CN109735635A - 一种同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的方法 - Google Patents
一种同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一组基于环介导等温扩增技术检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的引物，分别针对金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的fimY基因、志贺氏菌的ipaH基因进行扩增。利用这组引物进一步构建了金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的检测方法和试剂盒。本发明构建的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌检测方法及其试剂盒用于这三种菌的扩增和检测分析，特异性好，灵敏度高，可检测多个细菌的混合样品，进一步通过酶切反应可以区分不同细菌；由于本反应在61～66℃均可进行，进行过程不需要变温，因此在条件简陋的实验室以及发展中国家都可以得到推广。
Description
技术领域
本发明涉及肺微生物检测技术领域，更具体地，涉及一种同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌在全球都被作为食源性微生物重点监控对象。在我国发布的果、蔬汁饮料卫生标准[GB19297-2003]中，明确规定：致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌)不得检出。对食源性致病菌的控制关键在于对食品的严格监控，快速、灵敏、准确的检测方法是确保监控有效性的基础，对检验检疫及疾病控制都有重要作用。
目前常规检测采用传统培养方法，每种病菌需进行单独的培养，单独进行检测，工作量大；而使用荧光定量单个检测方法逐个操作，配置反应体系数目多，要消耗大量的试剂、人力、物力和时间；免疫学方法检测需要寻找高灵敏度和特异性的抗原，且试剂昂贵，操作复杂。
因此需要一种简单便捷，高效准确的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌现有检测技术的不足，提供利用多重环介导等温扩增技术检测这三种食源性病原菌的方面。该方法不仅能够有效检测出这三种病原菌，还能够将检测时间控制在2小时内，做到快速、灵敏、准确、简便，可应用于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的检测中。
本发明的第一个目的是提供一组基于环介导等温扩增技术同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的引物组。
本发明的第二个目的是提供所述引物组在检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌或制备检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种同时检测待测样品金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的方法。
本发明的第四个目的是一种同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一组基于环介导等温扩增技术同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的引物组，包括分别针对金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的fimY基因、志贺氏菌的ipaH基因进行扩增的引物。
优选地，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～12所示，或为SEQ ID NO：1～12所示的核苷酸序列的互补序列。
nuc-F3(SEQ ID NO：1)：AAAAGATGGTAGAAAATGCHAAG；
nuc-B3(SEQ ID NO：2)：TGTTCATGTGTATTGTTAGGTT；
nuc-FIP(SEQ ID NO：3)：
ACGCTAAGCCACGTCCATATTCTCGAGAAAATTGAAGTCGAGTTTGACA；
nuc-BIP(SEQ ID NO：4)：
TATGCTGATGGAAAAATGGTAAACGTAAACATAAGCAACTTTAGCCAAG；
fimY-F3(SEQ ID NO：5)：AGAAAGCTTTGCCTGTGG；
fimY-B3(SEQ ID NO：6)：WAACCTCGCTTATCGGAA；
fimY-FIP(SEQ ID NO：7)：
AGCAAAGCGTACCTTATCATCGGGTACCGTTAAGGAGGGTGATAAGTTG；
fimY-BIP(SEQ ID NO：8)：
GACGTGCTATTTCTTTTAAAGAGGCAGCTTTAGCCGTACTGAC；
ipaH-F3(SEQ ID NO：9)：GCTGGAAAAACTCAGTGCCT；
ipaH-B3(SEQ ID NO：10)：GGAACATTTCCCTGCCCA；
ipaH-FIP(SEQ ID NO：11)：
CGACACGGTCCTCACAGCTCGGATCCTTCGACAGCAGTCTTTCGC；
ipaH-BIP(SEQ ID NO：12)：
ATCTCCGGAAAACCCTCCTGGTAGCGCCGGTATCATTATCGA。
其中，SEQ ID NO：1～4针对黄色葡萄球菌的nuc基因的LAMP扩增引物；
SEQ ID NO：5～8针对沙门氏菌的fimY基因LAMP扩增引物；
SEQ ID NO：9～12针对志贺氏菌中的ipaH基因LAMP扩增引物。
环介导等温扩增技术(LAMP)，使用四个关键引物的引物组，所述四个关键引物称为正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向置换引物(F3)和反向置换引物(B3)。使用这4种不同的引物来进行LAMP扩增。
本发明中：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：9均为F3引物；
SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：10均为B3引物；
SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11均为FIP引物；
SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：12均为BIP引物。
以上所述引物组在检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌或制备检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的试剂盒中的应用。
一种同时检测待测样品金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的方法，以待测样品的核酸为模板，以上所述引物组进行环介导等温扩增，根据扩增产物判断待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和/或志贺氏菌。
优选的，使用以上所示SEQ ID NO：1～12或其互补序列引物进行扩增。
优选的，环介导等温扩增的条件为反应温度为61～66℃，反应时间为40～90min。
更优选地，扩增条件为反应温度为64℃，反应时间为60min。
优选地，根据扩增产物判断待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和/或志贺氏菌的方法为：将扩增产物利用显色法或琼脂糖凝胶电泳法或实时荧光法，判定样品中是否含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或志贺氏菌中的任一种或几种。
进一步优选地，扩增产物使用Xho I进行酶切，即可判定样品中是否含有金黄色葡萄球菌；扩增产物使用Kpn I进行酶切，即可判定样品中是否含有沙门氏菌；扩增产物使用BamH I进行酶切，即可判定样品中是否含有志贺氏菌。
最优选地，一种金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的检测方法，包括一下步骤：
S1.LAMP反应
使用进行LAMP反应，使用ddH2O作为阴性模板反应体系为：
反应条件为：温度64℃，反应时间60min。
S2.LAMP反应结果检测
取5μL LAMP产物在SYBR Green I染色、2％琼脂糖凝胶上电泳。
S3.LAMP产物酶切
反应体系为：酶切缓冲液3μL，LAMP产物3μL，Xho I/Kpn I/BamH I各1μL，补充ddH2O至30μL。
反应条件为：37℃酶切1h。
S4.结果判读
LAMP反应结束后，经过琼脂糖凝胶电泳，有明显梯形条带的，则说明样本中至少含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或志贺氏菌中的一种；否则说明样本并不含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌中的任一种。
当琼脂糖凝胶电泳，有明显梯形条带时，取LAMP产物三份，分别使用Xho I、Kpn I和BamH I进行酶切反应，如果LAMP产物能被Xho I部分或全部酶切，则说明样本中含有金黄色葡萄球菌；如果LAMP产物能被Kpn I部分或全部酶切，则说明样本中含有沙门氏菌；如果LAMP产物能被BamH I部分或全部酶切，则说明样本中含有志贺氏菌。
一种同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的试剂盒，包括金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的fimY基因和志贺氏菌中的ipaH基因或其片段的多重环介导等温扩增技术引物。
优选地，包括以上所述引物。
优选地，还包括限制性内切酶Xho I、Kpn I和/或BamH I。
优选地，还包括LAMP试剂。
优选地，LAMP试剂为Bst DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶缓冲液、dNTPs混合物、MgSO4、甜菜碱。
最优选的，包括：检测引物、LAMP试剂、限制性内切酶Xho I、限制性内切酶Kpn I、限制性内切酶BamH I以及酶切缓冲液；
LAMP试剂为Bst DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶缓冲液、dNTPs混合物、MgSO4、甜菜碱；
检测引物如SEQ ID NO：1～12所示。
所述试剂盒的使用方法为
S1.LAMP反应
使用进行LAMP反应，使用ddH2O作为阴性模板反应体系为：
反应条件为：温度64℃，反应时间60min。
S2.LAMP反应结果检测
取5μL LAMP产物在SYBR Green I染色、2％琼脂糖凝胶上电泳。
S3.LAMP产物酶切
反应体系为：酶切缓冲液3μL，LAMP产物3μL，Xho I、Kpn I和BamH I各1μL，补充ddH2O至30μL。
反应条件为：37℃酶切1h。
S4.结果判读
LAMP反应结束后，经过琼脂糖凝胶电泳，有明显梯形条带的，则说明样本中至少含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或志贺氏菌中的一种；否则说明样本并不含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌中的任一种。
当琼脂糖凝胶电泳，有明显梯形条带时，取LAMP产物三份，分别使用Xho I、Kpn I和BamH I进行酶切反应，如果LAMP产物能被Xho I部分或全部酶切，则说明样本中含有金黄色葡萄球菌；如果LAMP产物能被Kpn I部分或全部酶切，则说明样本中含有沙门氏菌；如果LAMP产物能被BamH I部分或全部酶切，则说明样本中含有志贺氏菌。
现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的一套检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的特异性引物是针对金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的fimY基因、志贺氏菌的ipaH基因保守序列设计的，适用于环介导等温扩增，能特异、灵敏、快速、简便地检测食品中的微生物并通过酶切加以区分，可进行一次环介导等温扩增之后，进一步将扩增产物进行酶切，经过一次检测判断出待测样品中是否还有以上三种菌，并判断出菌的种类。
本发明基于上述引物组构建的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌检测方法及其试剂盒用于这三种菌的扩增和检测分析，特异性好，灵敏度高，可检测多个细菌的混合样品，进一步通过酶切反应可以区分不同细菌；由于本反应在61～66℃均可进行，进行过程不需要变温，因此在条件简陋的实验室以及发展中国家都可以得到推广。
附图说明
图1为不同退火温度的扩增产物。
图2为不同扩增时间的扩增产物。
图3为LAMP反应的特异性。
图4为LAMP扩增与PCR扩增敏感性对比。
图5为三种菌的LAMP产物交叉酶切。
图6为多重LAMP扩增及限制性内切酶酶切。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 LAMP引物的设计
根据GeneBank上的金黄色葡萄球菌的nuc基因序列、沙门氏菌的fimY基因序列、志贺氏菌的ipaH基因序列，找到保守的区域，设计LAMP引物，每种菌包括4条引物。引物序列见表1，表1是LAMP引物列表。PCR引物采用F3/B3引物。引物序列由上海生物工程有限公司合成。
表1金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌LAMP扩增引物序列(下划线为酶切位点)：
实施例2 LAMP引物反应条件优化
为了摸索LAMP反应时，单菌检测的最佳反应条件，设定在温度为61～66℃，反应时间30min～90min的范围内进行LAMP反应条件的优化。
一、反应温度(退火温度)优化
1、实验操作
分别使用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的DNA，在61～66℃的范围内优化LAMP反应退火温度。细菌DNA使用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒提取，具体操作参照试剂盒说明书。使用ddH2O作为阴性模板。
这里分别单独使用实施例1设计的针对金黄色葡萄球菌、为沙门氏菌和为志贺氏菌的三组引物对相应的菌进行LAMP反应。
反应体系：
LAMP反应条件为：温度61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，反应时间60min。
产物检测：反应结束后，各管分别取5μL LAMP产物在SYBR Green I染色、2％琼脂糖凝胶上电泳。
2、实验结果
结果如附图1所示，a为针对金黄色葡萄球菌的引物以金黄色葡萄球菌DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图；b为针对沙门氏菌的引物以沙门氏菌DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图；c为针对志贺氏菌的引物以志贺氏菌DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图。泳道M为DL2000DNA Marker；1～6分别为61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃；N为阴性对照。金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的LAMP反应在61～66℃都有明显扩增产物。根据电泳结果，选择64℃作为最佳反应温度。
二、反应时间优化
1、实验操作
反应体系及产物检测如上。
LAMP反应条件为：温度64℃，反应时间30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min。
2、实验结果
结果如附图2所示，a为针对金黄色葡萄球菌的引物以金黄色葡萄球菌DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图；b为针对沙门氏菌的引物以沙门氏菌DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图；c为针对志贺氏菌的引物以志贺氏菌DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图。泳道M为DL2000DNA Marker；1～7分别为30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min；N为阴性对照。金黄色葡萄球菌、沙门氏菌在30～90min均有明显扩增产物，志贺氏菌在40～90min有明显扩增产物。根据电泳结果，选择60min作为LAMP反应时间。
因此确定LAMP反应条件：温度64℃，反应时间60min。
实施例3 LAMP反应的特异性
为了检测LAMP引物的特异性，分别单独使用针对每一个菌的引物对不同的菌进行LAMP反应。
1、实验操作
分别使用针对实施例1设计的针对金黄色葡萄球菌、为沙门氏菌和为志贺氏菌的三组引物对4株金黄色葡萄球菌、4株沙门氏菌、3株志贺氏菌、3株大肠杆菌及3株李斯特菌的DNA进行LAMP反应，检测引物特异性检测。上述菌株均为从中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)购得的标准菌株。
将以上菌株分别提取DNA进行LAMP反应检测。
反应体系及产物检测如实施例2。
LAMP反应条件：温度64℃，反应时间60min。
2、实验结果
结果如附图3所示，a为针对金黄色葡萄球菌的引物，泳道M为DL2000DNA Marker，1～17分别为4株金黄色葡萄球菌、4株沙门氏菌、3株志贺氏菌、3株大肠杆菌及3株李斯特菌的DNA为模板，N为阴性对照；b针对沙门氏菌的引物，泳道M为DL2000DNA Marker，1～17分别为4株沙门氏菌、4株金黄色葡萄球菌、3株志贺氏菌、3株大肠杆菌及3株李斯特菌的DNA为模板；N为阴性对照；c为针对志贺氏菌的引物，泳道M为DL2000DNA Marker，1～17分别为3株志贺氏菌、4株金黄色葡萄球菌，4株沙门氏菌、3株大肠杆菌及3株李斯特菌的DNA为模板，N为阴性对照。针对三种菌的LAMP引物都能够特异性扩增其对应菌株的DNA，且不能扩增非对应DNA。LAMP反应具有特异性。
实施例4 LAMP反应的敏感性
分别单独使用实施例1设计的针对金黄色葡萄球菌、为沙门氏菌和为志贺氏菌的三组引物对相应的菌进行LAMP反应。
1、实验操作
LAMP反应体系及产物检测实施例2。
LAMP反应条件：温度64℃，反应时间60min。
PCR反应体系：2×rTaq PreMix(Takara)12.5μL，F3/B3各5pmol，模板DNA1μL，补充ddH2O至25μL。
PCR反应条件：
2、实验结果
金黄色葡萄球菌PCR目的产物为181bp、沙门氏菌PCR目的产物为176bp、志贺氏菌PCR目的产物为197bp。产物检测见实施例2。
如图4所示，a为针对金黄色葡萄球菌的引物以金黄色葡萄球菌DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图；b为针对沙门氏菌的引物以沙门氏菌DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图；c为针对志贺氏菌的引物以志贺氏菌DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图。上图为PCR产物，下图为LAMP产物。泳道M为DL2000DNA Marker，1～6分别是模板浓度为原始DNA浓度稀释1、10、102、103、104、105倍，N为阴性对照。金黄色葡萄球菌LAMP检测极限为103倍稀释，PCR检测极限为102倍稀释；沙门氏菌分别为104倍稀释及103倍稀释；志贺氏菌分别为104倍稀释及103倍稀释。在本实施例中，LAMP检测技术的敏感度均比PCR技术检出浓度高一个数量级。
实施例5 LAMP产物酶切特异性检测
1、实验操作
分别使用针对实施例1设计的针对金黄色葡萄球菌、为沙门氏菌和为志贺氏菌的三组引物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌LAMP反应，在分别使用限制性内切酶XhoI、Kpn I和BamH I对LAMP反应产物进行酶切，以检测限制性内切酶Xho I、Kpn I和BamH I对不同菌的LAMP反应产物均有特异性。
反应体系及产物检测实施例2。
LAMP反应条件：温度64℃，反应时间60min。
LAMP产物酶切体系：缓冲液3μL，LAMP产物3μL，限制性内切酶(Xho I、Kpn I或BamHI)1μL，补充ddH2O至30μL。
2、实验结果
如附图5所示，M为DL2,000DNA Marker。
泳道1～6中，1和2为针对金黄色葡萄球菌的引物对金黄色葡萄球菌DNA进行扩增产物，3和4为针对沙门氏菌的引物对沙门氏菌DNA进行扩增产物，5和6为针对志贺氏菌的引物对志贺氏菌DNA进行扩增产物，其中2、4和6泳道为LAMP产物进行Xho I酶切后产物，1、3和5为LAMP产物不进行酶切；
泳道7～12中，7和8为针对金黄色葡萄球菌的引物对金黄色葡萄球菌DNA进行扩增产物，9和10为针对沙门氏菌的引物对沙门氏菌DNA进行扩增产物，11和12为针对志贺氏菌的引物对志贺氏菌DNA进行扩增产物，其中8、10和12泳道为LAMP产物进行Kpn I酶切后产物，7、9和11为LAMP产物不进行酶切；
泳道13～18中，13和14为针对金黄色葡萄球菌的引物对金黄色葡萄球菌DNA进行扩增产物，15和16为针对沙门氏菌的引物对沙门氏菌DNA进行扩增产物，17和18为针对志贺氏菌的引物对志贺氏菌DNA进行扩增产物，其中14、16和18泳道为LAMP产物进行BamH I酶切后产物，13、15和17为LAMP产物。
结果显示：Xho I仅能酶切金黄色葡萄球菌LAMP产物，Kpn I仅能酶切沙门氏菌LAMP产物，BamH I仅能酶切志贺氏菌LAMP产物。
实施例6多重LAMP扩增及限制性内切酶酶切
1、实验操作
在同一反应体系中对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的混合DNA样本进行LAMP检测，得到LAMP产物后使用限制性内切酶进行酶切检测，以判断具体菌种。使用ddH2O作为阴性模板
LAMP反应体系：
反应条件及结果检测见实施例3。
LAMP产物酶切体系：
补充ddH2O至30μL。
37℃酶切1h。
2、实验结果
如附图6所示，M为DL2,000DNA Marker，1为多重LAMP产物，2为Xho I酶切多重LAMP产物后条带，3为Kpn I酶切多重LAMP产物后条带，4为BamH I酶切多重LAMP产物后条带，5为Xho I/Kpn I/BamH I共同进行LAMP产物酶切后的条带。从附图6可知，单酶酶切时，三种内切酶均能够切动多重LAMP产物，但同时又有部分产物未被切动；三种酶同时酶切时，LAMP产物完全被酶切，说明产物中同时含有三种菌的LAMP产物。
结果表明，本发明中的多重LAMP及酶切能够有效检测上述三种菌的DNA模板混合物，且能够便捷判断出模板中是否含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或志贺氏菌。
实施例7一种检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的试剂盒
基于上述引物组及其检测方法，构建了一种检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的试剂盒，既可以用时检测样本是否含有以上三种菌，又可以对菌种进行鉴别。
组分包括：检测引物、LAMP试剂、限制性内切酶Xho I、限制性内切酶Kpn I、限制性内切酶BamH I以及酶切缓冲液；
LAMP试剂为Bst DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶缓冲液、dNTPs混合物、MgSO4、甜菜碱；
检测引物如SEQ ID NO：1～12所示：
其中，nuc-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，
nuc-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，
nuc-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，
nuc-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，
fimY-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，
fimY-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，
fimY-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，
fimY-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，
ipaH-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，
ipaH-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，
ipaH-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，
ipaH-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
使用方法：
(1)LAMP反应
使用进行LAMP反应，使用ddH2O作为阴性模板反应体系为：
反应条件为：温度64℃，反应时间60min。
(2)LAMP反应结果检测
取5μL LAMP产物在SYBR Green I染色、2％琼脂糖凝胶上电泳。
(3)LAMP产物酶切
反应体系为：
补充ddH2O至30μL。
反应条件为：37℃酶切1h。
(4)结果判读
LAMP反应结束后，经过琼脂糖凝胶电泳，有明显梯形条带的，则说明样本中至少含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或志贺氏菌中的一种；否则说明样本并不含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌中的任一种。
当琼脂糖凝胶电泳，有明显梯形条带时，取LAMP产物三份，分别使用Xho I、Kpn I和BamH I进行酶切反应，如果LAMP产物能被Xho I部分或全部酶切，则说明样本中含有金黄色葡萄球菌；如果LAMP产物能被Kpn I部分或全部酶切，则说明样本中含有沙门氏菌；如果LAMP产物能被BamH I部分或全部酶切，则说明样本中含有志贺氏菌。
序列表
<110> 东莞市农业科学研究中心
东莞理工学院
<120> 一种同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaagatggt agaaaatgch aag 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgttcatgtg tattgttagg tt 22
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gacgtgctat ttcttttaaa gaggcagctt tagccgtact gac 43
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctggaaaaa ctcagtgcct 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggaacatttc cctgccca 18
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgacacggtc ctcacagctc ggatccttcg acagcagtct ttcgc 45
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atctccggaa aaccctcctg gtagcgccgg tatcattatc ga 42
Claims (10)
1.一组基于环介导等温扩增技术同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的引物组，其特征在于，包括分别针对金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的fimY基因、志贺氏菌的ipaH基因进行扩增的引物。
2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～12所示，或为SEQ ID NO：1～12所示的核苷酸序列的互补序列。
3.权利要求1所述引物组在检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌或制备检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的试剂盒中的应用。
4.一种同时检测待测样品金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的方法，其特征在于，以待测样品的核酸为模板，利用权利要求1或2所述引物组进行环介导等温扩增，根据扩增产物判断待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和/或志贺氏菌。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，环介导等温扩增的条件为反应温度为61～66℃，反应时间为40～90min。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，根据扩增产物判断待测样品中是否含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和/或志贺氏菌的方法为：将扩增产物利用显色法或琼脂糖凝胶电泳法或实时荧光法，判定样品中是否含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或志贺氏菌中的任一种或几种。
7.根据权利要求4或6所述的方法，其特征在于，扩增产物使用Xho I进行酶切，即可判定样品中是否含有金黄色葡萄球菌；扩增产物使用Kpn I进行酶切，即可判定样品中是否含有沙门氏菌；扩增产物使用BamH I进行酶切，即可判定样品中是否含有志贺氏菌。
8.一种同时检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌的试剂盒，其特征在于，包括金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的fimY基因和志贺氏菌中的ipaH基因或其片段的多重环介导等温扩增技术引物。
9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述引物。
10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，还包括限制性内切酶Xho I、Kpn I和/或BamH I。
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