CN111560448A - 高分辨溶解曲线技术检测禽中4种常见食源性致病菌的方法 - Google Patents

高分辨溶解曲线技术检测禽中4种常见食源性致病菌的方法 Download PDF

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CN111560448A CN202010317191.XA CN202010317191A CN111560448A CN 111560448 A CN111560448 A CN 111560448A CN 202010317191 A CN202010317191 A CN 202010317191A CN 111560448 A CN111560448 A CN 111560448A
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Abstract

本发明属于病菌检测技术领域，具体公开了一种高分辨溶解曲线技术检测禽中4种常见食源性致病菌的方法，包括以下步骤：(1)引物设计；(2)肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌的培养；(3)四种目标菌DNA模板提取与混合；(4)在同一反应管中，加入4种目标菌的特异性引物与混合DNA模板，建立多重HRM‑real time PCR反应体系，进行PCR扩增反应；(5)PCR产物进行高分辨率熔解曲线分析。本发明具有操作简单、快速、特异性强等优点，为食品中多种致病菌污染的快速检测提供了新的手段。

Description

高分辨溶解曲线技术检测禽中4种常见食源性致病菌的方法
技术领域
本发明涉及一种分子生物学技术领域，特别是一种高分辨溶解曲线-实时荧光PCR同时检测4种食源性致病菌的方法。
背景技术
食品安全是关系到民生的重大事件，目前由于食源性致病菌引起的疾病在世界各国都引起重视，特别是微生物食物中毒事件。国内目前在禽产品中常见的食源性致病菌主要有肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲菌。因此，发展新的快速检测与鉴定食源性致病菌的方法是及时有效地控制和预防致病菌传播的前提。
目前食源性致病菌的检测方法主要包括传统培养法与生理生化检验，以及包括酶联免疫法、分子生物学方法等快速检测技术。传统的检测方法无法对难培养或不可培养的致病菌进行检测，且耗时费力，获得结果通常需要几天的时间，不能实现有效的监测、预防作用。且单独检测一种致病菌已无法满足现今社会对致病菌检测高效率的要求。多重PCR是在同一反应管中同时完成多种致病菌的高效PCR扩增，从而实现多种致病菌DNA的同步快速检测的技术。由于多重PCR可降低致病菌检测过程中样本、物资、试剂、工作量等占用的时间和空间，多重PCR技术在降低检测成本方面显得非常经济。高分辨溶解曲线分析技术(HighResolution Melting,HRM)是一种基于单核苷酸溶解温度不同而形成不同溶解曲线的基因分析技术，通过与实时荧光PCR相结合，可以实时监测温度上升时双链DNA的解链过程。HRM技术以其高特异性、高通量、高灵敏度、低成本、快速等优势，在临床诊断及基因分析上得到迅速发展，已成为生命科学研究中的热点技术，利用HRM能针对每一种细菌的固定DNA 序列产生精确的Tm值，可将HRM分析技术应用于多种致病菌的检测中。
作者为胡双芳发表的“高分辨率溶解曲线检测9种食源性致病菌方法的建立”文献(2016 年《现代食品科技》，2016,Vol.32,No.3)(以下称文献)，该文献所建立的方法是通过将引物对分成两组进行HRM-real time PCR反应检测9种食源性致病菌，A组为空肠弯曲菌(Tm:81.31℃±0.035)、志贺氏菌(Tm:86.88℃±0.082)、副溶血弧菌(Tm:85.55℃±0.071)、金黄色葡萄球菌(Tm:81.81℃±0.024)、单增李斯特菌(Tm:81.60℃±0.041)，B组为阪崎克罗诺杆菌(Tm:82.70℃±0.068)、沙门氏菌(Tm:86.29℃±0.035)、大肠杆菌O157：H7(Tm:84.08℃±0.091)、霍乱弧菌(Tm:86.58℃±0.041)。文献中空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的Tm相差0.3℃左右，差异很小，难以分辨。且空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌与沙门氏菌不能同时进行检测，需要用两个反应管进行检测，检测繁琐。
公开号为CN104152546A、公开日为2014年11月19日的中国发明专利公开了一种同时检测沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的方法：(1)将待测样品在沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的混合培养基中培养，分别选取invA、hly、Sa442为沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的目的基因，设计与invA、hly、Sa442配套的上、下游引物，对上述混合培养后的产物进行DNA提取；(2)采用PCR扩增引物对上述提取的混合模版DNA进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行高分辨率溶解分析，程序为：95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s，溶解速率为0.2℃/s；(3)通过高分辨率溶解曲线法对待测样品进行鉴定，使用Tm值作为判读标准，当测得的Tm值为 79.38±0.5℃，82.54±0.5℃和77.36±0.5℃时，则对应的菌株分别为沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌。采用上述方案，只能同时检测3种致病菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种高分辨溶解曲线-实时荧光PCR同时检测禽中4种食源性致病菌的方法，本发明利用高分辨溶解曲线分析技术针对禽中4种常见的食源性致病菌(肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲菌)进行检测，分别以上述4种菌的fimY、 hly、nuc和orfC为靶基因，建立多重HRM-real time PCR检测体系，具有操作简单、快速、特异性强等优点，为食品中多种致病菌污染的快速检测提供了新的手段。
本发明的目的是通过提供以下技术方案实现的，高分辨溶解曲线-实时荧光PCR同时检测4种食源性致病菌的方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：
(1)引物设计，引物序列见表1；
表1用于多重HRM-real time PCR的引物
Figure RE-RE-GDA0002582204420000021
(2)肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌的培养；
(3)DNA模板的提取：按革兰氏阳性菌提取单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌DNA模板，按革兰氏阴性菌提取肠炎沙门氏菌和空肠弯曲菌DNA模板提取，提取的DNA模板作于-20℃贮存；
(4)混合DNA模板的制备：将提取的肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲菌DNA模板混合后用PBS稀释，得到混合DNA模板，混合DNA模板中四种菌DNA 模板浓度均为1013拷贝数/mL；
(4)在同一反应管中，加入特异性引物fimY、hly、nuc、orfC各0.1μL，建立多重HRM-real time PCR反应体系，进行PCR扩增反应；
(5)步骤(4)得到的PCR产物进行高分辨率溶解曲线分析：
当Tm值为82.2℃±0.019，判定为肠炎沙门氏菌；
当Tm值为78.2℃±0.022，判定为单增李斯特菌；
当Tm值为75.5℃±0.036，判定为金黄色葡萄球菌；
当Tm值为73.5℃±0.052，判定为空肠弯曲菌。
优选的，每20μL PCR反应体系是包含：
10.0μL MeltDoctor TM HRM Master mix；(高分辨溶解曲线检测试剂盒)
0.05μL特异性引物fimY上游引物，0.05μL特异性引物fimY下游引物；
0.05μL特异性引物hly上游引物，0.05μL特异性引物hly下游引物；
0.05μL特异性引物nuc游引物，0.05μL特异性引物nuc下游引物；
0.05μL特异性引物orfC上游引物，0.05μL特异性引物orfC下游引物；
1.0μL混合DNA模板；
其余以无菌去离子水补齐。
优选的，所述PCR反应的程序为：95℃预变性1min；以95℃变性15s，60℃退火1min扩增40个循环。
优选的，所述PCR产物进行高分辨率溶解曲线分析，溶解程序为：95℃10s，60℃1min， 95℃15s，60℃15s；
程序设置：仪器类型：QuantStudioTM 6Flex System；模块：96孔(0.1mL)；试验类型：高分辨熔解曲线；试剂：高分辨溶解试剂(MeltDoctorTM HRM Ragents)；特性：标准。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
第一，本发明所构建的实时荧光定量PCR结合高分辨溶解曲线的方法具有操作简单、快速、特异性强等优点，为食品中多种致病菌污染的快速检测提供了新的手段，有望发展为快速同时检测食品中多种致病菌污染的有效手段。
第二，与“高分辨溶解曲线检测9种食源性致病菌方法的建立”所建立的方法相比，本专利涉及的多重HRM-real time PCR反应同时检测禽中4种常见食源性致病菌，包括空肠弯曲菌(Tm:73.8±0.040)金黄色葡萄球菌(Tm:75.2±0.047)单增李斯特菌(Tm:78.2±0.032)肠炎沙门氏菌(Tm:82.0±0.046)。根据重合的菌种，由下表可以看出，文献1中空肠弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的Tm相差0.3℃左右，本多重反应体系种Tm值相差2～4℃，差异大，准确度更高。且空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌与肠炎沙门氏菌不能同时进行检测，需要用两个反应管进行检测。而本文献可同时在一个反应管中测定这四种菌，操作更加简便。
表2本发明与文献的Tm对比
Tm 空肠弯曲菌 金黄色葡萄球菌 单增李斯特菌 沙门氏菌
文献 81.31±0.035 81.81±0.024 81.60±0.041 86.29±0.035
专利 73.8±0.040 75.2±0.047 78.2±0.032 82.0±0.046
第三，文献中所涉及到的空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌的引物序列为orfC、Sa442、hly、fimY。本发明选取的引物序列为orfC、nuc、hly、fimY。本专利以金黄色葡萄球菌编码耐热核酸酶(thermostable nuclease，Thermonuclease，TNase)的基因为靶基因(nuc)，在其保守序列设计上述特异性引物对。金黄色葡萄球菌特有的毒力基因- nuc基因，编码的耐热核酸酶(thermostable nuclease，Thermonuclease，TNase)不仅是金黄色葡萄球菌所特有的，而且在不同菌株间也具有较高的保守性。依赖于nuc基因的特异性，所建立的PCR鉴定方法灵敏度高、特异性强。nuc基因为金黄色葡萄球菌的鉴定提供了更有价值的方法，同时因不需要测序，能大大缩短细菌鉴定的时间和成本。nuc基因有潜在增强金黄色葡萄球菌耐药性的能力，因此，该基因能作为金黄色葡萄球菌独特的毒力因子为进一步研究耐药性与毒素之间的关系提供新的思路。
第四，目前采用高分辨溶解曲线技术对金黄色葡萄球菌nuc基因的鉴定还没有公开专利。
附图说明
图1为本发明沙门氏菌单重HRM-real time PCR溶解曲线图；
图2为本发明单增李斯特菌单重HRM-real time PCR溶解曲线图；
图3为本发明金黄色葡萄球菌单重HRM-real time PCR溶解曲线图；
图4为本发明空肠弯曲菌单重HRM-real time PCR溶解曲线图；
图5为本发明多重HRM-real time PCR溶解曲线图。
具体实施方式
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株与样本
本实验选取S.Enterica CMCC50041，L.monocytogenesATCC19115、S.aureusATCC12598 和C.jejuni ATCC33560这四株菌株作为目标试验菌株。本实验室自有或购买。10份不含上述四种菌的空白鸡肉样本已经过检验。
1.1.2主要试剂
MeltDoctor TM HRM Master mix(美国赛默飞公司)，细菌DNA提取试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)，营养琼脂培养基(青岛海博生物)，CCDA培养基(英国OXOID公司)，MH培养基(英国OXOID公司)、LB培养基(青岛海博生物技术有限公司)，脱纤维绵羊血(青岛海博生物技术有限公司)，DEPC水，；混合气(5％O2、10％CO2和85％N2)(南京特种气体厂有限公司)。
1.1.3主要仪器
生物安全柜(A2，日本ESCO)、生化培养箱(HPS-150，太仓市华美生化仪器厂)、高压灭菌锅(SANYO MLS-3750，日本)、三用恒温水槽(XMTD-204，金坛市文化仪器有限公司)、离心机(XT15R，日本HITACHI)、超纯水分离系统(Mliili-Q Advantage A10，美国Millipore公司)、超低温冰箱(DW-86L828，海尔)、低温冰柜(BC/BD-318HD，海尔)、电子天平(XS105，瑞士METTLER TOLEDO公司；TM-EXB5002S，南京汤姆斯衡器有限公司)、移液枪(Eppendorf，德国)、恒温磁力搅拌器(HJ-3，江苏金坛市环宇科学仪器厂)、涡旋混匀器(VTX-3000L，比利时LMS公司)、QuantStudioTM6Flex全功能定量PCR仪(美国ABI公司)。
1.2方法
1.2.1引物设计
广泛查阅资料，搜索目标菌株内保守、其他菌株间特异的基因片段，分别选取高度保守区域fimY、hly、nuc和orfC作为肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲菌的PCR扩增靶基因。在GeneBank上查询并下载所有靶基因序列，采用DNAStar软件中的 seqman进行同源性分析，用生物软件Primer ExpressV2.0对上述保守片段设计引物。所有引物对的可行性经由NCBI上进行BLAST比对，验证引物的保守性。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列见表1。
1.2.2细菌的培养
取保藏于-80℃的甘油保藏菌种，肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌用接种环蘸取少许菌液划线接种至营养琼脂平板上，37℃培养24h，复活菌种后接种环蘸取少许菌液混入LB营养肉汤中，37℃160r/min恒温振荡器培养16h；空肠弯曲菌用接种环蘸取少许菌液接种于CCDA平板微需氧条件下42℃培养36h后富集培养于MH血平板。富集培养后的细菌置于4℃冰箱冷藏备用。
多重HRM-real time PCR法对食品样本检测后的增菌步骤用SSL复合增菌培养基进行增菌。
1.2.3 DNA模板的提取
肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌采用液体LB培养基37℃过夜培养，然后分别取1.5mL菌液依照DNA提取试剂盒说明书提取DNA，空肠弯曲菌将MH血平板纯化培养的细菌用无菌棉签刮下洗入PBS缓冲溶液，离心后去除上层液体。单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌按革兰氏阳性菌提取，沙门氏菌和空肠弯曲杆菌按革兰氏阴性菌提取，所提取的DNA模板作为反应体系于-20℃贮存。
1.2.4单重HRM-real time PCR反应体系的建立
根据MeltDoctorTM HRM Master mix，每20μL的PCR反应体系包含10.0μLMeltDoctor TM HRM Master mix，1.2μL上游引物(5μM)，1.2μL下游引物(5μM)，1.0μLTemplate(反应组以基因组DNA为模板，对照组的模板为无菌去离子水)，其余以无菌去离子水补齐。
单重HRM-real time PCR反应程序均为：95℃预变性1min；以95℃变性15s，60℃退火1min扩增40个循环。PCR产物进行高分辨率溶解曲线分析，溶解程序为：95℃10s，60℃1min， 95℃15s，60℃15s。程序设置：instrument type:QuantStudioTM 6Flex System；block:Fast 96-Well(0.1mL)；experiment type:High Resolution Melt；reagents:MeltDoctorTM HRM Ragents； properties:Standard。
1.2.5多重HRM-real time PCR反应体系的建立
在单重HRM-real time PCR反应体系建立的基础上，在同一反应管中，加入4对相应的目标菌的特异性引物对各0.1μL，其他成分和PCR反应程序与单重HRM-real time PCR反应一致，如1.2.4所示。
1.2.6多重HRM-real time PCR反应特异性
在多重HRM-real time PCR反应体系建立的基础上，以目标菌和非目标菌株的基因组DNA为模板进行多重HRM-real time PCR反应，检验所建立体系的特异性。选取大肠杆菌、志贺氏菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、结肠弯曲杆菌为非目标菌株，以肠炎沙门氏菌、空肠弯曲菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌标准菌株为阳性对照，去离子水为阴性对照，进行了特异性检验。
1.2.6多重HRM-real time PCR反应灵敏度
选取S.Enterica CMCC50041、L.monocytogenes ATCC19115、S.aureus ATCC12598和C. jejuni ATCC33560四种菌株作为HRM-real time PCR反应体系敏感性试验的模板DNA来源。将四种菌株分别接种于营养肉汤液体培养基中，37℃180rpm振荡过夜培养。取1.5mL依照DNA提取试剂盒说明书提取DNA。
1.2.7多重HRM-real time PCR反应体系检测单一致病菌灵敏度
测定提取的标准菌株的基因组DNA浓度，将DNA调整到1014拷贝数/mL，然后进行10倍梯度稀释，即进行单一致病菌灵敏度试验的DNA分别为10～108拷贝数/mL，每个浓度取1μL 进行单一致病菌灵敏度检测。。每个浓度制备至少3个重复样本，只有所有3个重复样本都被检测为阳性的时候该样本才能被判定为阳性。
1.2.8多重HRM-real time PCR反应体系检测多种致病菌的灵敏度
将提取的标准菌株的基因组DNA浓度调整到1014拷贝数/mL后，按1:1:1:1混合四种标准菌株，调整混合DAN模板浓度为1×1013拷贝数/mL，然后进行10倍梯度稀释，即进行多种致病菌灵敏度试验的DNA分别为1×10～1×108拷贝数/mL，每个浓度取1μL进行单一致病菌灵敏度检测。每个浓度制备至少3个重复样本，只有所有3个重复样本都被检测为阳性的时候该样本才能被判定为阳性。
1.2.9多重HRM-real time PCR反应重复性
对多重HRM-real time PCR反应体系的稳定性考察包括试验间稳定性和试验内稳定性。以敏感性试验中的S.Enterica CMCC50041，L.monocytogenes ATCC19115、S.aureusATCC12598和C.Jejuni ATCC33560基因组DNA为检测样本，选取108～103拷贝数/mL 6个浓度梯度，每个浓度一式三份。同一样本在同一试验中扩增3次，用以评估该体系的批内重复性，同一样本分开3次不同时间进行3次试验，以评估该体系的批间重复性。
1.2.10人工染菌样本的应用
分别取37℃过夜培养的S.Enterica CMCC50041，L.monocytogenes ATCC19115、S.aureus ATCC12598和C.jejuni ATCC33560菌悬液各1mL，用生理盐水按10-1～10-6梯度进行10倍稀释，制备浓度梯度菌悬液。然后将每个浓度的四种菌悬液各1mL，同时接种到25g鸡肉样本中，设置5CFU/25g、10CFU/25g和20CFU/25g鸡肉样本三种接种浓度。接种后的样本置于 20℃存放1h后，加入200mLSSL，均质10s。所有样本经37℃过夜培养后，样本1000g离心5min，并用滤袋过滤除去粗糙的食物残渣后，用试剂盒提取菌体DNA，多重HRM-real timePCR体系进行检测。
2结果与讨论
2.1单重HRM-real time PCR反应建立
单重PCR反应分别扩增出了4种致病菌对应的4条特异性高分辨率溶解曲线和熔点峰，具有典型的扩增曲线，CT值在16.2～19.0之间，RSD值在0.28％～0.94％之间。如图1-4所示，所对应的沙门氏菌fimY基因的实际Tm值为82.2℃±0.019，单增李斯特菌hly基因的实际Tm值为78.2℃±0.022，金黄色葡萄球菌nuc基因的实际Tm值75.5℃±0.036，空肠弯曲菌 orfC基因的实际Tm值为73.5℃±0.052。四种食源性致病菌Tm值之间均相互错开，为多重 HRM-real time PCR反应体系的建立奠定基础。
2.2多重HRM-real time PCR反应建立
通过单重HRM-real time PCR反应可知，4种目标致病菌在退火温度为60℃时均能够获得良好的扩增结果，故选60℃作为多重反应程序的退火温度。但若直接将单重体系中的模板及引物对简单的混合在一起进行多重HRM-real time PCR反应，则扩增效果不是很理想，溶解曲线丰不明显，因此需要对多重反应体系组分进行分组实验并初步优化。经对模板浓度调整，扩增出四个不同Tm值的溶解曲线图，如图5所示。
2.3多重HRM-real time PCR反应特异性
多重PCR反应体系特异性检验结果表明，所有目标菌均出现阳性扩增，而其他非目标菌株，均未出现扩增。表明多重PCR反应体系具有良好的特异性。
2.4多重HRM-real time PCR反应灵敏度
多重HRM-real time PCR反应灵敏度结果见表3。表3表明，随着稀释梯度的不断增加，即菌浓度的不断减少，其Ct值对应增大，各食源性致病菌直至稀释至102拷贝数/mL时达到检出限，其平均Ct值为16.2～34.9之间，标准差为0.05～0.65之间。结合平板计数结果显示，沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲菌的检测灵敏度分别为103拷贝数/mL，结果表明上述多重HRM-real time PCR体系对上述4种单一食源性致病菌的检测均具有良好的灵敏度。表4是反应体系同时检测四种食源性致病菌结果，随着稀释梯度的不断增加，即菌浓度的不断减少，其Ct值对应增大，各食源性致病菌直至稀释至103拷贝数/mL时达到检出限，其平均Ct值为14.6～33.2之间，标准差为0.11～1.92之间。对比两个结果，发现Ct值无显著差异，表明多种菌混合并不会降低HRM-real time PCR反应的灵敏度，反应体系稳定性良好。
表3多重HRM-real time PCR反应检测单一致病菌的灵敏度 Tab 3 Sensitivityof multiplex HRM-real time PCR in simple bacterium
Figure RE-RE-GDA0002582204420000091
表4多重HRM-real time PCR反应检测多种致病菌的灵敏度
Tab 4 Sensitivity of multiplex HRM-real time PCR in four bacteriums
Figure RE-RE-GDA0002582204420000092
2.5多重HRM-real time PCR反应重复性
多重HRM-real time PCR反应重复性检验结果见表5。108～103拷贝数/mL 6个稀释浓度的 Tm值表明，多重HRM-real time PCR反应体系具有高度的重复性。Tm值的批内CV值为：沙门氏菌0.03％～0.12％，单增李斯特菌0.03％～0.12％，金黄色葡萄球菌0.06％～0.32％，空肠弯曲菌0.03％～0.21％；Tm值的批间CV值为：沙门氏菌0.55％～1.12％，单增李斯特菌0.53％～2.12％，金黄色葡萄球菌0.45％～2.02％，空肠弯曲菌0.66％～2.01％。批内和批间Tm值的CV值均较低，提示该体系具有较高的重复性。
表5多重HRM-real time PCR体系的重复性
Tab 5 Reproducibility of multiplex HRM-real time PCR
Figure RE-RE-GDA0002582204420000101
2.6人工染菌样本的检测
阳性对照中肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲菌Tm值分别为 82.20℃、78.24℃、75.45℃和73.50℃。实验表明，5CFU/25g、10CFU/25g和20CFU/25g三种感染浓度下，10份鸡肉样本中四种目标菌的目标扩增产物Tm值与直接从目标菌株菌液中提取出来的的Tm值对比，无显著差异。在灵敏度上，感染样本在进行37℃24h的增菌后，对肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲菌，多重HRM-real time PCR 法均能达到5CFU/25g的检测限，结果见表6。
表6多重HRM-real time PCR体系对人工感染样本敏感度
Tab 6 Tm value of artificaially-inoculated samples in multiplex HRM-real time PCR
Figure RE-RE-GDA0002582204420000102
3.结论
综上所述，本发明所构建的实时荧光定量PCR结合高分辨溶解曲线的方法具有操作简单、快速、特异性强等优点，为食品中多种致病菌污染的快速检测提供了新的手段，有望发展为快速同时检测食品中多种致病菌污染的有效手段。
高分辨溶解曲线技术检测禽中4种常见食源性致病菌的方法
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120>高分辨溶解曲线技术检测禽中4种常见食源性致病菌的方法
<160> 8（序列总数）
<210> 1（序列编号）
<211> 24（序列长度）
<212> DNA（序列类型，例如：DNA、RNA或PRT）
<213>肠炎沙门氏菌（序列来源的生物名称）
<400> 1（序列编号）
GCGCTACCTG TCTCCTGTAT TGAG 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213>肠炎沙门氏菌
<400> 2
TTGGAGGCTG ATAACAAGGC TTCG 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213>单增李斯特菌
<400> 3
TGCTGCCGTA AGTGGGAAAT 20
<210> 4
<211>
<212> DNA
<213>单增李斯特菌
<400>4
AGCAATGGGA ACTCCTGGTG 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213>金黄色葡萄球菌
<400>5
AGCGATTGAT GGTGATACGG T 21
<210>6
<211> 20
<212> DNA
<213>金黄色葡萄球菌
<400> 6
TGCACTTGCT TCAGGACCAT 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213>空肠弯曲菌
<400> 7
GCGGCGTTGG AGAGTGATA 19
<210>8
<211> 27
<212> DNA
<213>空肠弯曲菌
<400> 8
GGGAAAGACA CCGCCGTTTA AGAAATG 27

Claims (4)

1.高分辨溶解曲线技术检测禽中4种常见食源性致病菌的方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：
(1)引物设计，引物序列见表1；
表1用于多重HRM-real time PCR的引物
Figure FDA0002459999850000011
(2)培养肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌，并提取四种菌的DNA模板，提取的DNA模板于-20℃贮存；
(3)4种DNA模板的混合制备：将提取的肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲菌DNA模板混合后用PBS稀释，得到混合DNA模板，混合DNA模板中四种菌DNA模板的浓度均为1013拷贝/mL；
(4)在同一反应管中，加入4种特异性引物fimY、hly、nuc、orfC、混合DNA模板，建立多重HRM-real time PCR反应体系，进行PCR扩增反应；
(5)步骤(4)得到的PCR产物进行高分辨率熔解曲线分析：
当Tm值为82.2℃±0.019，判定为沙门氏菌；
当Tm值为78.2℃±0.022，判定为单增李斯特菌；
当Tm值为75.5℃±0.036，判定为金黄色葡萄球菌；
当Tm值为73.5℃±0.052，判定为空肠弯曲菌。
2.根据权利要求1所述的高分辨溶解曲线技术检测禽中4种常见食源性致病菌的方法，其特征是，每20μL PCR反应体系是包含：
10.0μL高分辨溶解曲线检测试剂盒MeltDoctor TM HRM Master mix；
0.05μL特异性引物fimY上游引物，0.05μL特异性引物fimY下游引物；
0.05μL特异性引物hly上游引物，0.05μL特异性引物hly下游引物；
0.05μL特异性引物nuc游引物，0.05μL特异性引物nuc下游引物；
0.05μL特异性引物orfC上游引物，0.05μL特异性引物orfC下游引物；
1.0μL混合DNA模板；其余以无菌去离子水补齐。
3.根据权利要求1所述的高分辨溶解曲线技术检测禽中4种常见食源性致病菌的方法，其特征是，所述PCR反应的程序为：95℃预变性1min；以95℃变性15s，60℃退火1min扩增40个循环。
4.根据权利要求1所述的高分辨溶解曲线技术检测禽中4种常见食源性致病菌的方法，其特征是，所述PCR产物进行高分辨率熔解曲线分析，熔解程序为：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s；
程序设置：仪器类型：QuantStudioTM6 Flex System；模块：96孔，0.1mL；试验类型：高分辨熔解曲线；试剂：高分辨溶解试剂；特性：标准。
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