CN103305623A - 二种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒 - Google Patents
二种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种二种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒。其中，沙门氏菌的快速检测引物组的外引物的上游和下游引物及内引物的上游和下游引物的序列分别如SEQNo.1、SEQNo.2、SEQNo.3和SEQNo.4所示；金黄色葡萄球菌的快速检测引物组的外引物的上游和下游引物、内引物的上游和下游引物及提高扩增效率的环引物的序列分别如SEQNo.5、SEQNo.6、SEQNo.7、SEQNo.8和SEQNo.9所示。本发明应用多重LAMP检测技术，结合熔解曲线分析方法，实现了在同一体系和反应条件下快速检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌DNA。
Description
技术领域
本发明属食品微生物分子生物学检测领域，涉及一种沙门氏菌和金黄色葡萄球菌多重快速检测方法及其检测引物组和检测试剂盒。
背景技术
食品安全是世界各国关注的重大问题，而其中食源性致病菌是影响食品安全的主要原因之一。根据现行国家食品安全监管体系，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均属重点关注的食源性致病菌。常规检测采用传统培养方法，且每个致病菌需应用独立的检测方法单独进行检测，工作量大，检测周期长，且受到检测人员专业、经验等多种因素限制，容易出现误判。随着分子生物学方法在食品微生物检测中的逐步应用，致病菌的检测效率也逐步提升。
LAMP方法是一种新型的恒温核酸扩增技术，该技术主要利用4种不同的特异性引物识别靶DNA上6个特定区域，并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（BstDNA），在恒温条件下快速扩增核酸，保证了扩增的高特异性和高效率。为进一步缩短反应时间，可以额外增加1至2条环引物以提高扩增效率。鉴于LAMP技术有众多优势，现已被逐渐应用于病原微生物的检测。如分支杆菌属、阪崎肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。
目前已有的LAMP检测方法通常只能在一个系统中针对单一一种致病菌进行检测，在需要快速筛查多个致病菌时，需分别对其进行检测，仍有较大工作量。多重恒温核酸检测技术能在同一反应体系中，同一反应条件下，实现多个目的菌的快速筛查。另外，由于LAMP扩增产物在普通电泳呈现梯状条带，因此多重LAMP产物无法通过普通电泳区别分子量来实现对目标产物的识别，而在以往的报道中往往采用较为繁琐的酶切或者测序的方式对扩增产物进行鉴别，对扩增产物的分析和鉴别仍有待提高。
熔解曲线（Dissociation curve）是随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。总的DNA双螺旋结构降解一半的温度称为融解（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。因此熔解曲线分析可以用来确定不同的反应产物。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的熔解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50％的温度），用这个特征峰就可以将不同扩增产物区分开，因为它们的熔解温度不同，故可用于对多重LAMP产物的分析。而作为熔解曲线分析一般使用Eva Green或LC Green这类非特异性饱和荧光染料。
发明内容
本发明的目的是提供一种二种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒，可以在一个系统中针对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行检测，以确定样品中是否含有沙门氏菌和金黄色葡萄球菌中的一种或二种。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明沙门氏菌的快速检测引物组中，其外引物的上游引物的序列如SEQ No.1所示，其外引物的下游引物的序列如SEQ No.2所示；其内引物的上游引物的序列如SEQ No.3所示，其内引物的下游引物的序列如SEQ No.4所示。
本发明金黄色葡萄球菌的快速检测引物组中，其外引物的上游引物的序列如SEQ No.5所示，其外引物的下游引物的序列如SEQ No.6所示；其内引物的上游引物的序列如SEQ No.7所示，其内引物的下游引物的序列如SEQ No.8所示；其环引物的序列如SEQ No.9所示。
使用本发明检测引物组对食品中的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行多重快速检测的方法是：将沙门氏菌的检测引物组和金黄色葡萄球菌的检测引物组的检测引物组与待测样品的DNA进行LAMP反应，在反应结束后对反应液进行分析，以确定所述样品中是否含有沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌；在所述沙门氏菌的检测引物组中，外引物的上游引物的序列如SEQ No.1所示，外引物的下游引物的序列如SEQ No.2所示，内引物的上游引物的序列如SEQ No.3所示，内引物的下游引物的序列如SEQ No.4所示；在所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中，外引物的上游引物的序列如SEQ No.5所示，外引物的下游引物的序列如SEQ No.6所示，内引物的上游引物的序列如SEQ No.7所示，内引物的下游引物的序列如SEQ No.8所示，环引物的序列如SEQ No.9所示。在本发明中，待测样品为食品，例如乳制品、肉制品、饮用水等。
进一步地，本发明所述LAMP反应的反应温度为61.5-64.5℃，反应时间为60-80min。
进一步地，本发明所述“对反应液进行分析”的方法为：对所述反应液进行DNA熔解曲线分析，其中，熔解曲线的温度区间为63-95℃。
进一步地，本发明所述“对反应液进行分析”的方法为：对所述反应液进行阴阳性判断。
进一步地，本发明在进行所述LAMP反应的反应液中，所述沙门氏菌的检测引物组中的外引物的上游引物和下游引物的浓度均为0.03-0.05μM，内引物的上游引物和下游引物的浓度均为0.45-0.55μM；所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的外引物的上游引物和下游引物的浓度均为0.03-0.05μM，内引物的上游引物和下游引物的浓度均为0.45-0.55μM，环引物的浓度为0.2-0.4μM；并且，进行所述LAMP反应的反应液中还包含有浓度为0.6-0.7M的甜菜碱、浓度为4.4-5.2mM的MgSO4、10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液、5%（体积）的20×荧光染料、浓度为0.3-0.5U/μL的BstDNA聚合酶、浓度各为0.7-0.9mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸。
本发明的一种快速检测试剂盒包括沙门氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、二种阳性对照品、BstDNA聚合酶、10×BstDNA聚合酶缓冲液、20×饱和荧光染料、MgSO4溶液、甜菜碱溶液、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水；所述沙门氏菌的检测引物组中的外引物的上游引物的序列如SEQ No.1所示，外引物的下游引物的序列如SEQ No.2所示，内引物的上游引物的序列如SEQ No.3所示，内引物的下游引物的序列如SEQ No.4所示；所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的外引物的上游引物的序列如SEQ No.5所示，外引物的下游引物的序列如SEQ No.6所示，内引物的上游引物的序列如SEQ No.7所示，内引物的下游引物的序列如SEQ No.8所示，环引物的序列如SEQ No.9所示；所述二种阳性对照品分别为沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的标准菌株的基因组DNA。
本发明的另一种快速检测试剂盒包含2×LAMP预混液和二种阳性对照品，所述二种阳性对照品分别为沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的标准菌株的基因组DNA，在所述2×LAMP预混液中包含有沙门氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、浓度为1.2-1.4M的甜菜碱、浓度为0.6-1.0U/μL的BstDNA聚合酶、2×BstDNA聚合酶缓冲液、浓度为8.8-10.4mM的MgSO4溶液、2×Eva green饱和荧光染料、无菌超纯水、以及浓度各为1.4-1.8 mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸；所述沙门氏菌的检测引物组中的外引物的上游引物的序列如SEQ No.1所示，外引物的下游引物的序列如SEQ No.2所示的序列，内引物的上游引物的序列如SEQ No.3所示，内引物的下游引物的序列如SEQ No.4所示的序列；所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的外引物的上游引物的序列如SEQ No.5所示，外引物的下游引物的序列如SEQ No.6所示，内引物的上游引物的序列如SEQ No.7所示，内引物的下游引物的序列如SEQ No.8所示，环引物的序列如SEQ No.9所示；所述沙门氏菌的检测引物组中的外引物的上游引物和下游引物的浓度均为0.06-0.10μM，内引物的上游引物和下游引物的浓度均为0.9-1.1μM；所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的外引物的上游引物和下游引物的浓度均为0.06-0.10 μM，内引物的上游引物和下游引物的浓度均为0.9-1.1μM，环引物的浓度均为0.4-0.8μM。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明是根据已公开的沙门氏菌侵袭蛋白A（invA)基因序列、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（nuc）基因序列，分析设计得到本发明的检测引物组（序列如SEQ No.1-No.9所示），具有良好特异性。
（2）利用本发明的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的快速检测引物组，能在同一反应体系中和同一反应温度条件下，实现同时对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌DNA的同步快速扩增，从而克服现有技术只能在一个系统中针对某一种致病菌进行检测、而不能同时对同一系统中是否同时存在多种致病菌进行判断的缺陷，大大提高检测效率。
（3）本发明利用熔解曲线法对多重反应产物进行分析，可准确判定样品DNA提取液中是含有沙门氏菌还是含有金黄色葡萄球菌DNA，或者是两者兼而有之，克服了现有多重LAMP反应只能通过较为繁琐的测序或酶切来判定阳性扩增产物所含目的扩增片段种类。
（4）本发明的快速检测方法由于利用本发明的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的快速检测引物组，并对LAMP反应体系和反应条件进行优化，因而能快速高效扩增沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的基因组DNA目的片段，整个LAMP扩增过程最快可在60分钟内完成，扩增产物得率高，对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌致病菌的检测简便、准确。
（5）在本发明的快速检测方法中，LAMP扩增反应可在恒定温度下完成，且允许的温度波动范围较大（±1.5℃），因此对温控的仪器设备要求不高，水浴器或板式加热器均可满足要求。
（6）本发明的快速检测方法灵敏度高，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的阳性扩增结果均仅需10fg/μL目的菌基因组DNA。
（7）与常规的平板培养法相比，本发明的快速检测方法可大大缩短检测周期，减少检测环节，从而降低因检测环节过多或人员技术水平和经验的差异造成的误判的几率，使检测结果更为准确可靠，并可为食品安全突发事件的处置提供重要的技术支持。
附图说明
图1是本发明沙门氏菌扩增产物熔解曲线分析图；
图2是本发明金黄色葡萄球菌扩增产物熔解曲线分析图；
图3是本发明沙门氏菌和金黄色葡萄球菌混合扩增产物熔解曲线分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但并不对本发明做任何限定。
实施例1： 本发明沙门氏菌、金黄色葡萄球菌二重LAMP反应的最佳Mg2+浓度的确定
本实施例的具体确定方法为：
1. 样品DNA的提取
1.1 将沙门氏菌和金黄色葡萄球菌标准菌株各自分别接种于营养肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2 应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取上述培养产物中的细菌DNA。
2. LAMP反应
2.1 分别人工合成用于沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测的引物组。其中，用于沙门氏菌检测的引物组中的外引物的上游引物的序列如SEQ No.1所示，外引物的下游引物的序列如SEQ No.2所示，内引物的上游引物的序列如SEQ No.3所示，内引物的下游引物的序列如SEQ No.4所示；用于金黄色葡萄球菌检测的引物组中的外引物的上游引物的序列如SEQ No.5所示，外引物的下游引物的序列如SEQ No.6所示，内引物的上游引物的序列如SEQ No.7所示，内引物的下游引物的序列如SEQ No.8所示，环引物的序列如SEQ No.9所示。
2.2 LAMP反应体系
2.2.1 沙门氏菌的LAMP反应体系
应用不同的Mg2+浓度分别建立7组沙门氏菌的LAMP反应体系，具体如下：
各组反应体系的体积为25μL，分别包括：本实施例2.1部分所合成的浓度均为0.04μM的沙门氏菌检测的外引物的上游引物和下游引物、浓度均为0.5μM的沙门氏菌检测的内引物的上游引物和下游引物、浓度均为0.04μM的金黄色葡萄球菌检测的外引物的上游引物和下游引物、浓度均为0.5μM的金黄色葡萄球菌检测的内引物的上游引物和下游引物、浓度为0.3μM的金黄色葡萄球菌检测的环引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，5%（体积）的20×Eva Green荧光染料，浓度为0.4U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），沙门氏菌基因组DNA模板1μL；并且在以上7组反应体系中，MgSO4的浓度分别为：3.6mM、 4.0mM、4.4mM、4.8mM、5.2mM、5.6mM、6.0mM；以上各组反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.2.2 金黄色葡萄球菌的LAMP反应体系
应用不同的Mg2+浓度分别建立7组金黄色葡萄球菌的LAMP反应体系，具体如下：
各组反应体系的体积为25μL，各组反应体系的组成均包括：本实施例2.1部分所合成的浓度均为0.04μM的沙门氏菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.5μM的沙门氏菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.04μM的金黄色葡萄球菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.5μM的金黄色葡萄球菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度为0.3μM的金黄色葡萄球菌检测的环引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，5%（体积）的20×Eva Green荧光染料，浓度为0.4U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），金黄色葡萄球菌基因组DNA模板1μL；并且在以上7组反应体系中，MgSO4浓度分别为：3.6mM、 4.0mM、4.4mM、4.8mM、5.2mM、5.6mM、6.0mM；以上各组反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3 LAMP反应条件
应用荧光定量PCR仪，反应条件为在63℃下反应70min。
2.4 结果观察
将以上沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的各组LAMP反应体系的反应液在荧光定量PCR仪上分别进行熔解曲线分析，熔解曲线的温度区间为63-95℃。其中，沙门氏菌扩增时，当Mg2+浓度在4.0-5.6mM区间时，呈现出明显的熔解温度特征峰；金黄色葡萄球菌扩增时，当Mg2+浓度在4.4-5.2mM区间时，呈现出明显的熔解温度特征峰。根据以上熔解曲线分析结果，综合考虑在对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌这二种目标菌进行检测过程中呈现明显的熔解温度特征峰时的Mg2+浓度范围，确定本发明二重检测方法的最佳Mg2+浓度为4.4-5.2mM。
实施例2 ：本发明沙门氏菌、金黄色葡萄球菌二重LAMP反应的最佳反应温度的确定
本实施例的具体确定步骤如下：
1．样品DNA的提取
1.1将沙门氏菌和金黄色葡萄球菌标准菌株各自分别接种于营养肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2 应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上培养产物中的细菌DNA。
2．LAMP反应
2.1分别人工合成用于沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测的引物组，各引物组的引物及其序列与实施例1中的2.1部分所述一致。
2.2 LAMP反应体系
2.2.1 沙门氏菌的LAMP反应体系
应用不同的反应温度分别建立6组沙门氏菌LAMP反应体系，具体如下：
各组反应体系的体积为25μL，各组反应体系的组成均包括：本实施例2.1部分所合成的浓度均为0.04μM的沙门氏菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.5μM的沙门氏菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.04μM的金黄色葡萄球菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.5μM的金黄色葡萄球菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度为0.3μM的金黄色葡萄球菌检测的环引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，5%（体积）的20×Eva Green荧光染料，浓度为0.4U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为4.8mM的MgSO4，沙门氏菌基因组DNA模板1μL，以上各组反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.2.2 金黄色葡萄球菌的LAMP反应体系
应用不同的反应温度分别建立6组金黄色葡萄球菌的LAMP反应体系，具体如下：
各组反应体系的体积为25μL，各组反应体系的组成均包括：本实施例2.1部分所合成的浓度均为0.04μM的沙门氏菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.5μM的沙门氏菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.04μM的金黄色葡萄球菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.5μM的金黄色葡萄球菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度为0.3μM的金黄色葡萄球菌检测的环引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，5%（体积）的20×Eva Green荧光染料，浓度为0.4U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为4.8mM的MgSO4，金黄色葡萄球菌基因组DNA模板1μL，以上各组反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3 LAMP反应条件
应用荧光定量PCR仪，将本实施例的2.2部分中所述6组沙门氏菌LAMP反应体系、6组金黄色葡萄球菌LAMP反应体系各自在6种不同温度下分别进行反应，所采用的温度分别为：59.5℃、60.5℃、61.5℃、63℃、64.5℃、65.5℃，反应时间均为70min。
2.4 结果观察
将以上沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的各组LAMP反应体系的反应液在荧光定量PCR仪上分别进行熔解曲线分析，熔解曲线的温度区间为63-95℃。其中，沙门氏菌扩增时，当反应温度在60.5-64.5℃区间时，呈现出明显的熔解温度特征峰；金黄色葡萄球菌扩增时，当反应温度在61.5-64.5℃区间时，呈现出明显的熔解温度特征峰。根据以上熔解曲线分析结果，综合考虑在对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌这二种目标菌进行检测过程中能呈现明显的熔解温度特征峰时的反应温度范围，确定本发明二重检测体系的最佳反应温度为61.5-64.5℃。
实施例3： 本发明二重LAMP检测方法对沙门氏菌的检测灵敏度。
本实施例的具体检测方法为：
1．样品DNA的提取
1.1 将沙门氏菌标准菌株接种于营养肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2 应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取以上培养产物中细菌DNA。
2．LAMP反应
2.1 分别人工合成用于沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的引物组，各引物组的引物及其序列与实施例1中的2.1部分所述一致。
2.2 LAMP的反应体系
建立9个反应管，各反应管中反应体系的总体积为25μL，各反应管中反应体系的组成均包括：本实施例2.1部分所合成的浓度均为0.04μM的沙门氏菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.5μM的沙门氏菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.04μM的金黄色葡萄球菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.5μM的金黄色葡萄球菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度为0.3μM的金黄色葡萄球菌检测的环引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，5%（体积）的20×Eva Green荧光染料，浓度为0.4U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为4.8mM的MgSO4；各反应管还需分别加入沙门氏菌基因组DNA模板液1μL，各个反应管内所用DNA模板液的浓度分别为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL，以测试该检测方法对沙门氏菌的检测灵敏度；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3 LAMP反应条件
应用荧光定量PCR仪，反应条件为在63℃下反应70min。
2.4 结果观察
将以上沙门氏菌的各组LAMP反应体系的反应液在荧光定量PCR仪上分别进行熔解曲线分析，熔解曲线的温度区间为63-95℃。当模板DNA液的浓度为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL时，均可呈现明显的熔解温度特征峰，而当模板DNA液的浓度降至1fg/μL时，则不能呈现明显的熔解温度特征峰，说明本发明方法对沙门氏菌DNA的检测灵敏度为10fg/μL。
实施例4：本发明二重LAMP检测方法对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度。
本实施例的具体检测方法为：
1．样品DNA的提取
1.1 将金黄色葡萄球菌标准菌株接种于营养肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2 应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取以上培养产物中细菌DNA。
2．LAMP反应
2.1 分别人工合成用于沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测的引物组，各引物组引物及其序列与实施例1中的2.1部分所述一致。
2.2 LAMP反应体系
建立9个反应管，各反应管反应体系总体积为25μL，各反应管的反应体系的组成均包括：本实施例2.1部分所合成的浓度均为0.04μM的沙门氏菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.5μM的沙门氏菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.04μM的金黄色葡萄球菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.5μM的金黄色葡萄球菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度为0.3μM的金黄色葡萄球菌检测的环引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，5%（体积）的20×Eva Green荧光染料，浓度为0.4U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为4.8mM的MgSO4；各反应管还需加入金黄色葡萄球菌基因组DNA模板液1μL，各个反应管内所用DNA模板液浓度分别为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL，以测试该检测方法对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3 LAMP反应条件
应用荧光定量PCR仪，反应条件为在63℃下反应70min。
2.4 结果观察
将以上金黄色葡萄球菌的各组LAMP反应体系的反应液在荧光定量PCR仪上分别进行熔解曲线分析，熔解曲线的温度区间为63-95℃。当模板DNA液的浓度为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL时，均可呈现明显的熔解温度特征峰，而当模板DNA液的浓度降至1fg/μL时，则不能呈现明显的熔解温度特征峰。说明本发明方法对金黄色葡萄球菌DNA的检测灵敏度为10fg/μL。
实施例5：本发明二重LAMP检测方法的熔解曲线特征峰分析
本实施例的具体检测方法为：
1．样品DNA的提取
1.1将沙门氏菌和金黄色葡萄球菌标准菌株分别接种于营养肉汤， 36℃±1℃培养18小时。
1.2 应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上培养产物中细菌DNA，作为单一目标菌检测用模板。
1.3 将二组DNA提取液按等体积比例混合，作为混合目标菌检测模板。
2．LAMP反应
2.1 分别人工合成用于沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测的引物组，各引物组引物及其序列与实施例1中的2.1部分所述一致。
2.2 LAMP反应体系
建立3个反应管，各反应管的反应体系的总体积为25μL，各反应管的反应体系的组成均包括：本实施例2.1部分所合成的浓度均为0.04μM的沙门氏菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.5μM的沙门氏菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.04μM的金黄色葡萄球菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.5μM的金黄色葡萄球菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度为0.3μM的金黄色葡萄球菌检测的环引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，5%（体积）的20×Eva Green荧光染料，浓度为0.4U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为4.8mM的MgSO4；三个反应管中分别加入单一沙门氏菌DNA模板1μL、金黄色葡萄球菌DNA模板1μL和混合DNA模板2μL，以上反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3 LAMP反应条件
应用荧光定量PCR仪，反应条件为在63℃下反应70min。
3．熔解曲线特征峰分析
3.1 将以上三组LAMP反应体系的反应液在荧光定量PCR仪上分别进行熔解曲线分析，熔解曲线的温度区间为63-95℃。。
3.2 当加入单一沙门氏菌DNA模板时，熔解曲线特征峰的温度范围为86-90℃（如图1所示）；当加入单一金黄色葡萄球菌DNA模板时，熔解曲线特征峰的温度范围为80-84℃（如图2所示）；当加入沙门氏菌和金黄色葡萄球菌混合DNA模板时，在86-90℃和80-84℃分别出现特征峰（如图3所示）。
4. 结论
通过本实施例确认，本发明沙门氏菌反应产物的熔解曲线特征峰的温度范围为86-90℃，金黄色葡萄球菌反应产物的熔解曲线特征峰的温度范围为80-84℃。
实施例6 ：对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的二重LAMP检测
本实施例采用乳粉作为检测样品，具体检测方法为：
1. 样品DNA的提取
1.1 分别称取25g乳粉样品至225mL缓冲蛋白胨水培养液和225mL 7.5%氯化钠肉汤中，36℃±1℃培养18小时。
1.2 应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上二种培养产物中的细菌DNA，得到二组DNA提取液。
1.3 将上述二组DNA提取液按等体积比例混合，作为最终检测模板。
2． LAMP反应
2.1 分别人工合成用于沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测的引物组，各引物组的引物及其序列与实施例1中的2.1部分所述一致。
2.2 LAMP反应体系
建立2个平行反应管，各平行反应管的反应体系的总体积为25μL，各平行反应管的反应体系的组成均包括：本实施例2.1部分所合成的浓度均为0.03μM的沙门氏菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.45μM的沙门氏菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.03μM的金黄色葡萄球菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.45μM的金黄色葡萄球菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度为0.2μM的金黄色葡萄球菌检测的环引物，浓度为0.6 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，5%（体积）的20×Eva Green荧光染料，浓度为0.3U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.7mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为4.4mM的MgSO4，混合DNA模板2μL，以上平行反应管内的反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3 LAMP反应条件
应用荧光定量PCR仪，反应条件为在61.5℃下反应80min。
2.4 结果观察
（1）方法一：将以上2个反应管在荧光定量PCR仪上分别进行熔解曲线分析，熔解曲线的温度区间为63-95℃。在温度范围为86-90℃处呈现一明显熔解温度特征峰，说明本实施例的样品中存在沙门氏菌污染，但不存在金黄色葡萄球菌污染。
（2）方法二：将以上反应管在6000rpm条件下离心5min，使用阴阳性判断法对反应液进行分析，发现反应管底部呈现明显沉淀，说明本实施例的样品中存在沙门氏菌和金黄色葡萄球菌中的一种或二种，但不能确定是哪一种或是否两者兼而有之。
2.5 结果验证
采用GB 4789-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验》对本实施例的样品进行检测，检出沙门氏菌，未检出金黄色葡萄球菌，与本实施例2.4部分的方法一的LAMP检测结果一致。
实施例7：对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的二重LAMP检测
本实施例采用乳粉作为检测样品，具体检测方法为：
1. 样品DNA的提取
1.1 分别称取25g乳粉样品至225mL缓冲蛋白胨水培养液和225mL 7.5%氯化钠肉汤中，36℃±1℃培养18小时。
1.2 应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上二种培养产物中的细菌DNA，获得二组DNA提取液。
1.3 将提取的二组DNA提取液按等体积比例混合，作为最终检测模板。
2. LAMP反应
2.1 分别人工合成用于沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测的引物组，各引物组的引物及其序列与实施例1中的2.1部分所述一致。
2.2 LAMP反应体系
建立2个平行反应管，各平行反应管的反应体系的总体积为25μL，各平行反应管的反应体系的组成均包括：本实施例2.1部分所合成的浓度均为0.04μM的沙门氏菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.5μM的沙门氏菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.04μM的金黄色葡萄球菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.5μM的金黄色葡萄球菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度为0.3μM的金黄色葡萄球菌检测的环引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，5%（体积）的20×Eva Green荧光染料，浓度为0.4U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为4.8mM的MgSO4，混合DNA模板2μL，以上平行反应管内的反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3 LAMP反应条件
应用荧光定量PCR仪，反应条件为在63℃下反应70min。
2.4 结果观察
（1）方法一：将以上反应管在荧光定量PCR仪上分别进行熔解曲线分析，熔解曲线的温度区间为63-95℃。在温度范围为80-84℃和86-90℃处分别呈现一明显熔解温度特征峰，说明本实施例的样品中同时存在沙门氏菌和金黄色葡萄球菌污染。
（2）方法二：将以上反应管在6000rpm条件下离心5min，使用阴阳性判断法对各反应管的反应液进行分析，发现各反应管的底部呈现明显沉淀，说明本实施例的样品中存在沙门氏菌和金黄色葡萄球菌中的一种或二种，但不能确定是哪一种或是否两者兼而有之。
2.5 结果验证
采用GB 4789-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验》对本实施例样品进行检测，检出沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，与本实施例2.4部分的方法一的检测结果一致。
实施例8：对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的二重LAMP检测
本实施例采用乳粉作为检测样品，具体检测方法为：
1. 样品DNA的提取
1.1 分别称取25g乳粉样品至225mL缓冲蛋白胨水培养液和225mL 7.5%氯化钠肉汤中，36℃±1℃培养18小时。
1.2 应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上二种培养产物中细菌DNA，获得二组DNA提取液。
1.3 将所提取的二组DNA提取液按等体积比例混合，作为最终检测模板。
2．LAMP反应
2.1 分别人工合成用于沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测的引物组，各引物组引物及其序列与实施例1中的2.1部分所述一致。
2.2 LAMP反应体系
建立2个平行反应管，各平行反应管的反应体系的总体积为25μL，各平行反应管的反应体系的组成均包括：本实施例2.1部分所合成的浓度均为0.05μM的沙门氏菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.55μM的沙门氏菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.05μM的金黄色葡萄球菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.55μM的金黄色葡萄球菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度为0.4μM的金黄色葡萄球菌检测的环引物，浓度为0.7 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，5%（体积）的20×Eva Green荧光染料，浓度为0.5U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.9mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为5.2 mM的MgSO4，混合DNA模板2μL，以上平行反应管内的反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3 LAMP反应条件
应用荧光定量PCR仪，反应条件为在64.5℃下反应60min。
2.4 结果观察
（1）方法一：将以上反应管在荧光定量PCR仪上分别进行熔解曲线分析，熔解曲线的温度区间为63-95℃。在温度范围为80-84℃处呈现一明显熔解温度特征峰，说明本实施例的样品中存在金黄色葡萄球菌污染，不存在沙门氏菌污染。
（2）方法二：将以上反应管在6000rpm条件下离心5min，使用阴阳性判断法对反应液进行分析，发现各反应管的底部呈现明显沉淀，说明本实施例的样品中存在沙门氏菌和金黄色葡萄球菌中的一种或二种，，但不能确定是哪一种或是否两者兼而有之。
2.5 结果验证
采用GB 4789-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验》对本实施例样品进行检测，检出金黄色葡萄球菌，未检出沙门氏菌，与本实施例2.4部分的方法一的检测结果一致。
实施例9：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌二重LAMP快速检测试剂盒
在本实施例中，试剂盒由如下试剂组成：
1. 沙门氏菌、金黄色葡萄球菌LAMP的检测引物，包括：
（1）用于沙门氏菌LAMP检测的外引物的上游引物，核苷酸序列如SEQ No.1所示；用于沙门氏菌LAMP检测的外引物的下游引物，核苷酸序列如SEQ No.2所示；用于沙门氏菌LAMP检测的内引物的上游引物，核苷酸序列如SEQ No.3所示；用于沙门氏菌LAMP检测的内引物的下游引物，核苷酸序列如SEQ No.4所示。
（2）用于金黄色葡萄球菌LAMP检测的外引物的上游引物，核苷酸序列如SEQ No.5所示；用于金黄色葡萄球菌LAMP检测的外引物下游引物，核苷酸序列如SEQ No.6所示，用于金黄色葡萄球菌LAMP检测的内引物的上游引物，核苷酸序列如SEQ No.7所示；用于金黄色葡萄球菌LAMP检测的内引物的下游引物，核苷酸序列如SEQ No.8所示；用于金黄色葡萄球菌LAMP检测的环引物，核苷酸序列如SEQ No.9所示。
2. BstDNA聚合酶；
3. 阳性对照品：沙门氏菌的标准菌株的基因组DNA；金黄色葡萄球菌的标准菌株的基因组DNA；
4. 空白对照品：无菌超纯水；
5. 10×BstDNA聚合酶缓冲液；
6. MgSO4溶液；
7. 甜菜碱溶液；
8. 三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的混合溶液且三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的摩尔比为1:1:1:1。
9. 20×Eva Green荧光染料。
实施例10：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌二重LAMP快速检测试剂盒
本实施例试剂盒由如下试剂组成：
1． 沙门氏菌和金黄色葡萄球菌二重LAMP检测2×预混液，该LAMP检测2×预混液的具体组成及浓度为：
浓度为0.06μM的沙门氏菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度为0.9μM的沙门氏菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.06μM的金黄色葡萄球菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度为0.9μM的金黄色葡萄球菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度为0.4μM的金黄色葡萄球菌检测的环引物，浓度为1.2 M的甜菜碱，2×BstDNA聚合酶缓冲液，2×Eva Green荧光染料，浓度为0.6U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为1.4mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为8.8mM的MgSO4。其中所述各引物组及其核苷酸序列与实施例9中的第1部分所述一致。
2. 阳性对照品：沙门氏菌基因组DNA；金黄色葡萄球菌基因组DNA。
3. 空白对照品：无菌超纯水。
实施例11：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌二重LAMP快速检测试剂盒
本实施例试剂盒由如下试剂组成：
1. 沙门氏菌和金黄色葡萄球菌二重LAMP检测2×预混液，其具体组成及浓度为：
浓度为0.08μM的沙门氏菌检测的外引物的上游引物和下游引物、浓度为1.0μM的沙门氏菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度均为0.08μM的金黄色葡萄球菌检测的外引物的上游引物和下游引物，浓度为1.0μM的金黄色葡萄球菌检测的内引物的上游引物和下游引物，浓度为0.6μM的金黄色葡萄球菌检测的环引物，浓度为1.3 M的甜菜碱，2×BstDNA聚合酶缓冲液，2×Eva Green荧光染料，浓度为0.8U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为1.6mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为9.6mM的MgSO4。其中上述各引物组及其序列与实施例9中的第1部分所述一致。
2. 阳性对照品：沙门氏菌基因组DNA；金黄色葡萄球菌基因组DNA。
3. 空白对照品：无菌超纯水。
实施例12：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌二重LAMP快速检测试剂盒
本实施例试剂盒由如下试剂组成：
1. 沙门氏菌和金黄色葡萄球菌二重LAMP检测2×预混液，其具体组成及浓度为：
浓度为0.1μM的沙门氏菌检测的外引物的上游引物和下游引物、浓度为1.1μM的沙门氏菌检测的内引物的上游引物和下游引物、浓度均为0.1μM的金黄色葡萄球菌检测的外引物的上游引物和下游引物、浓度为1.1μM的金黄色葡萄球菌检测的内引物的上游引物和下游引物、浓度为0.8μM的金黄色葡萄球菌检测的环引物，浓度为1.4 M的甜菜碱，2×BstDNA聚合酶缓冲液，2×Eva Green荧光染料，浓度为1.0U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为1.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为10.4mM的MgSO4。其中上述各引物组及其序列与实施例9中的第1部分所述一致。
2. 阳性对照品：沙门氏菌基因组DNA；金黄色葡萄球菌基因组DNA。
3. 空白对照品：无菌超纯水。
序列表
<110> 浙江省质量检测科学研究院
<120> 二种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒
<160> 9
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcccgattt tctctggatg g 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caccaatggt cagcatgg 18
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcgcggcatc cgcatcaatg gtatgcccgg taaacagatg agt 43
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acggttcctt tgacggtgcg ataccatggc gggtcatc 38
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acaatacgca aagaggtttt tct 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tttcgtaaat gcacttgctt ca 22
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtcgcaggt tctttatgta taatggcgta aatagaagtg gttc 44
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aatgtacaaa ggtcaaccaa tgacatagga tgctttgttt caggtg 46
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acagtatata gtgcaacttc aactaa 26
Claims (9)
1. 一种沙门氏菌的快速检测引物组，其特征是：其外引物的上游引物的序列如SEQ No.1所示，其外引物的下游引物的序列如SEQ No.2所示；其内引物的上游引物的序列如SEQ No.3所示，其内引物的下游引物的序列如SEQ No.4所示。
2. 一种金黄色葡萄球菌的快速检测引物组，其特征是：其外引物的上游引物的序列如SEQ No.5所示，其外引物的下游引物的序列如SEQ No.6所示；其内引物的上游引物的序列如SEQ No.7所示，其内引物的下游引物的序列如SEQ No.8所示；其环引物的序列如SEQ No.9所示。
3. 一种使用检测引物组对食品中的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行多重快速检测的方法，其特征是：将沙门氏菌的检测引物组和金黄色葡萄球菌的检测引物组的检测引物组与待测样品的DNA进行LAMP反应，在反应结束后对反应液进行分析，以确定所述样品中是否含有沙门氏菌和/或金黄色葡萄球菌；在所述沙门氏菌的检测引物组中，外引物的上游引物的序列如SEQ No.1所示，外引物的下游引物的序列如SEQ No.2所示，内引物的上游引物的序列如SEQ No.3所示，内引物的下游引物的序列如SEQ No.4所示；在所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中，外引物的上游引物的序列如SEQ No.5所示，外引物的下游引物的序列如SEQ No.6所示，内引物的上游引物的序列如SEQ No.7所示，内引物的下游引物的序列如SEQ No.8所示，环引物的序列如SEQ No.9所示。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征是：所述LAMP反应的反应温度为61.5-64.5℃，反应时间为60-80min。
5. 根据权利要求3或4所述方法，其特征是，所述“对反应液进行分析”的方法为：对所述反应液进行DNA熔解曲线分析，其中，熔解曲线的温度区间为63-95℃。
6. 根据权利要求3或4所述方法，其特征是：所述“对反应液进行分析”的方法为：对所述反应液进行阴阳性判断。
7. 根据权利要求3、4、5或6所述的方法，其特征是：在进行所述LAMP反应的反应液中，所述沙门氏菌的检测引物组中的外引物的上游引物和下游引物的浓度均为0.03-0.05μM，内引物的上游引物和下游引物的浓度均为0.45-0.55μM；所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的外引物的上游引物和下游引物的浓度均为0.03-0.05μM，内引物的上游引物和下游引物的浓度均为0.45-0.55μM，环引物的浓度为0.2-0.4μM；并且，进行所述LAMP反应的反应液中还包含有浓度为0.6-0.7M的甜菜碱、浓度为4.4-5.2mM的MgSO4、10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液、5%（体积）的20×荧光染料、浓度为0.3-0.5U/μL的BstDNA聚合酶、浓度各为0.7-0.9mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸。
8. 一种快速检测试剂盒，其特征在于：包括沙门氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、二种阳性对照品、BstDNA聚合酶、10×BstDNA聚合酶缓冲液、20×饱和荧光染料、MgSO4溶液、甜菜碱溶液、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水；所述沙门氏菌的检测引物组中的外引物的上游引物的序列如SEQ No.1所示，外引物的下游引物的序列如SEQ No.2所示，内引物的上游引物的序列如SEQ No.3所示，内引物的下游引物的序列如SEQ No.4所示；所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的外引物的上游引物的序列如SEQ No.5所示，外引物的下游引物的序列如SEQ No.6所示，内引物的上游引物的序列如SEQ No.7所示，内引物的下游引物的序列如SEQ No.8所示，环引物的序列如SEQ No.9所示；所述二种阳性对照品分别为沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的标准菌株的基因组DNA。
9. 一种快速检测试剂盒，其特征在于：包含2×LAMP预混液和二种阳性对照品，所述二种阳性对照品分别为沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的标准菌株的基因组DNA，在所述2×LAMP预混液中包含有沙门氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、浓度为1.2-1.4M的甜菜碱、浓度为0.6-1.0U/μL的BstDNA聚合酶、2×BstDNA聚合酶缓冲液、浓度为8.8-10.4mM的MgSO4溶液、2×Eva green饱和荧光染料、无菌超纯水、以及浓度各为1.4-1.8 mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸；所述沙门氏菌的检测引物组中的外引物的上游引物的序列如SEQ No.1所示，外引物的下游引物的序列如SEQ No.2所示的序列，内引物的上游引物的序列如SEQ No.3所示，内引物的下游引物的序列如SEQ No.4所示的序列；所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的外引物的上游引物的序列如SEQ No.5所示，外引物的下游引物的序列如SEQ No.6所示，内引物的上游引物的序列如SEQ No.7所示，内引物的下游引物的序列如SEQ No.8所示，环引物的序列如SEQ No.9所示；所述沙门氏菌的检测引物组中的外引物的上游引物和下游引物的浓度均为0.06-0.10μM，内引物的上游引物和下游引物的浓度均为0.9-1.1μM；所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的外引物的上游引物和下游引物的浓度均为0.06-0.10 μM，内引物的上游引物和下游引物的浓度均为0.9-1.1μM，环引物的浓度均为0.4-0.8μM。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105219772A (zh) * | 2015-11-15 | 2016-01-06 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一组核苷酸序列及在沙门菌和志贺菌检测中的应用 |
| CN108277290A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-07-13 | 广东环凯微生物科技有限公司 | 金黄色葡萄球菌干粉化lamp快速检测试剂盒 |
| CN109504744A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-03-22 | 陕西科技大学 | 基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法及试剂盒 |
| CN113621723A (zh) * | 2021-09-14 | 2021-11-09 | 贵州中烟工业有限责任公司 | 口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的lamp检测引物体系、检测试剂盒及检测方法 |
| CN116024362A (zh) * | 2023-02-20 | 2023-04-28 | 沈阳农业大学 | 一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的lamp引物组及其试剂盒和检测方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101880711A (zh) * | 2010-03-11 | 2010-11-10 | 中华人民共和国徐州出入境检验检疫局 | 金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌核酸筛查方法 |
| CN102851383A (zh) * | 2012-09-21 | 2013-01-02 | 武汉真福医药科技发展有限公司 | 快速检测沙门氏菌的lamp试剂盒 |
| CN102864226A (zh) * | 2012-09-21 | 2013-01-09 | 武汉真福医药科技发展有限公司 | 快速检测金黄色葡萄球菌的lamp试剂盒 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101880711A (zh) * | 2010-03-11 | 2010-11-10 | 中华人民共和国徐州出入境检验检疫局 | 金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌核酸筛查方法 |
| CN102851383A (zh) * | 2012-09-21 | 2013-01-02 | 武汉真福医药科技发展有限公司 | 快速检测沙门氏菌的lamp试剂盒 |
| CN102864226A (zh) * | 2012-09-21 | 2013-01-09 | 武汉真福医药科技发展有限公司 | 快速检测金黄色葡萄球菌的lamp试剂盒 |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105219772A (zh) * | 2015-11-15 | 2016-01-06 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一组核苷酸序列及在沙门菌和志贺菌检测中的应用 |
| CN108277290A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-07-13 | 广东环凯微生物科技有限公司 | 金黄色葡萄球菌干粉化lamp快速检测试剂盒 |
| CN109504744A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-03-22 | 陕西科技大学 | 基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法及试剂盒 |
| CN109504744B (zh) * | 2019-01-14 | 2022-11-29 | 陕西科技大学 | 基于高分辨率熔解的多重环介导等温核酸扩增检测方法及试剂盒 |
| CN113621723A (zh) * | 2021-09-14 | 2021-11-09 | 贵州中烟工业有限责任公司 | 口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的lamp检测引物体系、检测试剂盒及检测方法 |
| CN113621723B (zh) * | 2021-09-14 | 2023-06-23 | 贵州中烟工业有限责任公司 | 口含烟中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的lamp检测引物体系、检测试剂盒及检测方法 |
| CN116024362A (zh) * | 2023-02-20 | 2023-04-28 | 沈阳农业大学 | 一种同时检测婴幼儿配方奶粉中多种致病菌的lamp引物组及其试剂盒和检测方法 |
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