CN102220427B - 四种食源性致病菌多重pcr检测法及检测引物组和试剂盒 - Google Patents
四种食源性致病菌多重pcr检测法及检测引物组和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种四种食源性致病菌多重PCR检测法及检测引物组和试剂盒。本发明通过利用分析设计得到的沙门氏菌、志贺氏菌、萄球菌和单增李斯特菌的快速检测引物组，对待测样品中所提取的细菌的基因组DNA，在同一反应体系中进行多重PCR反应，通过对反应产物的电泳分析来判定样品中是否含有沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌或单增李斯特菌。各检测引物组特异性强，能在同一反应体系中准确检测沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌基因组DNA。
Description
技术领域
本发明属微生物检测领域，涉及一种沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌四重快速检测方法及其检测引物组和检测试剂盒。
背景技术
沙门氏菌（Salmonella spp）是公共卫生领域的重要致病菌，属革兰氏染色阴性肠杆菌。据统计在世界各国发生的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，我国内陆地区所发生的细菌性食物中毒中也以沙门氏菌为首要原因。除引发食物中毒外，该属的细菌还可以导致胃肠炎、伤寒和副伤寒等疾病。志贺氏菌（Shigella spp）属革兰氏染色阴性肠杆菌，是人类细菌性痢疾最常见的病原菌。近年来，志贺氏菌Ⅰ型的细菌性痢疾已发展为世界性流行趋势，我国至少在十余个省区发生了不同规模流行。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）隶属于葡萄球菌属，革兰氏染色呈阳性。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。单增李斯特菌（Listeria monocytogenes），是一种具有耐热(60℃)、耐低温(4℃)、耐盐、耐干燥等性质的食源性致病菌，1986年，WHO和FDA将其列为20世纪90年代食品四大致病菌之一；2000年，被WHO化列为重点监测的食源性致病菌之一，目前也是我国重点关注的标准外微生物风险因子之一。
根据现行的国家风险监测体系要求，有多类食品均需对这四种食源性致病菌进行检测以排除其污染。常规检测采用传统培养方法，每个致病菌需应用独立的检测方法单独进行检测，工作量大，所涉及培养基品种繁多，检测周期可长达6d以上，且受到检测人员专业背景、检测经验等多种因素影响，容易出现误判。随着分子生物学方法在食品微生物检测中的逐步应用，致病菌的检测效率也逐步提升，但目前所采用的常规单重PCR方法不能实现多种目的菌的同时检测，仍存在较大工作量。多重PCR技术能在同一PCR反应体系内实现对多种目标DNA的同步快速扩增，为病原微生物的鉴定提供了快速，灵敏，特异的方法。
鉴于多重PCR技术有众多优势，现已被逐渐应用于病原微生物的检测。二重和三重PCR检测屡有相关报道。但由于多重 PCR影响因素复杂，不同的引物、模板、引物浓度、模板浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度及其比例等会产生复杂的综合效应，因此所同时检测的目标微生物种类越多，PCR体系建立的难度越大。经国内外文献查询，尚未见有多重PCR应用于沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌快速检测的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种四种食源性致病菌多重PCR检测法及检测引物组和试剂盒。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：本发明沙门氏菌的检测引物组的上游引物具有如SEQ No.1所示的序列，下游引物具有如SEQ No.2所示的序列。
本发明志贺氏菌的检测引物组的上游引物具有如SEQ No.3所示的序列，下游引物具有如SEQ No.4所示的序列。
本发明金黄色葡萄球菌的检测引物组的上游引物具有如SEQ No.5所示的序列，下游引物具有如SEQ No.6所示的序列。
本发明单增李斯特菌的检测引物组的上游引物具有如SEQ No.7所示的序列，下游引物具有如SEQ No.8所示的序列。
本发明使用引物组对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌进行多重PCR检测的方法是：将沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组和金黄色葡萄球菌的检测引物组与待测样品的DNA进行多重PCR反应，反应结束后对反应液进行电泳分析判定，以确定样品中是否含有沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌中的任一种或任几种；其中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.1所示的序列、下游引物具有如SEQ No.2所示的序列，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.3所示的序列、下游引物具有如SEQ No.4所示的序列，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.5所示的序列、下游引物具有如SEQ No.6所示的序列，所述单增李斯特菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.7所示的序列，下游引物具有如SEQ No.8所示的序列。
进一步地，本发明所述多重PCR反应按以下步骤进行：
（1）95℃预变性5min；
（2）95℃变性30s，62-64℃退火30s，72℃延伸100s，共进行35个循环；
（3）72℃延伸7min，4℃保存。
进一步地，本发明在进行所述多重PCR反应的反应液中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.03-0.05μM，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.03-0.05μM，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.15-0.25μM，所述单增李斯特菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.08-0.12μM，并且，还包含有浓度为1.8-2.2mM的 Mg2+、10 %（体积）的10×PCR缓冲液、浓度为0.04-0.06U/μL的DNA聚合酶、浓度各为0.2-0.3mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸。
本发明快速检测试剂盒包括沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、单增李斯特菌的检测引物组、四种阳性对照品、DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、Mg2+、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水；所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.1所示的序列、下游引物具有如SEQ No.2所示的序列，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.3所示的序列、下游引物具有如SEQ No.4所示的序列，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.5所示的序列、下游引物具有如SEQ No.6所示的序列，所述单增李斯特菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.7所示的序列、下游引物具有如SEQ No.8所示的序列，所述四种阳性对照品分别为沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的标准菌株的基因组DNA。
本发明快速检测试剂盒的2×PCR预混液中，包含有沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、单增李斯特菌的检测引物组、DNA聚合酶、PCR缓冲液、Mg2+、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水，其中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.06-0.1μM，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.06-0.1μM，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.3-0.5μM，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.16-0.24μM，Mg2+的浓度为3.6-4.4mM，2×PCR缓冲液，DNA聚合酶的浓度为0.08-0.12U/μL，三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的浓度各为0.4-0.6mM且三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的摩尔比为1:1:1:1。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明是根据已公开的沙门氏菌侵袭蛋白A（invA)基因序列、志贺氏菌侵袭性质粒抗原（ipaH）基因序列、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（nuc）基因序列和单增李斯特菌溶血素蛋白（hly）基因序列，分析设计得到本发明的四重PCR检测引物组。本发明的四重PCR检测引物组特异性强，能准确检测沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌基因组DNA。
（2）本发明能在同一反应体系中同时实现对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的快速检测，准确判断所检样品是否被沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌或单增李斯特菌污染，提高实验室检测效率。
（3）本发明的快速检测方法灵敏度较高，其中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的阳性扩增结果均仅需10pg/μL目的菌基因组DNA，单增李斯特菌的阳性扩增结果仅需1pg/μL目的菌基因组DNA。
（4）本发明的检测方法能在1d内完成对四种食源性致病菌的快速筛选检测，相对于常规平板分离检测法6d的检测周期，本发明检测周期大大缩短。
（5）与常规的平板培养法相比，本发明的检测方法可减少检测环节，从而降低因检测环节过多或人员技术水平和经验的差异造成的误判的几率，使检测结果更为准确可靠。
附图说明
图1显示了对不同目标菌进行单重和多重PCR检测的电泳分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但并不对本发明做任何限定。
实施例1： 沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌四重PCR反应Mg2+浓度测试
本实施例的具体检测方法为：
1、样品DNA的提取
1.1、将沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌标准菌株分别接种于营养肉汤，单增李斯特菌标准菌株接种于脑心浸液肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取上述培养产物中的细菌DNA，备用。
2、多重PCR反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物invAF具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物ipaHF具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列；用于单增李斯特菌检测的上游引物hlyF具有如SEQ No.7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。
2.2、多重PCR反应体系
2.2.1、沙门氏菌的多重PCR反应体系
应用不同的Mg2+浓度分别建立6组沙门氏菌多重PCR反应体系，具体如下：
各组反应体系的体积为25μL，分别包括浓度均为0.04μM的所述沙门氏菌检测的上游引物invAF和下游引物invAR、浓度均为0.04μM的所述志贺氏菌检测的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，浓度均为0.2μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF和下游引物nucR，浓度均为0.1μM的所述单增李斯特菌检测的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10%（体积）的10×PCR缓冲液，浓度为0.05U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.2mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），沙门氏菌基因组DNA模板1μL；并且在以上6组反应体系中，Mg2+浓度分别为：1.4mM、1.6mM、1.8mM、2.0mM、2.2mM、2.4mM；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.2.2、志贺氏菌的多重PCR反应体系
应用不同的Mg2+浓度分别建立6组志贺氏菌多重PCR反应体系，具体如下：
各组反应体系的体积为25μL，分别包括浓度均为0.04μM的沙门氏菌检测的上游引物invAF和下游引物invAR、浓度均为0.04μM的志贺氏菌检测的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，浓度均为0.2μM的金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF和下游引物nucR，浓度均为0.1μM的单增李斯特菌检测的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 %（体积）的10×PCR缓冲液，浓度为0.05U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.2mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），志贺氏菌基因组DNA模板1μL；并且在以上6组反应体系中，Mg2+浓度分别为：1.4mM、1.6mM、1.8mM、2.0mM、2.2mM、2.4mM；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.2.3、金黄色葡萄球菌的多重PCR反应体系
应用不同的Mg2+浓度分别建立6组金黄色葡萄球菌多重PCR反应体系，具体如下：
各组反应体系的体积为25μL，分别包括浓度均为0.04μM的沙门氏菌检测的上游引物invAF和下游引物invAR、浓度均为0.04μM的志贺氏菌检测的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，浓度均为0.2μM的金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF和下游引物nucR，浓度均为0.1μM的单增李斯特菌检测的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 %（体积）的10×PCR缓冲液，浓度为0.05U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.2mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），金黄色葡萄球菌基因组DNA模板1μL；并且在以上6组反应体系中，Mg2+浓度分别为：1.4mM、1.6mM、1.8mM、2.0mM、2.2mM、2.4mM；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.2.4、单增李斯特菌的多重PCR反应体系
应用不同的Mg2+浓度分别建立6组单增李斯特菌多重PCR反应体系，具体如下：
各组反应体系的体积为25μL，分别包括浓度均为0.04μM的沙门氏菌检测的上游引物invAF和下游引物invAR、浓度均为0.04μM的志贺氏菌检测的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，浓度均为0.2μM的金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF和下游引物nucR，浓度均为0.1μM的单增李斯特菌检测的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 %（体积）的10×PCR缓冲液，浓度为0.05U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.2mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），单增李斯特菌基因组DNA模板1μL；并且在以上6组反应体系中，Mg2+浓度分别为：1.4mM、1.6mM、1.8mM、2.0mM、2.2mM、2.4mM；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、多重PCR反应条件
应用PCR仪，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸100s，共进行35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
2.4、结果观察
将以上反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。其中沙门氏菌扩增时，当Mg2+浓度在1.6-2.2mM区间时，呈现出明亮的、单一的电泳条带；志贺氏菌扩增时，当Mg2+浓度在1.8-2.2mM区间时，呈现出明亮的、单一的电泳条带；金黄色葡萄球菌扩增时，当Mg2+浓度在1.6-2.4mM区间时，呈现出明亮的、单一的电泳条带；单增李斯特菌扩增时，当Mg2+浓度在1.6-2.2mM区间时，呈现出明亮的、单一的电泳条带。综合四种目标菌检测时的Mg2+浓度范围，确定该四重重检测方法的最佳Mg2+浓度为1.8-2.2mM。
实施例2 ：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌四重PCR反应退火温度测试
本实施例具体检测方法如下：
1、样品DNA的提取
1.1、将沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌标准菌株分别接种于营养肉汤，单增李斯特菌标准菌株接种于脑心浸液肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上培养产物中的细菌DNA。
2、多重PCR反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物invAF具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物ipaHF具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列；用于单增李斯特菌检测的上游引物hlyF具有如SEQ No.7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。
2.2、多重PCR反应体系
2.2.1、沙门氏菌的多重PCR反应体系
应用不同的退火温度分别建立6组沙门氏菌多重PCR反应体系，具体如下：
各组反应体系的体积为25μL，分别包括浓度均为0.04μM的沙门氏菌检测的上游引物invAF和下游引物invAR、浓度均为0.04μM的志贺氏菌检测的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，浓度均为0.2μM的金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF和下游引物nucR，浓度均为0.1μM的单增李斯特菌检测的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 %（体积）的10×PCR缓冲液，浓度为2.0mM的Mg2+，浓度为0.05U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.2mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），沙门氏菌基因组DNA模板1μL。
2.2.2、志贺氏菌的多重PCR反应体系
应用不同的退火温度分别建立6组志贺氏菌多重PCR反应体系，具体如下：
各组反应体系的体积为25μL，分别包括浓度均为0.04μM的沙门氏菌检测的上游引物invAF和下游引物invAR、浓度均为0.04μM的志贺氏菌检测的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，浓度均为0.2μM的金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF和下游引物nucR，浓度均为0.1μM的单增李斯特菌检测的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 %（体积）的10×PCR缓冲液，浓度为2.0mM的Mg2+，浓度为0.05U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.2mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），志贺氏菌基因组DNA模板1μL。
2.2.3、金黄色葡萄球菌的多重PCR反应体系
应用不同的退火温度分别建立6组金黄色葡萄球菌多重PCR反应体系，具体如下：
各组反应体系的体积为25μL，分别包括浓度均为0.04μM的所述沙门氏菌检测的上游引物invAF和下游引物invAR、浓度均为0.04μM的所述志贺氏菌检测的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，浓度均为0.2μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF和下游引物nucR，浓度均为0.1μM的所述单增李斯特菌检测的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 %（体积）的10×PCR缓冲液，浓度为2.0mM的Mg2+，浓度为0.05U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.2mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），金黄色葡萄球菌基因组DNA模板1μL。
2.2.4、单增李斯特菌的多重PCR反应体系
应用不同的退火温度分别建立6组单增李斯特菌多重PCR反应体系，具体如下：
各组反应体系的体积为25μL，分别包括浓度均为0.04μM的所述沙门氏菌检测的上游引物invAF和下游引物invAR、浓度均为0.04μM的所述志贺氏菌检测的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，浓度均为0.2μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF和下游引物nucR，浓度均为0.1μM的所述单增李斯特菌检测的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 %（体积）的10×PCR缓冲液，浓度为2.0mM的Mg2+，浓度为0.05U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.2mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），单增李斯特菌基因组DNA模板1μL。
2.3、多重PCR反应条件
应用PCR仪，将本实施例的2.2中所述6组沙门氏菌多重PCR反应体系、6组志贺氏菌多重PCR反应体系、6组金黄色葡萄球菌多重PCR反应体系、6组单增李斯特菌多重PCR反应体系，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60-65℃退火30s，72℃延伸100s，共进行35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。其中，同一种菌的6组反应体系分别在6种不同退火温度下进行反应，所采用的温度分别为：60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃。
2.4、结果观察
将以上反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。其中沙门氏菌扩增时，当反应温度在60-64℃区间时，呈现明亮的、单一的电泳条带；志贺氏菌扩增时，当反应温度在62-64℃区间时，呈现明亮的、单一的电泳条带；金黄色葡萄球菌扩增时，当反应温度在61-64℃区间时，呈现明亮的、单一的电泳条带；单增李斯特菌扩增时，当反应温度在61-65℃区间时，呈现明亮的、单一的电泳条带。综合四种目标菌检测时的温度范围，确定该四重检测体系的最佳反应温度为62-64℃。
实施例3： 四重PCR检测对沙门氏菌的检测灵敏度
本实施例的具体检测方法为：
1、样品DNA的提取
1.1、将沙门氏菌标准菌株接种于营养肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取以上培养产物中细菌DNA。
2、多重PCR反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物invAF具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物ipaHF具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物ipaH具有如RSEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列；用于单增李斯特菌检测的上游引物hlyF具有如SEQ No.7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。
2.2、多重PCR的反应体系
建立8个反应管，各反应管中反应体系的总体积为25μL，包括浓度均为0.04μM的所述沙门氏菌检测的上游引物invAF和下游引物invAR、浓度均为0.04μM的所述志贺氏菌检测的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，浓度均为0.2μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF和下游引物nucR，浓度均为0.1μM的所述单增李斯特菌检测的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 %（体积）的10×PCR缓冲液，浓度为2.0mM的Mg2+，浓度为0.05U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.2mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP）；各反应管还需分别加入沙门氏菌基因组DNA模板液1μL，所用沙门氏菌基因组DNA模板液的浓度分别为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL，以测试该检测方法对沙门氏菌的检测灵敏度；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、多重PCR反应条件
应用PCR仪，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸100s，共进行35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
2.4、结果观察
将以上各反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。
通过对反应产物的电泳分析，发现当模板DNA液的浓度降至10pg/μL时，仍可见较为明亮的、单一的电泳条带。说明本发明方法对沙门氏菌DNA的检测灵敏度为10fg/μL。
实施例4：四重PCR检测对志贺氏菌的检测灵敏度
本实施例具体检测方法为：
1、样品DNA的提取
1.1、将志贺氏菌标准菌株接种于营养肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取以上培养产物中细菌DNA。
2、多重PCR反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物invAF具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物ipaHF具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列；用于单增李斯特菌检测的上游引物hlyF具有如SEQ No.7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。
2.2、多重PCR的反应体系
建立8个反应管，各反应管中反应体系的总体积为25μL，包括浓度均为0.04μM的所述沙门氏菌检测的上游引物invAF和下游引物invAR、浓度均为0.04μM的所述志贺氏菌检测的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，浓度均为0.2μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF和下游引物nucR，浓度均为0.1μM的所述单增李斯特菌检测的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 %（体积）的10×PCR缓冲液，浓度为2.0mM的Mg2+，浓度为0.05U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.2mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP）；各反应管还需分别加入志贺氏菌基因组DNA模板液1μL，所用志贺氏菌基因组DNA模板液的浓度分别为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL，以测试该检测方法对志贺氏菌的检测灵敏度；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、多重PCR反应条件
应用PCR仪，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸100s，共进行35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
2.4、结果观察
将以上各反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。
通过对反应产物的电泳分析，发现当模板DNA液的浓度降至10pg/μL时，仍可见较为明亮的、单一的电泳条带。说明本发明方法对志贺氏菌DNA的检测灵敏度为10pg/μL。
实施例5 ：四重PCR检测对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度
本实施例具体检测方法为：
1、样品DNA的提取
1.1、将金黄色葡萄球菌标准菌株分别接种于营养肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA分别提取试剂盒提取以上培养产物中的细菌DNA。
2、多重PCR反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物invAF具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物ipaHF具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列；用于单增李斯特菌检测的上游引物hlyF具有如SEQ No.7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。
2.2、多重PCR的反应体系
建立8个反应管，各反应管中反应体系的总体积为25μL，包括浓度均为0.04μM的所述沙门氏菌检测的上游引物invAF和下游引物invAR、浓度均为0.04μM的所述志贺氏菌检测的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，浓度均为0.2μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF和下游引物nucR，浓度均为0.1μM的所述单增李斯特菌检测的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 %（体积）的10×PCR缓冲液，浓度为2.0mM的Mg2+，浓度为0.05U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.2mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP）；各反应管还需分别加入金黄色葡萄球菌基因组DNA模板液1μL，所用金黄色葡萄球菌基因组DNA模板液的浓度分别为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL，以测试该检测方法对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、多重PCR反应条件
应用PCR仪，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸100s，共进行35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
2.4、结果观察
将以上各反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。
通过对反应产物的电泳分析，发现当模板DNA液的浓度降至10pg/μL时，仍可见较为明亮的、单一的电泳条带。说明本发明方法对金黄色葡萄球菌DNA的检测灵敏度为10pg/μL。
实施例6 ：四重PCR检测对单增李斯特菌的检测灵敏度
本实施例具体检测方法为：
1、样品DNA的提取
1.1、将单增李斯特菌标准菌株接种于脑心浸液肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA分别提取试剂盒提取以上培养产物中的细菌DNA。
2、多重PCR反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物invAF具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物ipaHF具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列；用于单增李斯特菌检测的上游引物hlyF具有如SEQ No.7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。
2.2、多重PCR的反应体系
建立8个反应管，各反应管中反应体系的总体积为25μL，包括浓度均为0.04μM的所述沙门氏菌检测的上游引物invAF和下游引物invAR、浓度均为0.04μM的所述志贺氏菌检测的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，浓度均为0.2μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF和下游引物nucR，浓度均为0.1μM的所述单增李斯特菌检测的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 %（体积）的10×PCR缓冲液，浓度为2.0mM的Mg2+，浓度为0.05U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.2mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP）；各反应管还需分别加入金黄色葡萄球菌基因组DNA模板液1μL，所用单增李斯特菌基因组DNA模板液的浓度分别为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL，以测试该检测方法对单增李斯特菌的检测灵敏度；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、多重PCR反应条件
应用PCR仪，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸100s，共进行35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
2.4、结果观察
将以上各反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。
通过对反应产物的电泳分析，发现当模板DNA液的浓度降至1pg/μL时，仍可见较为明亮的、单一的电泳条带。说明本发明方法对单增李斯特菌DNA的检测灵敏度为1pg/μL。
实施例7： 四重PCR检测的特异性分析
本实施例具体检测方法为：
1、样品DNA的提取
1.1、将沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌标准菌株分别接种于营养肉汤，单增李斯特菌接种于脑心浸液肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上培养产物中细菌DNA。
1.3、将四组DNA提取液按等体积比例混合，作为最终多重PCR检测模板。
2、多重PCR反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物invAF具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物ipaHF具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列；用于单增李斯特菌检测的上游引物hlyF具有如SEQ No.7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。
2.2、多重PCR的反应体系
反应体系总体积为100μL，包括浓度均为0.04μM的所述沙门氏菌检测的上游引物invAF和下游引物invAR、浓度均为0.04μM的所述志贺氏菌检测的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，浓度均为0.2μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF和下游引物nucR，浓度均为0.1μM的所述单增李斯特菌检测的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10%（体积）的10×PCR缓冲液，浓度为2.0mM的Mg2+，浓度为0.05U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.2mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），混合DNA模板16μL；反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、多重PCR反应条件
应用PCR仪，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸100s，共进行35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
3、产物回收测序验证
3.1、将以上反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳40min，将分子量各异的四条扩增产物分别割胶回收，应用QIAGEN琼脂糖凝胶纯化试剂盒进行纯化，作为测序模板。
3.2、分别对所回收的产物进行测序分析，其中沙门氏菌测序引物序列分别如SEQ No.1和SEQ No.2所示，志贺氏菌测序引物序列分别如SEQ No.3和SEQ No.4所示，金黄色葡萄球菌测序引物序列分别如SEQ No.5和SEQ No.6所示，单增李斯特菌测序引物序列分别如SEQ No.7和SEQ No.8所示。
3.3、对沙门氏菌扩增产物的测序结果与invA基因序列（GeneBank NC_003198.1）的吻合度达99%；对志贺氏菌扩增产物的测序结果与ipaH基因序列（GeneBank AY206449.1）吻合度达99%；对金黄色葡萄球菌扩增产物的测序结果与nuc基因序列（GeneBank NC_002952.2）吻合度达98%；对单增李斯特菌扩增产物测序结果与hly基因序列（GeneBank NC_003210.1）吻合度达98%。由此可见，通过对本实施例多重PCR产物测序分析，可以验证本发明方法对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的检测特异性强，所扩增的产物序列与预期吻合。
实施例8 ：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌四重PCR检测
本实施例采用乳粉作为检测样品，具体检测步骤为：
1、样品DNA的提取
1.1、分别称取25g乳粉样品至225mL缓冲蛋白胨水培养液、225mL GN增菌液、225mL 7.5%氯化钠肉汤培养液和225mL李斯特菌增菌液中，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上四种培养产物中的细菌DNA。
1.3、将上述四组DNA提取液按等体积比例混合，作为最终多重PCR检测模板。
2、多重PCR反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物invAF具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物ipaHF具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列；用于单增李斯特菌检测的上游引物hlyF具有如SEQ No.7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。
2.2、多重PCR的反应体系
建立2个平行反应管，各反应管的反应体系总体积为25μL，包括浓度均为0.03μM的所述沙门氏菌检测的上游引物invAF和下游引物invAR、浓度均为0.03μM的所述志贺氏菌检测的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，浓度均为0.15μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF和下游引物nucR，浓度均为0.08μM的所述单增李斯特菌检测的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 %（体积）的10×PCR缓冲液，浓度为1.8mM的Mg2+，浓度为0.04U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.2mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），混合DNA模板4μL；反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、多重PCR的反应条件
应用PCR仪，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸100s，共进行35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
2.4、结果观察
将以上各反应液在0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，然后在凝胶成像系统中观察。图1显示了对本实施例样品分别进行单重和多重PCR的检测结果，其中1号和10号泳道为DL2000的DNA maker；2号和3号泳道为金黄色葡萄球菌检测结果，呈现分子量约为250bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有金黄色葡萄球菌；4号和5号泳道为志贺氏菌检测结果，呈现分子量约为600bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有志贺氏菌；6号和7号泳道为沙门氏菌检测结果，呈现分子量约为430bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有沙门氏菌；8号和9号泳道为单增李斯特菌检测结果，呈现分子量约为1000bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有单增李斯特菌。11号和12号泳道为四重PCR扩增结果，在分子量约为250bp、430bp、600bp和1000bp处分别呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的样品中存在沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。
2.5、结果验证
采用GB 4789.4-2010《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、GB/T 4789.5-2003《食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验》、GB 4789.10-2010《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》和GB 4789.30-2010《食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》对本实施例样品进行检测，检出沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌，与多重PCR检测结果一致。
实施例9： 沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌四重PCR检测
本实施例采用乳粉作为检测样品，具体检测步骤为：
1、样品DNA的提取
1.1、分别称取25g乳粉样品至225mL缓冲蛋白胨水培养液、225mL GN增菌液、225mL 7.5%氯化钠肉汤培养液和225mL李斯特菌增菌液中，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上四种培养产物中的细菌DNA。
1.3、将上述四组DNA提取液按等体积比例混合，作为最终多重PCR检测模板。
2、多重PCR反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物invAF具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物ipaHF具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列；用于单增李斯特菌检测的上游引物hlyF具有如SEQ No.7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。
2.2、多重PCR的反应体系
建立2个平行反应管，各反应管的反应体系总体积为25μL，包括浓度均为0.04μM的所述沙门氏菌检测的上游引物invAF和下游引物invAR、浓度均为0.04μM的所述志贺氏菌检测的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，浓度均为0.2μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF和下游引物nucR，浓度均为0.1μM的所述单增李斯特菌检测的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 %（体积）的10×PCR缓冲液，浓度为2.0mM的Mg2+，浓度为0.05U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.25mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），混合DNA模板4μL；反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、多重PCR的反应条件
应用PCR仪，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸100s，共进行35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
2.4、结果观察
将以上各反应液在0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，然后在凝胶成像系统中观察，在分子量约为250bp、430bp、600bp和1000bp处分别呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的样品中存在沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。
2.5、结果验证
采用GB 4789.4-2010《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、GB/T 4789.5-2003《食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验》、GB 4789.10-2010《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》和GB 4789.30-2010《食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》对本实施例样品进行检测，检出沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌，与多重PCR检测结果一致。
实施例10： 沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌四重PCR检测
本实施例采用乳粉作为检测样品，具体检测步骤为：
1、样品DNA的提取
1.1、分别称取25g乳粉样品至225mL缓冲蛋白胨水培养液、225mL GN增菌液、225mL 7.5%氯化钠肉汤培养液和225mL李斯特菌增菌液中，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上四种培养产物中的细菌DNA。
1.3、将上述四组DNA提取液按等体积比例混合，作为最终检测模板。
2、多重PCR反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物invAF具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物invAR具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物ipaHF具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物ipaHR具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物nucR具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列；用于单增李斯特菌检测的上游引物hlyF具有如SEQ No.7所示的核苷酸序列，下游引物hlyR具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。
2.2、多重PCR的反应体系
建立2个平行反应管，各反应管的反应体系总体积为25μL，包括浓度均为0.05μM的所述沙门氏菌检测的上游引物invAF和下游引物invAR、浓度均为0.05μM的所述志贺氏菌检测的上游引物ipaHF和下游引物ipaHR，浓度均为0.25μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物nucF和下游引物nucR，浓度均为0.12μM的所述单增李斯特菌检测的上游引物hlyF和下游引物hlyR，10 %（体积）的10×PCR缓冲液，浓度为2.2mM的Mg2+，浓度为0.06U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.3mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），混合DNA模板4μL；反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、多重PCR的反应条件
应用PCR仪，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸100s，共进行35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
2.4、结果观察
将以上各反应液在0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，然后在凝胶成像系统中观察，在分子量约为250bp、430bp、600bp和1000bp处分别呈现明亮目的扩增条带，说明本实施例的样品中存在沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。
2.5、结果验证
采用GB 4789.4-2010《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、GB/T 4789.5-2003《食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验》、GB 4789.10-2010《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》和GB 4789.30-2010《食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》对本实施例样品进行检测，检出沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌，与多重PCR检测结果一致。
实施例11：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌四重PCR检测试剂盒
本试剂盒由如下试剂组成：
1、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌多重PCR检测引物，包括：
用于沙门氏菌多重PCR检测的上游引物，具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列；用于沙门氏菌多重PCR检测的下游引物，具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列。
用于志贺氏菌多重PCR检测的上游引物，具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌多重PCR检测的下游引物，具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列。
用于金黄色葡萄球菌多重PCR检测的上游引物，具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌多重PCR检测的下游引物，具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
用于单增李斯特菌多重PCR检测的上游引物，具有如SEQ No.7所示的核苷酸序列；用于单增李斯特菌多重PCR检测的下游引物，具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。
2、DNA聚合酶；
3、阳性对照品：沙门氏菌的标准菌株的基因组、志贺氏菌的标准菌株的基因组DNA、金黄色葡萄球菌的标准菌株的基因组DNA和单增李斯特菌的标准菌株的基因组DNA。
4、空白对照品：无菌超纯水；
5、10×PCR缓冲液；
6、MgSO4溶液；
7、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的混合溶液且三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的摩尔比为1:1:1:1；
8、上样缓冲液。
实施例12：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌四重PCR检测试剂盒
本实施例试剂盒由如下试剂组成：
1、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌四重PCR检测2×预混液，该预混液的具体组成及浓度为：
包括浓度均为0.06μM的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.06μM的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.3μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.16μM的所述单增李斯特菌检测的上游引物和下游引物，2×PCR缓冲液，浓度为3.6mM的Mg2+，浓度为0.08U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.4 mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP）。
用于沙门氏菌多重PCR检测的上游引物，具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列；用于沙门氏菌多重PCR检测的下游引物，具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列。
用于志贺氏菌多重PCR检测的上游引物，具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌多重PCR检测的下游引物，具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列。
用于金黄色葡萄球菌多重PCR检测的上游引物，具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌多重PCR检测的下游引物，具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
用于单增李斯特菌多重PCR检测的上游引物，具有如SEQ No.7所示的核苷酸序列；用于单增李斯特菌多重PCR检测的下游引物，具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。
2、阳性对照品：
沙门氏菌基因组DNA；
志贺氏菌基因组DNA；
金黄色葡萄球菌基因组DNA；
单增李斯特菌基因组DNA。
3、空白对照品：无菌超纯水；
4、上样缓冲液。
实施例13：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌四重PCR检测试剂盒
本实施例试剂盒由如下试剂组成：
1、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌四重PCR检测2×预混液，该预混液的具体组成及浓度为：
包括浓度均为0.08μM的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.08μM的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.4μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.2μM的所述单增李斯特菌检测的上游引物和下游引物，2×PCR缓冲液，浓度为4.0mM的Mg2+，浓度为0.1U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.5mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP）。
用于沙门氏菌多重PCR检测的上游引物，具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列；用于沙门氏菌多重PCR检测的下游引物，具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列。
用于志贺氏菌多重PCR检测的上游引物，具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌多重PCR检测的下游引物，具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列。
用于金黄色葡萄球菌多重PCR检测的上游引物，具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌多重PCR检测的下游引物，具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
用于单增李斯特菌多重PCR检测的上游引物，具有如SEQ No.7所示的核苷酸序列；用于单增李斯特菌多重PCR检测的下游引物，具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。
2、阳性对照品：
沙门氏菌基因组DNA；
志贺氏菌基因组DNA；
金黄色葡萄球菌基因组DNA；
单增李斯特菌基因组DNA。
3、空白对照品：无菌超纯水；
4、上样缓冲液。
实施例14：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌四重PCR检测试剂盒
本实施例试剂盒由如下试剂组成：
1、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌四重PCR检测2×预混液，该预混液的具体组成及浓度为：
包括浓度均为0.1μM的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.1μM的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.5μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.24μM的所述单增李斯特菌检测的上游引物和下游引物，2×PCR缓冲液，浓度为4.4mM的Mg2+，浓度为0.12U/μL的DNA聚合酶，浓度各为0.6mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP）。
用于沙门氏菌多重PCR检测的上游引物，具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列；用于沙门氏菌多重PCR检测的下游引物，具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列。
用于志贺氏菌多重PCR检测的上游引物，具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌多重PCR检测的下游引物，具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列。
用于金黄色葡萄球菌多重PCR检测的上游引物，具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌多重PCR检测的下游引物，具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
用于单增李斯特菌多重PCR检测的上游引物，具有如SEQ No.7所示的核苷酸序列；用于单增李斯特菌多重PCR检测的下游引物，具有如SEQ No.8所示的核苷酸序列。
2、阳性对照品：
沙门氏菌基因组DNA；
志贺氏菌基因组DNA；
金黄色葡萄球菌基因组DNA；
单增李斯特菌基因组DNA。
3、空白对照品：无菌超纯水；
4、上样缓冲液。
<110> 浙江省质量技术监督检测研究院
<120> 四种食源性致病菌多重PCR检测法及检测引物组和试剂盒
<160> 8
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgatattggt gtttatgggg tcgt 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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<212> DNA
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<400> 7
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcgtaagtct ccgaggttgc 20
Claims (9)
1.一种沙门氏菌的检测引物组，其特征是：其上游引物的序列如SEQ No.1所示，其下游引物的序列如SEQ No.2所示。
2.一种志贺氏菌的检测引物组，其特征是：其上游引物的序列如SEQ No.3所示，其下游引物的序列如SEQ No.4所示。
3.一种金黄色葡萄球菌的检测引物组，其特征是：其上游引物的序列如SEQ No.5所示，其下游引物的序列如SEQ No.6所示。
4.一种单增李斯特菌的检测引物组，其特征是：其上游引物的序列如SEQ No.7所示，其下游引物的序列如SEQ No.8所示。
5.一种使用引物组对食品中的沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌进行多重PCR检测的方法，其特征是：将沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组和单增李斯特菌的检测引物组组与待测样品的DNA进行多重PCR反应，反应结束后对反应液进行电泳分析以确定样品中是否含有沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌或单增李斯特菌；其中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物的序列如SEQ No.1所示、下游引物的序列如SEQ No.2所示，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物的序列如SEQ No.3所示、下游引物的序列如SEQ No.4所示，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物的序列如SEQ No.5所示、下游引物的序列如SEQ No.6所示，所述单增李斯特菌的检测引物组中的上游引物的序列如SEQ No.7所示、下游引物的序列如SEQ No.8所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是：所述多重PCR反应按以下步骤进行：
（1）95℃预变性5min；
（2）95℃变性30s，62-64℃退火30s，72℃延伸100s，共进行35个循环；
（3）72℃延伸7min，4℃保存。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征是：在进行所述多重PCR反应的反应液中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.03-0.05μM，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.03-0.05μM，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.15-0.25μM，所述单增李斯特菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.08-0.12μM；并且，在进行所述多重PCR反应的反应液中，还包含有浓度为1.8-2.2mM的Mg2+、10 %（体积）的10×PCR缓冲液、浓度为0.04-0.06U/μL的DNA聚合酶、浓度各为0.2-0.3mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸。
8.一种快速检测试剂盒，其特征在于：包括沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、单增李斯特菌的检测引物组、四种阳性对照品、DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、Mg2+、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水；所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物的序列如SEQ No.1所示、下游引物的序列如SEQ No.2所示，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物的序列如SEQ No.3所示、下游引物的序列如SEQ No.4所示，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物的序列如SEQ No.5所示、下游引物的序列如SEQ No.6所示，所述单增李斯特菌的检测引物组中的上游引物的序列如SEQ No.7所示、下游引物的序列如SEQ No.8所示，所述四种阳性对照品分别为沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的标准菌株的基因组DNA。
9.一种快速检测试剂盒，其特征在于：包含2×PCR预混液，所述2×PCR预混液中包含有沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、单增李斯特菌的检测引物组、DNA聚合酶、2×PCR缓冲液、Mg2+、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物的序列如SEQNo.1所示、下游引物的序列如SEQ No.2所示，沙门氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.06-0.1μM；所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物的序列如SEQ No.3所示、下游引物的序列如SEQ No.4，志贺氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.06-0.1μM；所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物的序列如SEQ No.5所示、下游引物的序列如SEQ No.6所示，金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.3-0.5μM；所述单增李斯特菌的检测引物中的上游引物的序列如SEQ No.7所示、下游引物的序列如SEQ No.8所示，单增李斯特菌的检测引物中的上游引物和下游引物的浓度均为0.16-0.24μM；Mg2+的浓度为3.6-4.4mM，DNA聚合酶的浓度为0.08-0.12 U/μL，三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的浓度各为0.4-0.6mM且三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的摩尔比为1:1:1:1。
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