CN113621723A - 口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的lamp检测引物体系、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的lamp检测引物体系、检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物体系、检测试剂盒及检测方法，引物体系包括沙门氏菌23S rRNA引物组、沙门氏菌sseL引物组、金黄色葡萄球菌23S rRNA引物组和金黄色葡萄球菌Coa引物组4组引物组，每组引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP；引物体系包括SEQ IDNo.1～SEQ ID No.16的引物。本发明实现利用LAMP法对口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测，检测过程对硬件环境要求不高，检测流程简单，且检测时间快；具有简便高效、结果准确、成本低的优点。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，特别涉及一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物体系、检测试剂盒及检测方法。
背景技术
口用型无烟气烟草制品通俗称为口含烟，主要包括胶基烟、袋装口含烟、含化烟等，在食品安全检测中，微生物检验有菌落总数、大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。沙门氏菌、金黄色葡萄球菌检测通常按照GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》、GB 4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》进行，这些方法中培养为纯人工操作，在菌落形态特征的观察判断上较为依赖经验；检测时间上，阴性结果需要4d，阳性结果需用生化法辅助确认，时间延长到5至7d。另一方面，生化法检测一般采用Biomérieux公司的Vitek和Vidas设备，价格分别在80w、60w以上，且仍需人工增菌、分离菌株以保证准确性；检测时间上，阴性结果2d，阳性结果又需用培养法确认。
基因扩增检测技术相对传统方法大幅缩短时间、节省大量操作。基因扩增检测技术以温控程序区别可粗分为变温、恒温两类，变温技术以PCR为代表，原位检测时间约0.5 –1d、增菌检测约2d。PCR法需建设符合GB/T 27403要求实验室，通常需50m2场地、￥30万装修费用；关键仪器PCR仪或qPCR仪的报价在5万或30万以上；离心机、移液器等配套仪器也需上万元；DNA提取、反应液配制、反应条件调节等操作需熟练人员；普通样品检测1–2个基因，收费约￥300–500/批次。恒温扩增检测技术如LAMP、HAD、 RPA/RAA等具有反应温度单一、不受热循环仪制约的核心特点，其中大多数方法可在一般环境中的普通恒温设备中运行。
发明内容
为了解决现有沙门氏菌、金黄色葡萄球菌检测方法对硬件环境要求高、对操作人员的专业要求高，成本高、耗时长的问题。本发明提供一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP(环介导等温扩增)检测引物体系、检测试剂盒及检测方法，实现利用 LAMP法对口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测，检测过程对硬件环境要求不高，检测流程简单，且检测时间快；具有简便高效、结果准确、成本低的优点。
本发明提供了一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物体系，引物体系包括沙门氏菌23S rRNA引物组、沙门氏菌sseL引物组、金黄色葡萄球菌23S rRNA 引物组和金黄色葡萄球菌Coa引物组4组引物组，每组引物组包括外引物F3、外引物 B3、内引物FIP和内引物BIP；其中，
沙门氏菌23S rRNA引物组中，外引物F3如SEQ ID No.1所示，外引物B3如SEQ IDNo.2所示，内引物FIP如SEQ ID No.3所示，内引物BIP如SEQ ID No.4所示；
沙门氏菌sseL引物组中，外引物F3如SEQ ID No.5所示，外引物B3如SEQ ID No.6所示，内引物FIP如SEQ ID No.7所示，内引物BIP如SEQ ID No.8所示；
金黄色葡萄球菌23S rRNA引物组中，外引物F3如SEQ ID No.9所示，外引物B3 如SEQ ID No.10所示，内引物FIP如SEQ ID No.11所示，内引物BIP如SEQ ID No.12 所示；
金黄色葡萄球菌Coa引物组中，外引物F3如SEQ ID No.13所示，外引物B3如SEQ IDNo.14所示，内引物FIP如SEQ ID No.15所示，内引物BIP如SEQ ID No.16所示。
采用上述方案，LAMP引物体系根据沙门氏菌23S rRNA与毒力基因sseL，金黄色葡萄球菌23S rRNA与毒力基因Coa设计引物，同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的毒力基因与rRNA，经验证能有效提高检测准确性；且特异性好、检测灵敏度高。
本发明还提供一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，包括如本发明提供的LAMP引物体系；LAMP试剂：适用于引物体系；阳性对照，包括浓度为105copies/μL的沙门氏菌及金黄色葡萄球菌源性DNA，且DNA中包括每组引物组中的F3引物序列和B3引物序列的扩增序列；阴性对照，非靶基因源性DNA；空白对照，三蒸水；反应条件为60～65℃条件下反应20～60min，然后80℃条件下反应10min。
采用上述方案，建立的口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，可实现对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的快速检测，并产生肉眼可观测阳性现象。
根据本发明的另一具体实施方式，本发明提供的LAMP检测试剂盒，引物体系中每组引物组中各引物的浓度分别为：F3引物2μmol/L、B3引物2μmol/L、FIP引物16μmol/L、 BIP引物16μmol/L。
LAMP检测试剂盒的反应体系包括：LAMP试剂10μL～15μL，一组引物组1μL，引物组对应的阳性对照、阴性对照、空白对照、样品DNA中的一种1μL。
根据本发明的另一具体实施方式，本发明提供的LAMP检测试剂盒，LAMP试剂包括：浓度为20mmol/L的Tris-HCl、10mmol/L的KCl、10mmol/L的(NH4)2SO4、 6mmol/L的MgCl2、2mmol/L的MgSO4、1.4mmol/L的dNTP、0.1％的Triton X-100、 1.2mol/L的Betaine。
LAMP检测试剂盒的快捷试剂的制备方法包括：在反应管中加入LAMP试剂，一组引物组中浓度为1.6μmol/L的FIP和BIP引物、浓度为0.02μmol/L的B3引物和F3引物，8UBst聚合酶，质量体积比为15％海藻糖的三蒸水溶液25μL；冻干后封闭储存于- 20℃的条件下；使用前开启，并加入24μL的三蒸水溶解冻干试剂，再加入阳性对照、阴性对照、空白对照、样品DNA中的一种1μL。
根据本发明的另一具体实施方式，本发明提供的LAMP检测试剂盒，反应体系还包括变色剂；检测时，发生变色表明检测结果为阳性，未发生变色表明检测结果为阴性。
根据本发明的另一具体实施方式，本发明提供的LAMP检测试剂盒，反应体系还包括荧光DNA染料；检测时，经荧光PCR仪检测获得荧光图谱为S型扩增曲线表明检测结果为阳性，经荧光PCR仪检测获得荧光图谱不是S型扩增曲线表明检测结果为阴性。
根据本发明的另一具体实施方式，本发明提供的LAMP检测试剂盒，检测时，浊度仪检测扩增值超过阈值时表明检测结果为阳性，浊度仪检测扩增值未超过阈值时表明检测结果为阴性。
本发明还提供一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，包括以下步骤：
S1：提取待测口含烟中的样品DNA；
S2：样品DNA作为反应模板，采用本发明提供的LAMP检测试剂盒进行LAMP 扩增和LAMP检测。
采用上述方案，采用LAMP法快速检测口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，检测时间仅需1h、成本控制在￥50/批次以内、设备仅需普通水浴锅或孵育器、结果判断只需通过肉眼观察明显的橙/绿或紫/蓝变色现象，特别适于现场快检、基层快检等情况。
根据本发明的另一具体实施方式，本发明提供的LAMP检测方法，提取待测口含烟的样品DNA的步骤包括：取口含烟样品25g，加入25mL的三蒸水拍击均质，在 95℃孵育10min、10krpm离心10min、取上清液作为DNA样品液。
采用上述方案，提供一种快速提取口含烟中细菌DNA的方法，通过加热裂解、冷却复性等简单步骤，获得粗提DNA，可满足LAMP法对样品DNA的质量要求。且方法对设备要求很低，可在15min内从口含烟中获得足够LAMP实验的细菌DNA。
根据本发明的另一具体实施方式，本发明提供的LAMP检测方法，LAMP检测的步骤包括：
S201：质控判断，所有引物组对应的阳性对照结果为阳性，阴性对照和空白对照结果为阴性，表明LAMP检测试剂盒有效，进入样品检测结果判断步骤。
S202：样品检测结果判断，当样品DNA的沙门氏菌23S rRNA和沙门氏菌sseL检测结果为阴性，表明该样品不含有沙门氏菌；当样品DNA的沙门氏菌23S rRNA和沙门氏菌sseL检测结果为阳性，表明该样品含有沙门氏菌；当样品DNA的金黄色葡萄球菌 23S rRNA和金黄色葡萄球菌Coa检测结果为阴性，表明该样品不含有金黄色葡萄球菌；当样品DNA的金黄色葡萄球菌23S rRNA和金黄色葡萄球菌Coa检测结果为阳性，表明该样品含有金黄色葡萄球菌。
附图说明
图1为本发明实施例2LAMP检测试剂盒变色染料反应验证的结果；
图2为本发明实施例3LAMP检测方法采用荧光法检测口含烟沙门氏菌和金黄色葡萄球菌获得阳性对照、阴性对照的荧光图谱；
图3为本发明实施例3LAMP检测方法采用荧光法检测口含烟沙门氏菌和金黄色葡萄球菌获得样品、空白对照的荧光图谱；
图4为本发明实施例3LAMP检测方法采用浊度法检测口含烟沙门氏菌和金黄色葡萄球菌获得阳性对照、阴性对照的浊度变化曲线；
图5为本发明实施例3LAMP检测方法采用浊度法检测口含烟沙门氏菌和金黄色葡萄球菌获得样品、空白对照的浊度变化曲线。
具体实施方式
为了下面的详细描述的目的，应当理解，除了在任何操作实例中，或者以其他方式指出的情况下，表示例如说明书和权利要求中使用的成分的量的所有数字应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非相反指出，否则在以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是根据本申请所要获得的期望性能而变化的近似值。至少并不是试图将等同原则的适用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的个数并通过应用普通舍入技术来解释。
本申请中使用的术语仅用于描述具体实施方式的目的并且不理解为限制性的。如本文中使用的，单数形式“一个(种)”和“该()”也意图包括复数形式，除非上下文清楚地另外指明。表述例如“......的至少一个(种)”当在要素列表之前或之后时修饰整个要素列表，而不修饰该列表的单独要素。
进一步，本申请中使用的术语“包括”或“包含”当用在本说明书中时，表明存在所陈述的特征、区域、整体、步骤、操作、元件、和/或组分，但不排除存在或增加一种或多种另外的特征、区域、整体、步骤、操作、元件、组分、和/或其集合。
如本申请中使用的“约”或“大约”包括所描述的值并且意味着例如本领域普通技术人员考虑到所讨论的测量和与具体量的测量有关的误差(即，测量系统的限制)而确定的对于具体值的可接受的偏差范围内。除非另外指明，所公开的所有参数范围包括端点值及其间的所有值。
在本发明的描述中，如无特殊说明，术语的含义与本领域技术人员一般理解的含义相同，但如有不同，以本发明的定义为准；如无特殊说明，试验方法均为常规方法；如无特殊说明，本发明中的所用的原料及试验材料均为可常规购买得到的。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
提供一种口含烟中沙门氏菌(后文简称沙门)和金黄色葡萄球菌(后文简称金葡)的 LAMP检测引物体系。
需要说明的是，在基因检测中，致病菌的分型、病理检测一般选用毒力基因，致病菌的分类、检测一般选用rRNA。首先，致病菌中的毒力基因家族既是毒性机理的源头，也是致病菌的基因特征，具有很强的特异性。其次，rRNA区域作为分类学上最常用的分子钟具有高保守性、多拷贝等特点，其中23S rRNA长度相对固定，适合进行基因扩增检测；长度约为16S rRNA两倍，引物设计区域更多；23S rRNA变异性高于16S rRNA，更适于相近种属间的鉴别分析；随着测序技术快速发展，kb级长度不再是测序瓶颈，基因数据库中23SrRNA数据已较为丰富。再次，致病菌的毒力基因种类多，在相关研究报道中毒力基因的检测覆盖率皆有不同；相近种属间rRNA序列相似度很高，有时菌株不一定能通过几百bp的rRNA序列片段检测到种；因此，同时检测毒力基因与rRNA，能有效提高准确性。
基于上述原理，本发明对沙门和金葡采取同时检测毒力基因、rRNA的方法，其中LAMP检测引物体系对比筛选过程如下。
用相关软件如Lamp designer软件对沙门和金葡的16SrRNA、23SrRNA设计引物，筛选获得沙门、金葡的16SrRNA、23SrRNA的LAMP引物各5组，具体可以通过用Primer Blast网站筛选，编号为A至T，具体如表1所示。
用同样方式对沙门的毒力岛基因invA、sseL、mgtC、siiD、sopB，毒力质粒基因spvR，鞭毛基因bcfC，肠毒素基因stn等，金葡的肠毒素基因sea、溶血素基因hlA、杀白细胞素基因pvl、凝集因子基因clfA、中毒休克毒素基因tsst1、表皮剥落素基因eta、耐热核酸酶基因nuc、血浆凝固酶基因Coa等设计引物，筛选获得每种基因各1组，具体如表1 所示。
用沙门和金葡菌株各30株作为阳性菌株对照、用含有沙门和金葡菌株的30个活性菌群作为阳性菌群对照、用30株其他致病菌株为阴性菌株对照、用不含有沙门和金葡菌株的30个活性菌群为阴性菌群对照。用BPW、7.5％NaCl肉汤培养基进行阳性菌株增菌，用LB液体培养基对阳性菌群进行增菌，增菌液用GB 4789.4-2016、GB 4789.10-2016确认含有沙门和金葡，然后提取DNA对引物组进行验证。结果rRNA引物组中编号A、F、 L、Q阳性菌群检出率100％，毒力基因引物组中sseL、Coa检出率大于95％，具体如表 1所示。
表1阳性菌株、菌群筛选验证
以30株其他致病菌株：志贺氏菌、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、β型溶血性链球菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌、出血性大肠埃希氏菌O157:H7、阪崎肠杆菌各3株作为阴性菌株对照，以不含有沙门和金葡菌株的30个活性菌群为菌群阴性对照，采用现行GB 4789标准中对上述致病菌株增菌所用培养基进行阴性菌株增菌，用LB液体培养基对阴性菌群进行增菌，然后提取DNA对上述引物组合进行验证，结果如表2；可见sseL、Coa假阳性率0％；rRNA引物组中， F、Q假阳性率小于5％。
表2阴性菌株、菌群筛选验证
因此，引物系列以sseL与F搭配、Coa与Q搭配，能最大程度地发现、鉴别阳性、阴性的菌株、菌群，检测结果鉴别表如表3所示。当沙门23S rRNA(表中23S F)和sseL 均为阴性，表明样品中不含有沙门；当沙门23S rRNA和sseL均为阳性，表明样品中含有沙门；当金葡23S rRNA(表中23S Q)和Coa均为阴性，表明样品中不含有金葡；当金葡23S rRNA和Coa均为阳性，表明样品中含有金葡。考虑到微生物的多样性、突变性，那么当沙门23S rRNA和sseL中一种为阴性而另一种为阳性或金葡23S rRNA和Coa 中一种为阴性而另一种为阳性时，建议进一步增加培养法或生化法进行辅助确认。
表3检测结果鉴别表
图中：P：阳性、N：阴性
综上，本申请最终筛得sseL引物组、Coa引物组、沙门23SrRNA引物组、金葡23SrRNA引物组4组，综合准确率可达100％，其中引物序列如表4，检测位点示例如表 5。
表4 LAMP检测引物体系
表5检测位点示例
采用上述方案，LAMP引物体系根据沙门氏菌23S rRNA与毒力基因sseL，金黄色葡萄球菌23S rRNA与毒力基因Coa设计引物，同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的毒力基因与rRNA，经验证能有效提高检测准确性；且特异性好、检测灵敏度高。
实施例2
提供口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒的构建及验证的方法。
LAMP检测试剂盒包括实施例1的表4所示的引物体系，引物可通过具有引物合成能力的公司合成，本实施例向Thermo Fisher公司的Invitrogen部门购买合成服务。
LAMP检测试剂盒的构建与验证包括：
(1)配制引物：将每种引物干粉稀释至100μmol/L作为储备液，分别配制出沙门23S rRNA、sseL，金葡23S rRNA、Coa共4种LAMP引物组使用液，其中FIP、BIP引物浓度均为16μmol/L，F3、B3引物浓度均为2μmol/L。
(2)阳性对照：取4个引物组的F3、B3引物储备液，分别稀释至10μmol/L。分别接种沙门(CMCC(B)50071)、金葡(ATCC6538)至BPW、7.5％NaCl肉汤培养基，36℃、增菌18h后用细菌DNA提取试剂盒提取DNA，分别用上述稀释好的引物分别扩增目的基因，将每个扩增的目的条带切胶回收后转入pMV-20T载体，用感受态E.coli细胞JM109 复制，提取质粒并稀释至106copies/μL，最后再将4种质粒稀释混制成105copies/μL的阳性质粒对照。
(3)阴性对照：非靶基因源性DNA，即没有本发明选定基因沙门23S rRNA、sseL，金葡23S rRNA、Coa的DNA，具体如E.coli源性DNA。
(4)空白对照：3d H2O(即三蒸水)。
(5)在一种实施方式中，反应体系包括：适用于引物体系的外购LAMP试剂10 ～15μL，一组引物组使用液1μL，引物组对应的阳性对照、阴性对照、空白对照、样品 DNA中的一种1μL，三蒸水，总体积20～25μL。需要说明的是，反应体系中不同品牌的外购LAMP试剂要求不同，其加入量以及反应体系的总体积不同。例如，其中一种反应体系具体包括：外购LAMP试剂10μL，一组引物组使用液1μL，引物组对应的阳性对照、阴性对照、空白对照、样品DNA中的一种1μL，三蒸水8μL，总体积20μL。
或者在另一种实施方式中，可以直接配置快捷试剂，其中LAMP试剂包括浓度为20mmol/L Tris-HCl、10mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)2SO4、6mmol/L MgCl2、2mmol/L MgSO4、1.4mmol/L dNTP、0.1％Triton X-100、1.2mol/L Betaine。快捷试剂的制备方法包括：在0.1 或0.2mL反应管中加入LAMP试剂，一组引物组中浓度为1.6μmol/L FIP和BIP、 0.02μmol/L B3和F3，8U Bst聚合酶、15％海藻糖(g/mL)的3d H2O溶液25μL；冻干后用塑料薄膜封闭，盖好试剂管，储存于-20℃环境，全程避免暴力操作以防冻干试剂与变色剂交叉污染。使用前开启薄膜，加入24μL的3d H2O溶解管内冻干试剂，再加入1μL 阳性、阴性、空白对照或样品DNA，小心盖好试剂管，全程避免剧烈震动以防变色剂落下终止反应。
(6)反应条件：反应条件为60～65℃条件下反应20～60min，例如可以为65℃反应30min；然后在80℃条件下反应10min。孵育设备为Eppendorf Thermo Mixer C金属浴。
(7)检测方法：根据对检测结果的观测方式还可以在反应体系中添加变色染料、荧光DNA染料等。
其中添加变色染料如DNA嵌合染料，更为具体地可以为SYBR Green I染料，本实施例中购买于北京索莱宝科技有限公司；反应发生变色表明检测结果为阳性，未发生变色表明检测结果为阴性。其中若为配置便携快捷试剂，则在管盖内滴加变色染料溶液后再进行冻干，在使用时反应结束后颠倒反应管，使管顶变色剂溶解变色。
反应体系还可以添加荧光DNA染料；检测时，经荧光PCR仪检测获得荧光图谱为 S型扩增曲线表明检测结果为阳性，经荧光PCR仪检测获得荧光图谱不是S型扩增曲线表明检测结果为阴性。
反应体系还可以在不添加上述成分的基础上，检测时，浊度仪检测扩增超过阈值表明检测结果为阳性，浊度仪检测扩增未超过阈值表明检测结果为阴性；也可以通过肉眼观察有白色沉淀时表明检测结果为阳性，无白色沉淀时表明检测结果为阴性。
(8)检测结果：如图1所示，显示了本实施例添加变色反应验证的结果，其中每组阳性对照发生变色，橙色染料变为绿色，结果为阳性；阴性对照、空白对照未发生变色，结果为阴性。结果符合实验预期。将本实施例的样品按照GB 4789.4-2016、GB4789.10- 2016进行检验，实验结果一致；本试剂盒送至省内同行业检测单位，实验结果一致。
采用上述方案，建立的口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒转基因，可实现对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的快速检测，并产生肉眼可观测阳性现象。
实施例3
提供一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，包括以下步骤：
S1：提取待测口含烟中的样品DNA；
本发明还可用CTAB法、SDS法、DNA提取试剂盒、核酸提取工作站等方法提取样品DNA，其中CTAB法、SDS法虽然纯度和得率较高，但比较依赖经验，操作要求高、提取时间长、处理样品量少；DNA提取试剂盒、核酸提取工作站等虽然具有模式化、便捷化的优点，但存在成本高、时间长的缺点。还可以用其他核酸快提法迅速提取，如煮沸裂解、碱解复性、滤纸吸附、微针技术等，具有设备门槛低、试剂成本低、提取时间快的优点。
本发明的一种具体实施方式采用煮沸裂解法提取DNA，为一种简便的细菌DNA提取方法，通过加热裂解、冷却复性等简单步骤，可从普通样品中获得粗提DNA。
具体地，取25g样品，加入25mL 3dH2O拍击匀质；95℃孵育10min；10krpm离心10min；取上清作为DNA样品液。
若上述方法无法提取到可供检测的DNA，可对口含烟颗粒取两份25g平行样品，分别加入225mL BPW、7.5％NaCl肉汤拍击匀质，36℃、增菌18h后，取1mL在95℃孵育10min；10krpm离心10min；取上清液稀释适当倍数(如2×、5×、10×)作为DNA 样品液。
S2：样品DNA作为反应模板，采用如实施例2的LAMP检测试剂盒进行LAMP扩增和LAMP检测。
其中引物、阳性对照、阴性对照、空白对照等均按实施例2中的试剂盒成分，LAMP试剂采用外购的LAMP试剂，本实施例中为广州迪澳DNA扩增试剂。
浊度法配制体系：LAMP试剂反应液RM(2×)12.5μL、实施例2的LAMP引物组使用液1μL、Bst聚合酶1μL、样品DNA液1μL、3d H2O补足至25μL。浊度仪型号为 LA-500，反应时间1h。判定方法为：浊度结果为扩增值超过阈值表明结果阳性，浊度结果为扩增值未超过阈值表明结果阴性。需要说明的是，阈值一般人为指定，主要根据浊度变化曲线起峰、阴阳对照确定，扩增值超过阈值时曲线显著起峰，扩增值未超过阈值时曲线如基线一般接近于0。
荧光法配制体系：LAMP试剂反应液RM(2×)12.5μL、实施例2LAMP引物组使用液1μL、Bst聚合酶1μL、荧光染料1μL、样品DNA液1μL、3d H2O补足至25μL。荧光PCR型号为ABI7500，反应程序为63℃ 30s，63℃ 15s、63℃ 45s、40循环，FAM 通道。判定方法为：荧光图谱为S型扩增曲线表明结果阳性，荧光图谱无S型扩增曲线表明结果阴性。
具体检测步骤为如下。
S201：质控判断，所有引物组对应的阳性对照结果为阳性，阴性对照和空白对照结果为阴性，表明LAMP检测试剂盒有效，进入样品检测结果判断步骤。
S202：样品检测结果判断，当样品DNA的沙门氏菌23S rRNA和沙门氏菌sseL检测结果为阴性，表明该样品不含有沙门氏菌；当样品DNA的沙门氏菌23S rRNA和沙门氏菌sseL检测结果为阳性，表明该样品含有沙门氏菌；当样品DNA的金黄色葡萄球菌23S rRNA和金黄色葡萄球菌Coa检测结果为阴性，表明该样品不含有金黄色葡萄球菌；当样品DNA的金黄色葡萄球菌23S rRNA和金黄色葡萄球菌Coa检测结果为阳性，表明该样品含有金黄色葡萄球菌。
进一步地，当样品DNA的沙门氏菌23S rRNA与沙门氏菌sseL检测结果不一致和/或样品DNA的金黄色葡萄球菌23S rRNA与金黄色葡萄球菌Coa检测结果不一致，采用培养法或生化法进行辅助确认(参见实施例1表3)。
本实施例采用荧光法配制体系反应结果如图2-3，其中图2中1-4为沙门23S rRNA、sseL，金葡23S rRNA、Coa阳性对照，荧光图谱为S型扩增曲线，因此结果均为阳性；图2中5-8为阴性对照，荧光图谱无S型扩增曲线，表明结果均为阴性。图3中9-12为样品沙门23SrRNA、sseL，金葡23S rRNA、Coa的荧光图谱，为S型扩增曲线表明均为阳性；按照GB 4789.4-2016、GB 4789.10-2016进行验证，实验结果一致；图3中13-16 为空白对照，荧光图谱结果均为阴性，符合质控要求。
本实施例采用浊度法配制体系反应结果如图4-5，其中图4中1-4为沙门23S rRNA、sseL，金葡23S rRNA、Coa阳性对照，浊度变化曲线结果为扩增值超过阈值，因此结果均为阳性；图4中5-8为阴性对照，浊度变化曲线结果为扩增值未超过阈值，表明结果均为阴性。图5中9-12为样品沙门23S rRNA、sseL，金葡23S rRNA、Coa的浊度变化曲线，扩增值超过阈值表明均为阳性；按照GB 4789.4-2016、GB 4789.10-2016进行验证，实验结果一致；图5中13-16为空白对照，浊度结果均为阴性，符合质控要求。
采用上述方案，首先提供了一种快速提取细菌DNA的煮沸法，对设备要求很低，可在15min内从口含烟中获得足够LAMP实验的细菌DNA。其次本发明提供的方法已应用于本单位相关检测中(检出限10CFU/25g)，在另一家同行业检测单位也已验证通过，上百批次样品无漏检、误检情况，与标准方法检测结果相同，表明了较好的实用价值。
实施例4
将本发明口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒与PCR法、 qPCR法进行对比，具体步骤如下：
(1)样品：选取口含烟样品4kg，平均分为1kg/份的四份#1、#2、#3、#4。
(2)#1本申请方法：采用实施例3的LAMP检测方法，其中采用煮沸裂解法提取DNA。
(3)#2qPCR法：按照发明专利ZL201710582031.6公开的“序列表”合成沙门、金葡的16S rRNA引物、探针；qPCR试剂为ABI Path-IDTM qPCR Master Mix；设备： ABI One StepPlus；反应参数按qPCR试剂说明书。
(4)#3生化法：用Biomérieux公司设备vidas、vitek操作手册进行。
(5)#4按GB 4789.4-2016、GB 4789.10-2016(第一法)检测。
上述方法结果分别为沙门、金葡阳性。方法效率及成本对照结果如表6：
表6 LAMP与PCR、qPCR、培养法效率及成本对照表
根据上表可以看出，本申请方法流程仅1h就获得结果，试剂便宜，各环节操作简单；采用肉眼观察结果时，设备要求低至振荡器、离心机、水浴锅等便宜仪器。qPCR法需2.5h；还需合成探针，价格一般为引物10倍；qPCR仪器一般在30万元以上。生化法一般采用Vitek与Vidas联用，价格分别在80w、60w以上，且仍需人工增菌、分离菌株以保证准确性。传统培养法基本为纯人工操作，工作量很大；培养时间很长，阴性4d、阳性7d；在菌落形态特征的观察判断上较为依赖经验，耗时耗力；一般为节省人力、避免误判，阳性结果还需用PCR或生化法辅助确认；因此，可见本申请方法简便高效。
本发明提供的LAMP检测引物体系、检测试剂盒及检测方法仅对沙门氏菌中23SrRNA和sseL基因、金黄色葡萄球菌中23S rRNA和Coa基因进行特异性扩增，并产生可观测现象，适用于口含烟中的沙门、金葡快速检测，具有一定实用价值。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 贵州中烟工业有限责任公司
<120> 口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物体系、检测试剂盒及检
测方法
<130> 2021.9.7
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（RenGongXuLie）
<400> 1
ggctaaacca tgcaccgaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（RenGongXuLie）
<400> 2
gggcttttca cccgcttta 19
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（RenGongXuLie）
<400> 3
ctttgacgtc gcttcgctcc gagcgaacgt atcacccaag a 41
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（RenGongXuLie）
<400> 4
tcgttgggta ggggagcgtt ctcagcattc gcacttctga t 41
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（RenGongXuLie）
<400> 5
gtggaaaaag ctacatgcc 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（RenGongXuLie）
<400> 6
gaggtgattc ttgagcca 18
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列（RenGongXuLie）
<400> 7
ggtcgcccat aattttatgt gctatcttcc agattacttt atatggcc 48
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 8
agttcgctca gacagatcaa gagctagctc atctgacgac 40
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 9
ccctctcggg ttaccgaatt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（RenGongXuLie）
<400> 10
ggctgcttct aagccaacat 20
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 11
cgaacacgga ccttatcacc cacagacaaa ctccgaatgc ca 42
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 12
aacagcccag accaccagct aacgccacat ccttttccac 40
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（RenGongXuLie）
<400> 13
gatgctggta caggtatcc 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（RenGongXuLie）
<400> 14
tttgcatgtg ttgttacgt 19
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（RenGongXuLie）
<400> 15
gcgtttgttt ctgatggctt attgagtgaa tacaacgatg gaacat 46
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（RenGongXuLie）
<400> 16
taacgacaaa tcaagatggc acagcatttg ttttgcttgg tttg 44
Claims (10)
1.一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物体系，其特征在于，所述引物体系包括沙门氏菌23S rRNA引物组、沙门氏菌sseL引物组、金黄色葡萄球菌23S rRNA引物组和金黄色葡萄球菌Coa引物组4组引物组，每组所述引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP；其中，
所述沙门氏菌23S rRNA引物组中，所述外引物F3如SEQ ID No.1所示，所述外引物B3如SEQ ID No.2所示，所述内引物FIP如SEQ ID No.3所示，所述内引物BIP如SEQ ID No.4所示；
所述沙门氏菌sseL引物组中，所述外引物F3如SEQ ID No.5所示，所述外引物B3如SEQID No.6所示，所述内引物FIP如SEQ ID No.7所示，所述内引物BIP如SEQ ID No.8所示；
所述金黄色葡萄球菌23S rRNA引物组中，所述外引物F3如SEQ ID No.9所示，所述外引物B3如SEQ ID No.10所示，所述内引物FIP如SEQ ID No.11所示，所述内引物BIP如SEQ IDNo.12所示；
所述金黄色葡萄球菌Coa引物组中，所述外引物F3如SEQ ID No.13所示，所述外引物B3如SEQ ID No.14所示，所述内引物FIP如SEQ ID No.15所示，所述内引物BIP如SEQ IDNo.16所示。
2.一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP检测试剂盒包括：
如权利要求1所述的引物体系；LAMP试剂：适用于所述引物体系；
阳性对照，包括浓度为105copies/μL的沙门氏菌及金黄色葡萄球菌源性DNA，且所述DNA中包括每组所述引物组中的F3引物序列和B3引物序列的扩增序列；
阴性对照，非靶基因源性DNA；
空白对照，三蒸水；
反应条件，60～65℃条件下反应20～60min，然后80℃条件下反应10min。
3.如权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述引物体系中每组引物组中各引物的浓度分别为：F3引物2μmol/L、B3引物2μmol/L、FIP引物16μmol/L、BIP引物16μmol/L；
所述LAMP检测试剂盒的反应体系包括：LAMP试剂10～15μL，一组所述引物组1μL，所述引物组对应的所述阳性对照、所述阴性对照、所述空白对照、样品DNA中的一种1μL。
4.如权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP试剂包括：浓度为20mmol/L的Tris-HCl、10mmol/L的KCl、10mmol/L的(NH4)2SO4、6mmol/L的MgCl2、2mmol/L的MgSO4、1.4mmol/L的dNTP、0.1％的TritonX-100、1.2mol/L的Betaine；
所述LAMP检测试剂盒的快捷试剂的制备方法包括：在反应管中加入所述LAMP试剂，一组引物组中浓度为1.6μmol/L的FIP和BIP引物、浓度为0.02μmol/L的B3引物和F3引物，8UBst聚合酶，质量体积比为15％海藻糖的三蒸水溶液25μL；冻干后封闭储存于-20℃的条件下；使用前开启，并加入24μL的三蒸水溶解冻干试剂，再加入所述阳性对照、所述阴性对照、所述空白对照、样品DNA中的一种1μL。
5.如权利要求3或4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述反应体系还包括变色剂；检测时，发生变色表明检测结果为阳性，未发生变色表明检测结果为阴性。
6.如权利要求3或4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述反应体系还包括荧光DNA染料；检测时，经荧光PCR仪检测获得荧光图谱为S型扩增曲线表明检测结果为阳性，经荧光PCR仪检测获得荧光图谱不是S型扩增曲线表明检测结果为阴性。
7.如权利要求3或4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，检测时，浊度仪检测扩增值超过阈值时表明检测结果为阳性，浊度仪检测扩增值未超过阈值时表明检测结果为阴性。
8.一种口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP检测方法包括以下步骤：
S1：提取待测口含烟中的样品DNA；
S2：所述样品DNA作为反应模板，采用如权利要求2-7任一项所述的LAMP检测试剂盒进行LAMP扩增和LAMP检测。
9.如权利要求8所述的LAMP检测方法，其特征在于，提取待测口含烟的样品DNA的步骤包括：取口含烟样品25g，加入25mL的三蒸水拍击均质，在95℃孵育10min、10krpm离心10min、取上清液作为DNA样品液。
10.如权利要求8或9所述的LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP检测的步骤包括：
S201：质控判断，所有引物组对应的阳性对照结果为阳性，阴性对照和空白对照结果为阴性，表明LAMP检测试剂盒有效，进入样品检测结果判断步骤；
S202：样品检测结果判断，当样品DNA的沙门氏菌23S rRNA和沙门氏菌sseL检测结果为阴性，表明该样品不含有沙门氏菌；当样品DNA的沙门氏菌23S rRNA和沙门氏菌sseL检测结果为阳性，表明该样品含有沙门氏菌；当样品DNA的金黄色葡萄球菌23S rRNA和金黄色葡萄球菌Coa检测结果为阴性，表明该样品不含有金黄色葡萄球菌；当样品DNA的金黄色葡萄球菌23S rRNA和金黄色葡萄球菌Coa检测结果为阳性，表明该样品含有金黄色葡萄球菌。
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