CN103451305A - 检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的引物、探针及方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的实时荧光定量PCR引物和探针以及使用其进行检测的方法，引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。本发明还提供了检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的试剂盒。本发明的检测方法及其试剂盒具有检测准确，灵敏度高，特异性强，简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。

Description

检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的引物、探针及方法和试剂盒

技术领域

本发明属微生物检测领域，涉及检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的引物、探针及方法和试剂盒

背景技术

大肠埃希氏菌是人类肠道中正常菌群的一部分，但某些血清型的菌株能引起尿道感染、菌血症、脑膜炎和腹泻等临床症状，这些通常是由五种致泻性大肠埃希氏菌引起，包括产志贺毒素大肠埃希氏菌（STEC）、肠产毒性大肠埃希氏菌（ETEC）、肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）和肠集聚性大肠埃希氏菌（EAEC）。其中，EPEC和EAEC均为黏附性大肠埃希氏菌（AEC），EPEC是定位粘附（LA）模式，EAEC是集聚性粘附（AA）模式。最新研究发现一种新的粘附性大肠埃希氏菌，在体外表现出对HEp-2细胞弥散性粘附的特征，这与以前两种AEC有着显著的差别，称之为“弥散粘附性大肠埃希氏菌（DAEC）”。

研究表明，DAEC主要感染1-5岁儿童，引起水样腹泻，但不引起婴儿腹泻，这与其他致泻性大肠埃希氏菌也有显著的不同。通过血清学分析，发现DAEC主要集中在O:86，O:127，O:142，O:158四个血清型，这与EPEC经常出现的血清型有部分交叉(Diffusely adherentEscherichia coli strains isolated from children and adults constitute twodifferent populations,BMC Microbiology2013,13:22)。

DAEC检测最经典和准确的方法是体外培养，观察待检DAEC菌株对HEp-2细胞的致病变特征来判定其致病性，一般典型的特征是出现弥散性粘附（DA），不同于定位粘附和聚集性粘附。此方法虽然准确，但是操作繁琐，不适合开展大规模样品的筛查，也不能满足应急检测的需求。血清学鉴定和分类只能提供传统意义上基于O抗原对大肠埃希氏菌的分型，无法解决致泻型的区分。

随后发展起来的DNA探针技术，从分子水平上探讨DAEC的毒力因子，筛选出afa基因家族和AIDI-I可能是导致DAEC弥散性粘附的特征性毒力因子，主要使用daaC探针和AIDI-I探针(MolecularCharacterization of a Fimbrial Adhesin,F1845,Mediating DiffuseAdherence of Diarrhea-Associated Escherichia coli to HEp-2Cells,JOURNAL OF BACTERIOLOGY,Aug.1989,p.4281-4289;Cloningand Expression of an Adhesin(AIDA-I)Involved in Diffuse Adherenceof Enteropathogenic Escherichia coli，INFECTION AND IMMUNITY,May1989,p.1506-1511)，其中daaC探针是afa基因家族的重要成员，在弥散性粘附因子表达方面起到重要的作用，daaC探针检测与HEp-2细胞病变鉴定的一致率超过75%；而AIDI-I探针作为分子检测标志，研究表明与HEp-2细胞病变鉴定的一致率仅有2%。此方法涉及到基因组提取技术、基因重组技术、克隆构建与筛选技术、分子杂交技术等，步骤相当繁琐和复杂，也不适用于大规模样品的筛查。

普通PCR技术出现后，普通PCR检测DAEC的方法在操作步骤和操作时间上都大为缩短，检测灵敏度也有所提高，适合进行中大量样品的快速筛查，但是普通PCR技术需要打开PCR管进行产物分析，这增加了PCR产物污染的可能性，容易出现假阳性结果，另外，普通PCR技术的灵敏度还不够高，对DAEC菌量低的样品可能无法检测，造成假阴性结果。

在DNA探针技术的基础上，普通PCR技术应用到DAEC的分子检测中去，还有另外一种PCR技术——多重PCR技术，能够在一个反应中同时鉴定六种致泻性大肠埃希氏菌，包括DAEC的鉴定。这些PCR技术在检测DAEC时多采用afa家族基因(Enterotoxigenic Escherichiacoli and Diffusely Adherent E coli as Likely Causes of a Proportion ofPathogen-Negative Travelers’Diarrhea—A PCR-Based Study,Journal of Travel Medicine,Volume15,Issue6,2008,412–418;Single Multiplex PCR Assay To Identify Simultaneously the SixCategories of Diarrheagenic Escherichia coli Associated with EntericInfections，JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Oct.2005,p.5362–5365)。但此种方法最大的问题是因扩增目标基因增多牺牲了检测灵敏度，所以普通多重PCR方法只适合于菌株的鉴定而不是快速筛查。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的特异性引物和探针序列，并在这套序列的基础上建立一种基于实时荧光PCR的特异敏感的快速检测方法，提供一个弥散粘附性大肠埃希氏菌（DAEC）快速检测试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明首先提供了设计和筛选特异性引物和探针的技术方案：

1、选择检测DAEC的目标基因

根据以往的研究数据，afa基因家族是DAEC致病性的分子基础，afa基因家族包括daaA、daaB、daaC、daaD、daaE、daaF等成员，其中daaC和daaE是DAEC的检测用目标基因。本发明将选择daaC基因用于DAEC检测的目标基因。

2、设计检测DAEC的引物和探针

本发明主要是通过检测DAEC的毒力基因daaC达到筛检DAEC的目的。

在Genbank中查找daaC基因的全长序列，把所有daaC基因全长序列导入Mega4软件中，比对分析获得daaC基因的保守序列区段。把保守序列区段输入primer express3软件中，设计3-5套引物探针备用方案。引物和探针设计时要考虑到Tm值、GC含量，同时尽可能避免出现发夹结构、引物二聚体等情况。

3、对daaC基因的引物探针备用方案进行Blast分析

在Genbank中对所有引物探针备用方案进行BLAST分析，获得特异性好的引物探针备用方案作为实验验证用方案。

4、对每一个可用实验验证方案进行PCR验证，确定引物探针的可用性，包括特异性评估和敏感性评估。

基于上述技术方案，本发明提供了一种用于检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的特异性引物，其核苷酸序列为：

上游引物：GGCCACGGAGAGTTATCAGTTT，

下游引物：AGCAGAAAAGCCGGAATGC。

进一步地，本发明还提供与所属引物配合使用的荧光探针。其中探针的5’标记荧光基因FAM，3’标记淬灭基因BHQ1。

探针序列为：Fam-TATCCCTCAGGTGGCACTGCGTCC-BHQ1。

本发明还提供了一种检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的实时荧光PCR检测方法。该方法通过检测弥散粘附性大肠埃希氏菌致病特征性afa基因家族基因片段，能够快速的筛查这种新型的粘附性大肠埃希氏菌——弥散粘附性大肠埃希氏菌，其实现的技术方案如下：

1、引物探针合成

在基因合成公司合成所有的寡聚核苷酸序列。

2、DNA模板准备

PCR扩增弥散粘附性大肠埃希氏菌afa基因家族中daaC基因序列（GenBank:JN688153.1）保守序列840bp，并将其连接到pRB322质粒上，命名为pRB322-daaC，作为方法建立的模板。

3、构建和优化实时荧光PCR检测体系

在确定PCR反应体系中引物探针序列后，还需要从引物探针浓度、退火温度、反应体系配置、反应条件等方面分别进行优化。反应体系的配置如下：

Hotstar DNA聚合酶1-2U，5×PCR buffer（Tris-HCl100mM(PH8.3)，KCl250mM，Tween-200.2%）5μL，10mM dNTP0.5～1.5μL，25mM MgCl₂2～5μL，引物探针混合物1.25μL，DNA模板2μL，超纯水补至25μL。

引物探针混合物的浓度配比见表1。

表1引物探针混合物成分配比表

引物探针代码	浓度（uM）
		daaC-F	2-20
daaC-R	2-20
		daaC-P	1-10

多重体系的反应条件如下：

a：95℃10min；

b：95℃30s，

c：55-62℃30～60s，b-c循环40个反应；

d：4℃保持。

4、检测体系的验证

针对已经建立的弥散粘附性大肠埃希氏菌实时荧光PCR检测方法进行特异性验证和敏感性验证。

特异性验证：选择其他五种致泻性大肠埃希氏菌的代表菌株CMCC44155（EPEC）、STEC分离株、CMCC44815（ETEC）、CMCC44825（EIEC）、EAEC O:42血清型，非致泻性大肠埃希氏菌ATCC25922、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、霍乱弧菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌作为特异性评估用菌株，进行核酸提取，采用前期建立和优化的反应条件进行检测，结果表明在阳性对照成立的条件下，这些评估用菌株均无特征性扩增曲线出现；重复检测结果全部一致，表明该检测方法具有较好的特异性，能够将非目标细菌有效区分开。

敏感性验证：对初始浓度为10⁷拷贝/mL的pRB322-daaC质粒稀释到10⁶拷贝/mL，10⁵拷贝/mL，10⁴拷贝/mL，10³拷贝/mL，采用前期建立和优化的反应条件进行检测，待检目标的检测限在10³-10⁴拷贝/mL，相当于每个PCR反应体系中可以检测到1-10个目标分子，重复检测结果全部一致，表明该检测方法具有高度的敏感性。

本发明还提供了含有前述引物和/或前述探针的试剂盒。

所述试剂盒还包括：阳性对照（人工构建的含目的基因碱基序列的pRB322-daaC质粒）、DNA聚合酶、反应体系缓冲液、Mg2+、dNTP和超纯水。

其工作反应体系为：Hotstar DNA聚合酶1-2U，5×PCR buffer（Tris-HCl100mM(PH8.3)，KCl250mM，Tween-200.2%）5μL，10mM dNTP0.5～1.5μL，25mM MgCl₂2～5μL，引物探针混合物1.25μL，DNA模板2μL，超纯水补至25μL。

其工作程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性30s，55-62℃退火延伸30～60s，40个循环；4℃保持。

本发明的有益效果在于：

本发明建立的弥散粘附性大肠埃希氏菌实时荧光PCR检测方法，能够快速发现新型粘附性大肠埃希氏菌-弥散粘附性大肠埃希氏菌感染，完成血清学、病原培养学、免疫学所无法完成的检测工作，克服其他分子生物学技术手段的不足之处，达到如下的检测效果：

（一）应急检测试剂储备

本发明是一种检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的快速筛查方法。目前在中国还没有感染和病原分离的报道。但是，在南北美洲、欧洲、非洲等均发现这种大肠埃希氏菌感染儿童并引起腹泻，而且在致泻性大肠埃希氏菌中所占比例在10%以上，这提示包括中国在内的亚洲国家也应该存在这种致泻性大肠埃希氏菌。本发明提供的这个检测方法或检测试剂盒能够填补这一空白，为应急检测提供试剂或方法的储备。

（二）特异性高

本发明所建立的检测方法特异性主要体现在引物探针的特异性，该引物探针序列都经过BLAST比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性试验，能够很好的区分与检测目标种属相近、生存环境相同的细菌，包括其他五种致泻性大肠埃希氏菌的代表菌株CMCC44155（EPEC）、STEC分离株、CMCC44815（ETEC）、CMCC44825（EIEC）、EAEC042血清型，非致泻性大肠埃希氏菌ATCC25922、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、霍乱弧菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确分辨出来。

（三）灵敏度高

本发明所建立的检测方法能够在一个反应体系中检测到1-10个拷贝的目标分子，明显优于其他传统检测技术；与普通PCR检测试剂相比，本发明的检测灵敏度至少要高出10倍，高度的灵敏度能够满足对样本中微量病原菌准确检测和鉴别需求。

（四）成本较低

本发明所建立的实时荧光PCR检测方法在操作上降低了人力成本和时间成本。传统思路检测和鉴定一种新型细菌，需要对采集的样本进行增菌、分离、生化鉴定、血清分型、毒力因子鉴定等一系列步骤，这很难满足大样本量筛查和应急检测的需求，使用本发明的方法可以在2小时完成传统思路7天内才能获得的结果。同时，本发明所消耗的试剂成本也远远低于繁琐的传统检测方法。

（五）有效避免污染

本发明采用的实时荧光PCR技术，将PCR扩增和产物分析有机结合，避免了普通PCR技术开管检测容易造成实验环境污染的问题。

本发明为在中国发现新型的粘附性大肠埃希氏菌提供了完备的解决方案，能实现对儿童腹泻病人中可能存在的弥散粘附性大肠埃希氏菌的快速鉴定，也会为合理恰当处置疫情提供可靠的依据。

附图说明

图1为本发明实施例2中特异性分析的PCR扩增结果。

图2为本发明实施例2中daaC-1引物探针组敏感性评估的PCR扩增结果。

图3为本发明实施例2中daaC-2引物探针组敏感性评估的PCR扩增结果。

图4为本发明实施例2中daaC-3引物探针组敏感性评估的PCR扩增结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1弥散粘附性大肠埃希氏菌daaC基因的引物探针设计与合成

在Genbank中查找弥散粘附性大肠埃希氏菌daaC基因的全长序列，把所有daaC基因全长序列导入Mega4软件中，使用Alignment功能比对分析daaC基因的保守序列，获得保守序列区段，碱基序列如SEQ ID No.1所示。

把daaC基因保守序列输入Primer Express3软件中，自动分析获得多种引物探针设计方案。在此基础上手动调节引物探针位置和序列长度，将Tm值设定为55±5℃，GC含量35%～60%，尽可能不产生发夹结构和引物二聚体，无错误引发产生。将上述手动调节获得的引物探针设计方案在NCBI网站上进行BLAST分析，如果其中任何引物探针存在交叉反应，需要重新调整引物探针的位置和序列长度，直至获得高特异性的daaC基因引物探针序列。最终获得如表2所示的三种daaC基因引物探针备选方案。

表2daaC基因引物探针备选方案

获得的引物探针备选方案均在invitrogen公司合成。

实施例2daaC基因引物探针筛选试验

对表2中daaC基因引物探针备选方案进行筛选，主要评估引物探针的特异性和敏感性。

特异性评估：采用五种致泻性大肠埃希氏菌的代表菌株CMCC44155（EPEC）、STEC分离株、CMCC44815（ETEC）、CMCC44825（EIEC）、EAEC（042血清型），非致泻性大肠埃希氏菌ATCC25922、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、霍乱弧菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等细菌作为特异性评估用菌株。对上述细菌采用细菌基因组提取试剂盒获得DNA模板。每种细菌取10μL提取液，混合成一个综合DNA模板，作为特异性评估用模板，使用NanoDrop测定其DNA含量为236.17ng/μL。

用TE（pH8.0）溶液将引物探针分别稀释成100uM的贮存液后，再配制成相应的使用液。按照如下操作配置反应体系：Hotstar DNA聚合酶0.2μL（5U/μL），5×PCR buffer（Tris-HCl100mM(PH8.3)，KCl250mM，Tween-200.2%）5μL，dNTP1μL（10mM），MgCl₂4μL（25mM），引物1μL（每条10uM），探针1μL（5uM），DNA模板2μL，超纯水补至25μL。使用10⁵和10⁴拷贝/mL的pRB322-daaC作为阳性对照。按照如下反应条件进行PCR扩增：

a：95℃10min；

b：95℃30s，

c：60℃30s，b-c循环40个反应。

PCR扩增曲线如图1所示。由图1可知，在阳性对照成立的前提下，三组方案daaC-1、daaC-2和daaC-3与所用特异性评估的细菌无交叉反应。因此可认为，三组方案daaC-1、daaC-2和daaC-3均具有较好的特异性。

敏感性评估：选择人工构建的pRB322-daaC质粒，其初始浓度为10⁷拷贝/mL，分别稀释到10⁶拷贝/mL，10⁵拷贝/mL，10⁴拷贝/mL，10³拷贝/mL，10²拷贝/mL作为daaC引物探针敏感性评估的模板。体系配置和PCR反应条件同上。

PCR扩增曲线如图2-4所示。由图2-4可以看出，方案daaC-2敏感度最高，可以检测到10³拷贝/mL的模板，其次是daaC-1，daaC-3可以检测到10⁴拷贝/mL的模板。

综合敏感性和特异性评估结果，选择daaC-2方案作为daaC基因扩增的最终引物探针。

实施例3弥散粘附性大肠埃希氏菌实时荧光PCR检测试剂盒的组建

该试剂盒由反应体系缓冲液、阳性对照、DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂、引物探针混合液、超纯水构成，其具体组分如下：反应体系缓冲液：5×PCR Buffer（Tris-HCl100mM(PH8.3)，KCl250mM，Tween-200.2%）；5U/μL DNA聚合酶；10mM dNTP；25mM MgCl₂；引物探针混合液（引物浓度为每条8uM，探针浓度为4uM）；阳性对照（10⁵拷贝/mL的pRB322-daaC）。

试剂盒检测的反应体系为25μL，其配置如下：5×PCR Buffer5μL；DNA聚合酶0.2μL；dNTP1μL；MgCl₂4μL；引物探针混合液1.25μL；模板2μL，超纯水11.55μL。

实施例4试剂盒的操作和结果判断

1、基因组的提取

取增菌液1mL或划线培养的菌落溶于1mL超纯水中，制成菌悬液，离心后弃上清，加50μL超纯水，沸水浴10min后冰浴，13000rpm离心10min，取上清作为试剂盒检测用模板。用NanoDrop测定提取核酸的浓度。

2、反应体系的配制

取200μL的PCR管配置25μL的反应体系，其配置如下：5×PCRBuffer5μL；DNA聚合酶0.2μL；dNTP1μL；MgCl₂4μL；引物探针混合液1.25μL；模板2μL，超纯水11.55μL。设立样品检测体系、阴性对照、阳性对照和空白对照。样品检测体系加入待检目标，阴性对照加入非目标菌，阳性对照加入试剂盒中的阳性对照，空白对照加入水作为检测的模板。

3、PCR反应

将PCR管放入实时荧光定量PCR仪中，按照如下程序进行PCR反应：

a：95℃10min；

b：95℃30s，

c：60℃30s，b-c循环40个反应。

4、结果判断

1）调整阈值：阈值设定原则为以刚好超过正常阴性对照的荧光信号最高点为阈值线，或根据仪器噪音情况进行调整。

2）质量控制：空白对照和阴阳性对照成立，否则视实验无效。

3）结果判断与解释：a）若样品有S型扩增，且CT值<35，则判定样品为弥散粘附性大肠埃希氏菌阳性；b）若有S型扩增，且35≤CT值<40，判定为不确定样品，需重新提取核酸后进行检测；若复检的样品仍有S型扩增，且CT值小于40，则判定样品为弥散粘附性大肠埃希氏菌阳性，否则为阴性；c）若无明显S型扩增曲线，但报告有CT值，为非特异性扩增，可能为探针降解所释放的非特异性荧光信号。

实施例5试剂盒的保存期试验

以10⁵拷贝/mL的pRB322-daaC为评估用检测样本，在第0天时，分装成10份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、20、30、60、90、120、150和180天的试剂盒进行保存期试验，每次检测设置三个平行管。保存期检测结果如表3所示：

表3保存期试验结果

保存期	结果	CT均值
			第0天	+	26.12
第10天	+	26.09
			第15天	+	26.17
第20天	+	26.20
			第30天	+	26.06
第60天	+	26.28
			第90天	+	26.50
第120天	+	26.65
			第150天	+	26.98
第180天	+	27.03

注：阳性对照每次检验均为阳性；C_T值为三个平行管的检测均值。

由表3可知，试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测结果均为阳性，CT值在26.12-27.03之间，实验结果表明该试剂盒的保存期至少为6个月。

实施例6试剂盒的特异性试验

选择其他五种致泻性大肠埃希氏菌的代表菌株CMCC44155（EPEC）、STEC分离株、CMCC44815（ETEC）、CMCC44825（EIEC）、EAEC（042血清型），非致泻性大肠埃希氏菌ATCC25922、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、霍乱弧菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等与检测目标菌种属相近，存在环境相似的细菌作为待检细菌。

应用本发明试剂盒检测这些待检细菌，阳性对照成立，证明检测系统成立；待检细菌均未出现特异性的扩增信号，表明本发明试剂盒能够有效区分非目标细菌，具有较好的特异性。

实施例7试剂盒的敏感性试验

评估用检测样本：选择pRB322-daaC，调整浓度至10⁷拷贝/mL，梯度稀释成10⁶拷贝/mL，10⁵拷贝/mL，10⁴拷贝/mL，10³拷贝/mL，10²拷贝/mL的检测样品。

使用本发明试剂盒分别检测不同稀释度的模板,每个稀释度平行做三个管。根据实例4进行操作和结果判断，试剂盒检测的敏感性试验结果如表4所示：

表4试剂盒检测敏感性试验结果

注：C_T值为三个平行管的检测均值。

从表4看出，试剂盒检测的敏感性稳定达到10³拷贝/mL（即每个反应体系可检测出<10个拷贝目标分子）。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种用于检测弥散粘附性大肠埃希氏菌的特异性引物，其核苷酸序列为：

上游引物：GGCCACGGAGAGTTATCAGTTT，

下游引物：AGCAGAAAAGCCGGAATGC。

2.与权利要求1所述引物配合使用的荧光探针，其核苷酸序列为：

Fam-TATCCCTCAGGTGGCACTGCGTCC-BHQ1。

3.一种弥散粘附性大肠埃希氏菌的检测方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。

4.含有权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针的试剂盒。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阳性对照，DNA聚合酶，反应体系缓冲液，Mg²⁺，dNTP和超纯水。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其工作反应体系为：Hotstar DNA聚合酶1-2U，5×PCR buffer（Tris-HCl100mM(PH8.3)，KCl250mM，Tween-200.2%）5μL，10mM dNTP0.5～1.5μL，25mMMgCl₂2～5μL，引物探针混合物1.25μL，DNA模板2μL，超纯水补至25μL。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序为：

95℃预变性10min，1个循环；95℃变性30s，55-62℃退火延伸30～60s，40个循环；4℃保持。

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