CN101082579A - 基于环状介导等温扩增技术的基因快速诊断方法 - Google Patents
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Abstract
基于环状介导等温扩增技术的基因快速诊断方法，涉及生物检测技术领域，具体是用体外生物检测试剂快速检测病原微生物的一种技术。包括如下步骤：一、对被检样品进行预处理；二、包括目标靶基因数据库的建立；生物信息学的分析比较；基因组多态性的分型处理和简并碱基的运用，获得各种靶基因的特异性引物两对，分别与靶基因中的六个独立区域序列特异性匹配；三、进行环介导等温扩增反应；四、分析判断结果。该方法的优点：不需特殊试剂与设备；高特异性；.灵敏度高；鉴定简便；用途广：可用于食品、药品、化妆品等领域的质量控制和环境、水质等监测；用于医学临床诊断，用于代谢性疾病和遗传疾病的基因诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体地说，用基于环状介导等温扩增基因技术的体外生物检测试剂快速检测病原微生物的一种技术。
背景技术
目前对致病微生物有多种检测方法，从以病原微生物分离培养、形态学鉴定和自动生化鉴定为主的国家标准(GB/T 4789-2003)，到特异蛋白的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技术等分子生物学检测方法[陈福生等：食品安全检测与现代生物技术，化学工业出版社，2004年]。其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏性等方面都有很大的提高，这些新技术试图突破传统的形态学、生化反应等微生物学检测旧模式，不需要对微生物进行分离培养，而直接用样品或样品的增菌液对其基因及基因产物进行快速检测，并且与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展。
以聚合酶链式反应(简称PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中也存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此，不适用于现场快速检测；而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以，及时将生物技术发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。其中，等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification of DNA，简称LAMP技术)在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性，见文献Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T， Watanabe K，Amino N，Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA，Nucleic Acids Res.2000Jun 15；28(12)：E63.。该方法通常是按如下步骤进行步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA；步骤二、特异性引物的制备：确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63～65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果。虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温条件下高效地扩增核酸，但是现有技术也有不足之处，主要是1.其特殊引物要求极为苛刻限制该方法的广泛应用；2.仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制其进一步发展。为了克服这些缺点有必要对现有的LAMP技术进行改进。
发明内容
本发明的目的在于建立一种特异性强、灵敏度高、检准率高的环状介导等温扩增基因技术检测病原微生物的方法，广泛应用于食品、药品、医疗卫生等领域的检测。
为达到本发明的目的所采用的技术方案为一种环介导等温扩增基因快速诊断方法，包括如下步骤：
一、对被检样品的预处理：用常规法快速提取DNA或快速提取RNA；
二、特异性引物制备：包括目标靶基因数据库的建立；生物信息学的分析比较；基因组多态性的分型处理和简并碱基的运用，从而获得所需各种靶基因的特异性引物两对，为内引物和外引物各一对，经DNA合成仪生成寡聚脱氧核苷酸引物，且分别与靶基因中的六个独立区域序列特异性匹配；
三、进行环介导等温扩增反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63～65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应。
四、分析判断反应产物结果：在反应产物中加入荧光染料如市面销售的荧光染料(SYBR GREEN I)，混匀，静置5min，反应产物显现绿色则为阳性，显橙色则为阴性。
本发明所提供的环介导等温扩增技术的基因快速诊断方法，有以下创新点：
1.特殊引物的设计：原有LAMP的引物设计上条件非常苛刻，本发明运用生物信息平台进行大规模基因组分析，引入简并碱基和基因组分型处理，使引物设计更加完善。
2.样品前处理：根据待测样品的不同提供与靶标配套的样品前处理液和血样分部离心收集程序，提高检测灵敏度。
3.反应后加入染料，结果鉴定更为直观清晰，避免了光线引起的误差，在准确判结果的前提下，可大大缩小反应体积。
4.反应微型化，目前1升反应混合物可作80000次检测，为进一步集成化、高通量和自动化开发奠定基础，并且大大降低成本。
本发明的有益效果：①.只需一恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备；②.高特异性：应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达大于99.9％假阳性率小于0.1％；③.快速、高效扩增：扩增在不到1小时即可完成，且产率高；④.灵敏度高：用于病原微生物的检测和传染病的诊断中，对病毒类微生物最低检测极限达到0.1PFU；对细菌类微生物最低检测极限达到10CFU/ml；标本的检出率达到99％；⑤.鉴定简便：通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤。⑥.用途广，可广泛用于食品、药品、化妆品、及其它们的原辅料质量控制的安全快速检测；可用于环境、水质等监测；可用于传染性疾病等医学临床诊断，并可扩展应用于代谢性疾病和遗传疾病的基因诊断。
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明的技术应用不限于实施例。
具体实施方式
实施例1、大肠杆菌0157基因快速诊断法
步骤一：被检样品的预处理：按常规法，大肠杆菌0157基因组DNA提取过程：
1、取50μl过夜培养的增菌液于eppendorf管中，1000rpm离心2分钟，去上清：
2、加入80μl样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；
3、沸水中煮10分钟后立即置于冰上冷却10分钟；
4、10000rpm离心2分钟，上清即可作为待用的模板DNA
步骤二：特异性引物制备：
试剂盒成分有：
1.引物
外引物1：TGCAGGGATCAGTCGTAC
外引物2：AGATCATCCAGTGTTGTACG
内引物1：：GTCAGTGAGGTTCCACTATGCGTTTTAATCGCCATTCGTTGACTAC
内引物2：TCTGTGGCAAGAGCGATGTTTTTTCCCTCTGTATTTGCCGAA
2.DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)
3.反应液(含80μl 10mM dNTP，50μl 10×ThermoPol Buffer，20μl 150mMMgSO4)
4.样品预处理液(含20mM Tris-HCl[pH 8.0]，2mM EDTA，1.2％TritonX-100)
5.荧光染料(SYBR Green I)
6.：阳性对照(大肠杆菌0157基因组DNA)
步骤三：环介导等温扩增(LAMP)反应：
1.在200ulPCR管配制反应体系：引物混合物1.5μl，反应液5.75μl，BstDNA聚合酶0.5μl(8U)，模板DNA 2μl，加水至11.5μl。
2.将配制好的PCR管于65℃反应1.5小时。
步骤四：分析判断反应产物结果
在反应产物中加入2.5μl荧光染料(SYBR Green I)，混匀，静置5min。若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。
Claims (1)
1、一种基于环介导等温扩增技术的基因快速诊断方法，包括如下步骤：一、对被检样品进行预处理，从而快速提取DNA或快速提取RNA；二、特异性引物制备：确定待测样品的靶基因后，取得特异性引物；三、进行环介导等温扩增技术反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63～65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应；四、判断结果，其特征在于：所说的步骤二特异性引物制备：包括目标靶基因数据库的建立；生物信息学的分析比较；基因组多态性的分型处理和简并碱基的运用，从而获得所需各种靶基因的特异性引物两对，为内引物和外引物各一对，经DNA合成仪生成寡聚脱氧核苷酸引物，且分别与靶基因中的六个独立区域序列特异性匹配；步骤四、分析判断反应产物结果：在反应产物中加入荧光染料混匀，静置5min，反应产物显现绿色为阳性，显橙色则为阴性。
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