
stp-probe：5’-TGACTCTTCAAAAGAGAAAA-3’；
可特异性扩增肠道集聚性大肠埃希氏菌的aggR基因的引物探针组为：
aggR-1F：5’-CAGCGATACATTAAGACGCCTAAAG-3’；和
aggR-1R：5’-CGTCAGCATCAGCTACAATTATTCC-3’；和
aggR-probe：5’-AGTTGTCCGAATTGGTC-3’；
可特异性扩增肠道集聚性大肠埃希氏菌的astA基因的引物探针组为：
第一astA基因引物探针组，其包括：
astA-F：5’-ATGTGCTGACTGAACTGAAAAACC-3’；和
astA-1R：5’-TTCAGGTCGCGAGTGACG-3’；和
astA-probe：5’-TCTGAACGATATCCTCATCGCCTGTGTG-3’；
或，第二astA基因引物探针组，其包括：
astA-F：5’-ATGTGCTGACTGAACTGAAAAACC-3’；和
astA-2R：5’-TTGTAGTCCTTCCATGACACG-3’；和
astA-probe：5’-TCTGAACGATATCCTCATCGCCTGTGTG-3’；
可特异性扩增肠道集聚性大肠埃希氏菌的pic基因的引物探针组为：
第一pic基因引物探针组，其包括：
pic-1F：5’-CAGTGAACCGACGATTGGAA-3’；和
pic-1R：5’-GGTCTGGCTGTTGAGTATCATG-3’；和
pic-probe：5’-CCTTTGGTGGTACCGGCACTCCA-3’；
或，第二pic基因引物探针组，其包括：
pic-2F：5’-GGCTCAGGATACAAATGTCAGTGA-3’；和
pic-2R：5’-CCATAGCTGGCAGATTTCAGAATA-3’；和
pic-probe：5’-CCTTTGGTGGTACCGGCACTCCA-3’；
可特异性扩增肠道侵袭性大肠埃希氏菌的invE基因的物探针组为：
第一invE基因引物探针组，其包括：
invE-1F：5’-AGAATCTGTCTCGCGCGAAA-3’；和
invE-1R：5’-TCTGACGCGATTGGAAATAGAG-3’；和
invE-probe：5’-CCTTTCAGGCAGCAAGCGTTCCA-3’；
或，第二invE基因引物探针组，其包括：
invE-2F：5’-GACATAGCCAAAAAAGAGAATCTGTCT-3’；和
invE-2R：5’-TCATTAAAGTTAAGTTCTGACGCGATT-3’；和
invE-probe：5’-CCTTTCAGGCAGCAAGCGTTCCA-3’；
可特异性扩增肠道侵袭性大肠埃希氏菌的ipaH基因的物探针组为：
第一ipaH基因引物探针组，其包括：
ipaH-1F：5’-CGTGAACAGGTCGCTGCAT-3’；和
ipaH-1R：5’-TGGACCAGGAGGGTTTTCC-3’；和
ipaH-probe：5’-ACCGTGTCGCGCTCACATGGA-3’；
或，第二ipaH基因引物探针组，其包括：
ipaH-2F：5’-CGCAATACCTCCGGATTCC-3’；和
ipaH-2R：5’-AAAGGCCTTCTGATGCCTGAT-3’；和
ipaH-probe：5’-ACCGTGTCGCGCTCACATGGA-3’。
4.如权利要求3所述的多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的试剂盒，其特征在于，所述eae-probe、escV-probe、bfpB-probe、stx1-1Probe、stx1-2Probe、stx2-1Probe、stx2-2Probe、lt-probe、sth-probe、stp-probe、aggR-probe、astA-probe、pic-probe、invE-probe、ipaH-probe的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团。
5.如权利要求4所述的多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、JOE、NED、ROX、CY3、CY5、VIC和TAMRA中的任意一种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2和NFQ-MGB中的任意一种。
6.如权利要求2所述的多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的试剂盒，其特征在于，还包括PCR缓冲液、Taq酶、四种dNTP混合液和MgCl2；
其中，所述Taq酶浓度为0.03-0.1U/μL，所述四种dNTP混合液的浓度为0.1～0.4mmol/L，在PCR反应工作液中MgCl2的浓度为2～6mmol/L；
所述引物探针组中每个引物对的浓度为0.1～1μmol/L，每条探针的浓度范围为0.01～0.1μmol/L。
7.如权利要求6所述的多重qPCR快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的试剂盒，其特征在于，
所述Taq酶的浓度为0.05U/μL；所述四种dNTP混合液的浓度为0.2mmol/L，在PCR反应工作液中MgCl2的浓度为为3mmol/L。
8.一种应用权利要求2～7的试剂盒快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：提取待测样品的基因组；
步骤2：在荧光PCR仪上，采用试剂盒对所述基因组进行荧光定量PCR扩增反应；
PCR扩增反应步骤如下：
95℃预变性15min；95℃变性15s，55℃退火30s，70℃延伸30s，共45个循环；4℃降温30s；
步骤3：分析荧光PCR仪的检测数据，并以达到预设阈值时所需的循环次数Ct值对检测结果进行判断。
9.如权利要求8所述的快速检测五种致泻大肠埃希氏菌的方法，其特征在于，所述荧光PCR仪的检测通道包括：
检测IAC-Probe的荧光信号的第一通道；检测lt-probe、sth-probe、stp-probe荧光信号的第二通道；检测bfpB-probe、eae-probe、escV-probe、stx1-1Probe、stx1-2Probe、stx2-1Probe、stx2-2Probe的荧光信号的第三通道，用于检测EPEC和EHEC；检测aggR-probe、astA-probe和pic-probe的荧光基团的第四通道；检测invE-probe和ipaH-probe的荧光信号的第五通道。
10.一种利用权利要求1～9任一项所述试剂盒或方法在检测致泻大肠埃希氏菌中的应用，其中所述致泻大肠埃希氏菌包括肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道出血性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠道集聚性大肠埃希氏菌和肠道侵袭性大肠埃希氏菌。
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