CN103898208A - 一种快速高通量的肠源致病菌检测方法 - Google Patents

一种快速高通量的肠源致病菌检测方法 Download PDF

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张子龙
张晓航
李深伟
王俐
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明涉及一种快速、灵敏、高通量的肠源致病菌检测方法。本发明的检测方法整合了聚合酶链式反应PCR和微阵列这两种强大的分子生物学技术，把PCR杂交的探针直接固定在微阵列中的杂交舱中，与PCR反应室在同一张芯片上；检测方法包括：标本进行增菌处理，DNA液提取，PCR扩增，杂交，清洗，结果判读。本发明能对副溶血弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌基因进行快速高通量的检测，通过本发明可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止主要食品安全事故的发生。

Description

一种快速高通量的肠源致病菌检测方法
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种肠源致病菌快速、高通量的检测方法。
背景技术
食源性致病菌引起的感染性腹泻是世界范围内发病率和死亡率仅次于心血管疾病的第二大疾病。以20世纪90年代后我国法定报告传染病的发病数来看，肠道传染病发病率一直名列前茅。霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、痢疾杆菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、弯曲杆菌、产气荚膜梭菌、阪崎菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、出血性大肠杆菌O157和.诺如病毒I、诺如病毒II、轮状病毒A、轮状病毒B、轮状病毒C等十八种病原体是引起食源性感染的重要病原体，常常在特定范围内引起大规模暴发流行。
入出境食品安全是国际关心的重大问题，由上述致病菌引起的食物中毒事件不仅直接影响口岸卫生安全，而且影响着我国的进出口贸易。研究表明:在加工环境中存在的某种微生物能有70％的机会进入到食品。而由于食品产品中致病菌出现的几率低，样品中致病菌的数量少，致病菌的分布不均匀，可能出现样本本底干扰，法规要求的检测限很低（1cFu/25g或更低）等限制因素，导致食源性致病菌的检测难度较大。
食源致病菌的检测方法主要有常规检验方法、生物学方法和分子生物学方法等几大类，但常规检验方法（直接镜检和细菌分离培养）和生物学方法（各种实验动物模型和细胞方法）均存在检测时间长，操作流程多，技术要求高，通量小等缺点，不适合用于广泛应用。
以PCR技术为代表的分子生物学手段是现在广泛应用于致病微生物快速检测的技术。而由PCR技术发展起来的实时荧光PCR技术以及基因芯片技术等是目前在肠道致病菌检测中使用最广泛的分子生物学方法。实时荧光PCR技术是一种新的PCR方法，是在常规PCR反应的基础上增加了能与扩增模板特异性结合的探针，与传统PCR相比，该方法无需对PCR产物进行再处理，完全是在封闭状态下完成检测的全过程，具有实时、准确、快速等特点，但是由于对设备要求较高，对工作人员的操作技术难度大，同时每次只能检测少量致病菌，所以不适合快速，高通量的检测。
基因芯片是20世纪90年代发展起来的全新的微量分析技术，它采用微加工和微电子技术将大量的人工设计好的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上而得到的一种信息检测芯片。基因芯片可以同时固定大量的探针分子，理论上可以在一次实验中检出所有潜在的致病原，也可以用同一张芯片检测某一致病原的各种遗传学指标，这为平行检测多个菌种或同菌种内多个菌株提供了一条便捷的途径；同时检测的灵敏度、特异性和快速便捷性也很高，因而在致病原分析检测中有很好的发展前景。
高通量基因芯片技术利用待检测微生物的基因组序列设计针对各种微生物的特异探针，将该探针（寡核苷酸）点样于芯片表面，同时在探针两侧设计PCR引物，在引物合成过程中对其5’端进行荧光标记或在PCR过程中加入荧光标记的dNTP，这样利用PCR扩增的方法即可得到标记有荧光染料的待检测微生物靶标，然后用含有待检测样品特异探针的微阵列芯片与标记的靶标杂交，荧光标记的DNA分子与芯片上相匹配的DNA序列发生杂交反应，使得芯片上的点呈现出荧光信号，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。
当前用于致病菌检测的基因芯片检测已经有些应用于研究，但是这些基因芯片的探针点样多采用手工模式，操作复杂，并且增加了很多假阳性的机会。
本发明整合了聚合酶链式反应（PCR）和微阵列这两种强大的分子生物学技术，把PCR杂交的探针直接固定在微阵列中的杂交舱中，与PCR反应室在同一张芯片上。PCR反应结束后可以直接加入杂交液进行杂交，操作简单，节省时间，另外灵敏度可以达到几百个Copy的DNA分子。不同菌之间的多重PCR引物之间不会差生交叉反应。
本发明的检测方法可广泛运用于副溶血弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌基因快速高通量的检测，作为血清学试验及细菌分离培养法的可靠补充，提高检测的准确性和时效性，可大大地降低检测的周期。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、高通量的肠源致病菌检测方法，本发明能对副溶血弧菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌基因进行快速高通量的检测，通过本发明可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止主要食品安全事故的发生。
本发明针对志贺氏菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌各自特有基因，设计引物，在引物扩增区内设计能够区别其他菌株的特异性探针，通过探针特异性验证、探针灵敏度实验、方法特异性实验等证明该方法可以特异性多种肠源性致病菌，与常规PCR方法比较，检测灵敏度明显高于常规方法多重PCR扩增产物的检测最低检出限为1-10CFU/ml，不仅可以满足日常食品安全检测的要求，甚至可以满足临床样品的检测要求。
本发明所提供的快速、灵敏、高通量的肠源致病菌检测方法，包括如下步骤：
（1）标本进行增菌处理；
（2）DNA液提取；
（3）PCR扩增：
a.PCR反应体系包括：PCR反应缓冲液,待测菌基因特异性正、反向引物，PCRGradeH2O,PCRControl,DNA提取液；
b.将PCR反应液加入已含有待测菌基因特异性探针的芯片内，将芯片放入反应室内进行扩增反应；
（4）杂交：PCR扩增完后，将杂交反应液加入芯片，使杂交液和扩增液都进入到杂交舱内杂交反应；
（5）清洗：杂交后的芯片用洗液冲洗，直接用荧光扫描仪检测；
（6）结果判读。
步骤（2）中所述的DNA提取可使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA。取1.5mL增菌液，12000rpm离心2min，弃去上清液，重悬沉淀，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取DNA；
步骤（3）中所述的PCR反应体系为：2XMatermix6.25ul,PrimerA/B1ul，PCRGradeH2O0.75ul,PCRControl2ul,Sample2.5ul；所述的PCR扩增的反应条件是：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，8个循环，每个循环退火温度降低1℃。8个循环完成后94℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸1min，30个循环；72℃，8min。
步骤（3）中所述的待测菌基因为志贺氏菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌各自特有基因，分别是副溶血弧菌的gyrB、toxR、tl、Vp-23s基因，单增李斯特菌的16s、HlyA基因，沙门氏菌的invA、FimY、muts、TTr，金黄色葡萄球菌的nuc基因，志贺氏菌的gtrBI、gtrI、proA、Oac、gtrV、gtrX；对细菌的几个特有基因同时设计引物和探针可提高细菌检出的特异性。所述的特异性探针是根据特异性引物扩增区内设计能够区别其他菌株的，特异性引物和探针为：
副溶血弧菌
gyrB基因
VP1-F:CGGCGTGGGTGTTTCGGTAG    （SEQ ID NO1）
VP1-R:TCCGCTTCGCGCTCATCAAT     （SEQ ID NO2）
Probe:TTCTCACCCATCGCCCATTCAACCG  （SEQ ID NO3）
或
toxR基因
Vp2-F:GTCTTCTGACGCAATCGTTG    （SEQ ID NO4）
Vp2-R:ATACGAGTGGTTGCTGTCATG     （SEQ ID NO5）
Probe：CGGCAAATCGGTAGTAATAGTGCCG  （SEQ ID NO6）
单增李斯特菌
16s
Lm1-F：CGACACCAGCTGACGACA     （SEQ ID NO7）
Lm1-R：GGCCTAACACATGCAAGT       （SEQ ID NO8）
Probe：GTTTCGGCTATCGCTTACAGATGGC （SEQ ID NO9）
或
HlyA基因
Lm2-F：CGGAGGTTCCGCAAAAGATG   （SEQ ID NO10）
Lm2-R：AACATCGATCACTCTGGAGG    （SEQ ID NO11）
Probe：AAATCATCGACCGGCAACCTC    （SEQ ID NO12）
沙门氏菌
invA基因
Sa1-F：CGTTCTACATTGACAGAAT    （SEQ ID NO13）
Sa1-R：CGAACGTGGCGATAATTTC     （SEQ ID NO14）
Probe：CAACGTTTCCTGCGGTACTGTTAAT （SEQ ID NO15）
或
FimY基因
Sa2-F：TCGTCATTCCATTACCTACC    （SEQ ID NO16）
Sa2-R：AAACGTTGAAAAACTGAGGA     （SEQ ID NO17）
Probe：TCTGGTTATTTCCTGATCGCA     （SEQ ID NO18）
金黄色葡萄球菌
nuc基因
Sta1-F:TAAAGCGATTGATGGTGATACG    （SEQ ID NO19）
Sta1-R:AGCCAAGCCTTGACGAACTA       （SEQ ID NO20）
Probe：TAAAGCGATTGATGGTGA          （SEQ ID NO21）
或
Sta2-F:ATTACTTATAGGGATGGC        （SEQ ID NO22）
Sta2-R:AACCACTTCTATTTACGC         （SEQ ID NO23）
Probe：GAAAGGGCAATACGCAAAG         （SEQ ID NO24）
志贺氏菌
gtrBI基因
Shi1-F:AATCTGGCACTGGAAGGT      （SEQ ID NO25）
Shi1-R:TTGATACAAGCAGGGAGG       （SEQ ID NO26）
Probe：TATAGGCTTGTTTGTTGC        （SEQ ID NO27）
gtrI基因
Shi2-F:GTTACCTGTTTCGCACTG      （SEQ ID NO28）
Shi2-R:CGTACCCATAATGGAGAT       （SEQ ID NO29）
Probe：ACATCAACAAAAGCAAAG        （SEQ ID NO30）
步骤（3）所述的PCR扩增与步骤（4）所述的杂交在芯片仪上完成。
本发明与现有检测方法相比，将DNA杂交检测的扩增过程和杂交检测过程浓缩到一张高通量芯片上检测，大大缩减了检测的时间和复杂性，检测设备简单易于携带。检测系统可以定量检测低达110copyDNA的致病菌，大大提高了当前的检测能力。本发明的芯片系统可以直接检测细菌的裂解液，其检测的灵敏性也可以达到104-105水平，这就意味着增菌的时间可以大大缩短到几个小时，而从样品到增菌以及检测总时间完全可以在8小时内完成，有益于快速准确的检测食源性致病菌。
附图说明
图1实施例1三种食源性致病菌高通量芯片检测特异性。
图2实施例1增菌裂解液的芯片测定结果。
图中A为五种菌（沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌、志贺氏菌）在104-105copies时的检测；B为5种菌添加到牛奶中增菌后的检测结果；C是阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1五种肠源性致病菌的检测的特异性与灵敏性
一、实验步骤
1.细菌的复苏
将福志贺菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌接种于营养肉汤培养基中，37℃培养12小时，划线接种于营养琼脂平板，37℃培养24h，挑取单个菌落37℃培养于LB培养基，培养18h。
2.标准菌株的鉴定
福志贺菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌标准菌株购自美国ATCC，金黄色葡萄球菌为实验室分离得到的阳性菌株。
采用梅里埃VITEK2全自动细菌鉴定仪对待检测的标准菌株同步测定：
将单菌落接到试管过夜培养后标准化地制备、稀释菌悬液后，将标准化的菌悬液置于载卡架槽内，并通过扫描条形码将标本编号输入电脑软件中。
将载卡架放入装载仓中。当卡片填充后，将载卡架转移到读卡器/孵育仓。所有后续步骤均通过仪器自动进行。
6-10小时后，读取结果。
3.基因组DNA的提取
使用细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，Qiagen公司)提取细菌DNA。取1.5mL增菌液，12000rpm离心2min，弃去上清液，重悬沉淀，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取DNA。
4.DNA浓度的测定
使用nanodrop2000C紫外分光仪测定所提取的DNA，并根据公式计算DNA拷贝数。
5.靶基因的扩增
5.1引物和探针的设计
针对志贺氏菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌各自特有基因，设计引物，在引物扩增区内设计能够区别其他菌株的特异性探针。除金黄色葡萄球菌，本实施例均针对每个细菌的两个特有基因设计了引物和探针，分别是：针对副溶血性弧菌的gyrB和toxR基因的特异性引物和探针SEQIDNO1-3和SEQIDNO4-6（序列副表），针对单增李斯特菌的16s和HlyA基因的特异性引物和探针SEQIDNO7-9和SEQIDNO10-12（序列副表），针对沙门氏菌的invA和FimY基因的特异性引物和探针SEQIDNO13-15和SEQIDNO16-18（序列副表），针对金黄色葡萄球菌的nuc基因的特异性引物和探针SEQIDNO19-21（序列副表），针对福志贺氏菌的gtrBI和gtrI基因的特异性引物和探针SEQIDNO25-27和SEQIDNO28-30(序列副表)。特异性探针点入芯片上。
5.2反应平台
在威特芯片仪上进行PCR扩增与杂交反应。为防止引物间的互相作用，分两个反应室进行PCR反应，两个反应室都可以联通到杂交室，PCR后的扩增液可以通过注射压力方式使其流入杂交室进行杂交反应。
PCR反应体系为：2XMatermix6.25ul,PrimerA/B1ul，PCRGradeH2O0.75ul,PCRControl2ul,Sample2.5ul.
反应条件相同：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，8个循环，每个循环退火温度降低1℃。8个循环完成后94℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸1min，30个循环；72℃，8min。
6.杂交反应
分别注入PCR反应室14.5ul杂交夜，使杂交夜和扩增液都进入到杂交舱内，反应30min。杂交后的芯片用washingbuffer3000rpm2min冲洗，直接用威特荧光扫描仪检测。
7.检测体系的灵敏度与特异性
DNA水平检测：将参比菌株的过夜培养物用生理盐水制备成菌悬液，通过麦氏比浊法建立标准曲线图1，判断菌的浓度。将离心后的菌体抽提DNA，并用Thermo公司的Nano-drop2000C测定DNA浓度。根据DNA浓度将各个菌的DNA稀释到大约10，100，1000copy/ul。取各个梯度DNA作为模板加入到芯片中进行检测。
混合菌DNA水平检测：将多种菌的DNA混合到一起，稀释到10，100，1000copy/ul的浓度，作为模板进行检测。
菌裂解液直接检测：将参比菌株的过夜培养物用生理盐水制备成菌悬液，通过麦氏比浊法建立标准曲线图1，测定菌的OD，计算菌的浓度（CFU/ml），根据测定的菌浓度，将菌液进行梯度稀释，并100℃裂解10min，取2.5ul进行PCR扩增杂交。
8.样品添加灵敏度的测定
取经高温灭菌的牛奶样品3份，每份5ml,每份分别同时接种1,10,100CFU/ml的5种菌悬液各1ml，同时以不接种病原菌的牛奶做阴性对照，加入90ml优化培养基中，30℃培养12h[7]。取2ml增菌液离心后加入生理盐水，100℃热裂解10min，进行高通量芯片测定。
二、结果
1.致病菌DNA提取
Qiagen公司的Protocal提取过夜培养的细菌DNA，结果如表1所示。通过表1，我们看到，样品抽提的DNA，260/280多在2.0左右，说明其中含有较多RNA，加入RNA酶进行处理后备用。
表1DNA抽提结果以及灵敏度测定
Figure BDA0000424057380000081
2.芯片的特异性
用从美国ATCC购买的参比菌株和实验室分离菌株共5株菌进行了杂交实验。其中三种单独的菌的杂交结果见图1。
图1显示，用不同的菌杂交，在芯片的相应位置会出现明显的阳性信号。同时，阳性对照位置出现明显的杂交信号，阴性对照处不出现杂交信号。这表明芯片的特异性良好，不会出现引物的假阳性现象。
3.芯片的灵敏性
测定DNA浓度，并根据DNA分子的大小，计算出具体能检测的copy数如表1所示，可以看到检测能力最好的为志贺氏菌，能检测到5.5X10-4ng，即112copy的DNA；对金黄色葡萄球菌的检测能力最弱，约为2.2X10-2ng,约7000copy的DNA。
根据提取DNA的经验，抽提的效率约10％，预测通过该芯片直接进行原位菌液扩增杂交为10倍的DNA数目，将沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌、志贺氏菌的增菌液稀释后，测定了其灵敏度,如图2A.在104-105水平上可以测到五种菌。
3.添加灵敏度试验：
对添加到牛奶中的菌进行检测，应用高通量芯片方法进行检测,结果见图2B.从图中可以看出,高通量芯片检测认为添加的五种混合菌的敏感性可以达到1cfu。
Figure IDA0000424057470000011
Figure IDA0000424057470000021
Figure IDA0000424057470000031
Figure IDA0000424057470000041

Claims (8)

1.一种快速高通量的肠源致病菌检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）标本进行增菌处理；
（2）DNA液提取；
（3）PCR扩增：
a.PCR反应体系包括：PCR反应缓冲液,待测菌基因特异性正、反向引物，PCRGradeH2O,PCRControl,DNA提取液；
b.将PCR反应液加入已含有待测菌基因特异性探针的芯片内，将芯片放入反应室内进行扩增反应；
（4）杂交：PCR扩增完后，将杂交反应液加入芯片，使杂交液和扩增液都进入到杂交舱内杂交反应；
（5）清洗：杂交后的芯片用洗液冲洗，直接用荧光扫描仪检测；
（6）结果判读。；
所述的待测菌基因为志贺氏菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌各自特有基因。
2.根据权利要求1所述的快速高通量的肠源致病菌检测方法，其特征在于：所述的特有基因分别是副溶血弧菌的gyrB、toxR、tl、Vp-23s基因，单增李斯特菌的16s、HlyA基因，沙门氏菌的invA、FimY、muts、TTr，金黄色葡萄球菌的nuc基因，志贺氏菌的gtrBI、gtrI、proA、Oac、gtrV、gtrX。
3.根据权利要求1所述的快速高通量的肠源致病菌检测方法，其特征在于：所述的特异性探针是根据特异性引物扩增区内设计能够区别其他菌株的，特异性引物和探针为：
副溶血弧菌
gyrB基因
VP1-F:CGGCGTGGGTGTTTCGGTAG        （SEQ ID NO1）
VP1-R:TCCGCTTCGCGCTCATCAAT        （SEQ ID NO2）
Probe:TTCTCACCCATCGCCCATTCAACCG     （SEQ ID NO3）
或
toxR基因
Vp2-F:GTCTTCTGACGCAATCGTTG        （SEQ ID NO4）
Vp2-R:ATACGAGTGGTTGCTGTCATG         （SEQ ID NO5）
Probe：CGGCAAATCGGTAGTAATAGTGCCG     （SEQ ID NO6）
单增李斯特菌
16s
Lm1-F：CGACACCAGCTGACGACA       （SEQ ID NO7）
Lm1-R：GGCCTAACACATGCAAGT        （SEQ ID NO8）
Probe：GTTTCGGCTATCGCTTACAGATGGC  （SEQ ID NO9）
或
HlyA基因
Lm2-F：CGGAGGTTCCGCAAAAGATG      （SEQ ID NO10）
Lm2-R：AACATCGATCACTCTGGAGG       （SEQ ID NO11）
Probe：AAATCATCGACCGGCAACCTC       （SEQ ID NO12）
沙门氏菌
invA基因
Sa1-F：CGTTCTACATTGACAGAAT       （SEQ ID NO13）
Sa1-R：CGAACGTGGCGATAATTTC        （SEQ ID NO14）
Probe：CAACGTTTCCTGCGGTACTGTTAAT   （SEQ ID NO15）
或
FimY基因
Sa2-F：TCGTCATTCCATTACCTACC      （SEQ ID NO16）
Sa2-R：AAACGTTGAAAAACTGAGGA           （SEQ ID NO17）
Probe：TCTGGTTATTTCCTGATCGCA           （SEQ ID NO18）
金黄色葡萄球菌
nuc基因
Sta1-F:TAAAGCGATTGATGGTGATACG    （SEQ ID NO19）
Sta1-R:AGCCAAGCCTTGACGAACTA           （SEQ ID NO20）
Probe：TAAAGCGATTGATGGTGA              （SEQ ID NO21）
或
Sta2-F:ATTACTTATAGGGATGGC        （SEQ ID NO22）
Sta2-R:AACCACTTCTATTTACGC             （SEQ ID NO23）
Probe：GAAAGGGCAATACGCAAAG             （SEQ ID NO24）
志贺氏菌
gtrBI基因
Shi1-F:AATCTGGCACTGGAAGGT        （SEQ ID NO25）
Shi1-R:TTGATACAAGCAGGGAGG        （SEQ ID NO26）
Probe：TATAGGCTTGTTTGTTGC        （SEQ ID NO27）
gtrI基因
Shi2-F:GTTACCTGTTTCGCACTG        （SEQ ID NO28）
Shi2-R:CGTACCCATAATGGAGAT        （SEQ ID NO29）
Probe：ACATCAACAAAAGCAAAG        （SEQ ID NO30）。
4.根据权利要求1所述的快速高通量的肠源致病菌检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述的DNA提取可使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA。取1.5mL增菌液，12000rpm离心2min，弃去上清液，重悬沉淀，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取DNA。
5.根据权利要求1所述的快速高通量的肠源致病菌检测方法，其特征在于：步骤（3）中所述的PCR反应体系为：2XMatermix6.25ul,PrimerA/B1ul，PCRGradeH2O0.75ul,PCRControl2ul,Sample2.5ul。
6.根据权利要求1所述的快速高通量的肠源致病菌检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增的反应条件是：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，8个循环，每个循环退火温度降低1℃。8个循环完成后94℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸1min，30个循环；72℃，8min。
7.根据权利要求1所述的快速高通量的肠源致病菌检测方法，其特征在于：步骤（3）所述的PCR扩增与步骤（4）所述的杂交在芯片仪上完成。
8.根据权利要求1所述的快速高通量的肠源致病菌检测方法，其特征在于：芯片系统直接检测细菌的裂解液，检测的灵敏性为104-105水平。
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