CN105463063B - 针对食品中的三类致病菌的多重pcr检测用引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于食品微生物安全检测领域，提供了一种针对食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的多重PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法。本发明的多重PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法通过组合利用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的种属特异性鉴别基因和耐药性相关基因，可实现检测覆盖范围广、特异性强且灵敏度高的技术效果，并且检测耗时短、操作较简单、设备要求低、通量高，可以节省大量的人力、物力和财力，适合快速检测的要求，易于在实际生产中推广应用。

Description

针对食品中的三类致病菌的多重PCR检测用引物组、试剂盒及 检测方法

技术领域

本发明属于食品微生物安全检测领域，涉及利用多重PCR技术对食品中的致病菌进行快速检测鉴定的引物组、试剂盒及方法。具体而言，本发明涉及针对食品中的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella sp.)和志贺氏菌(Shigellasp.)的多重PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

近几年，食品安全事件频频出现，食品安全问题也越来越被社会公众所关注和重视。许多食源性致病菌通过水和食物传播而引发食源性疾病，其发病率和死亡率都呈现逐渐增加的趋势。在世界范围内，每年有超过30％的人口感染食源性疾病，造成数十亿美元的花销。预防和控制食源性疾病的发生和传播，已成为解决社会食品安全问题的重要举措之一。能否及时有效地控制与预防食源性疾病的发生和传播，关键在于能否快速准确地检测与鉴定食源性致病菌。

金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌是引起食源性疾病的主要的三类致病菌，国内外由这三类致病菌引发的食物中毒事件频频发生。这三类致病菌在食品中分布比较普遍，其污染食品后，不仅致使食品腐败变质，还产生多种毒素，导致严重的疾病。例如，金黄色葡萄球菌会引起局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎、败血症、脓毒症等；沙门氏菌会引起胃肠炎、菌血症、肠热症等；志贺氏菌能分泌强烈的内毒素，引起发热、神志不清、甚至中毒性休克，破坏肠粘膜，引起炎症、溃疡，导致肠功能紊乱。

目前世界各国都把金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌列为食品卫生的法定检测项目。在检测手段上，目前国内外检测机构仍主要采用FDA、AOAC、ISO和GB等标准对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌进行检测，整个过程一般需要3-5天，上述检测手段操作复杂，检测通量不高，很难满足对食源性致病菌进行快速准确检测的现实需求。因 此，建立新的对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌进行快速检测的方法就显得尤为迫切。

近年来，借助于免疫学和分子生物学等方法，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的快速检测有了很大发展，目前国内外针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌进行快速检测的方法很多，如：PCR-凝胶电泳法、实时荧光PCR法、基因芯片测试法、全自动细菌生化检定仪、酶联免疫吸附法、荧光免疫检测法(VIDAS)、胶体金免疫测试条等。但是，免疫学方法如酶联免疫吸附法、免疫荧光法和乳胶凝集试验等在操作程序、检测时间和特异性等方面尚不理想，并且检测成本极高；而在分子生物学方法方面，如PCR技术则以灵敏、特异、简便、快速、成本低等优点被越来越多地应用。

以单目标基因为检测对象的常规单重PCR技术通量低，无法实现对多种目的菌中的多个目标基因的同时检测。相比之下，多重PCR技术采用将多个目标基因联用的方式，在同一PCR反应体系内实现对来自不同细菌的多个目标基因的同步扩增，从而能够快速、灵敏、特异地检测多种食源性致病菌。然而，由于多种因素，例如所选取的引物和模板的种类和浓度、Mg²⁺和dNTP的浓度等均可能对多重PCR的结果产生影响，因此，同时检测的目标微生物种类越多，建立PCR体系的难度越大，检测的特异性及灵敏度越难得到保证。

在影响针对多菌种的多重PCR检测的诸多因素中，目标基因的数目和种类的选取至关重要。若目标基因的数目过多，PCR体系中加入的引物对数量过多，产生非预期反应的概率增大，导致电泳鉴定图中出现杂带或造成拖尾等，从而影响检测效率；而若将引物加入不同的PCR体系分别进行反应，势必又会降低通量。另外，目标基因种类的选取对于是否能够有效进行多重PCR检测而言也是关键因素之一：如果目标基因特异性过高(即种属分布过窄)，例如像大多数现有方法中所侧重的主要用于医学检测目的的耐药性相关基因和毒素基因等，会造成检测覆盖种类不足，从而造成漏检等问题；反之，则可能会引起假阳性率高等弊端。因此，目前对目标基因数目和种类的选择仍亟待优化。具体而言，如何选择对于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的全部菌株而言均具有 高覆盖度和高特异性的目标基因，仍是多重PCR检测中的难题。

进而，在目标基因选定后，针对多个目标基因进行的引物设计同样可能从根本上影响多重PCR检测的结果：由于需要在同一PCR体系中针对不同目标基因进行同步扩增，适宜各引物对的反应条件需能够彼此配合、且各引物对之间不会相互干扰，从而确保针对各目标基因的PCR反应均能够顺利、准确地进行。

此外，考虑到食品中仅含有少量金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或志贺氏菌即会引发食源性疾病，对检测方法的灵敏度也存在较高要求。现有的PCR技术以金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或志贺氏菌的基因组DNA为模板时的检测灵敏度通常在10～100pg/μL左右，且尚未有关于同时以金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌中的至少两种的基因组DNA为模板的多重PCR检测的灵敏度的报道。可见，现有技术并不能完全满足食品安全国家标准的需求。因此，仍需开发灵敏度更高的PCR检测法。

发明内容

针对以上不足，本发明组合利用了金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的种属特异性鉴别基因及耐药性相关基因，采用多重PCR技术对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌同时进行快速检测。在比对分析金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的种属特异性鉴别基因及耐药性相关基因的基础上，设计筛选出针对三种细菌的种属特异性引物对及引物组，优化组合建立了多重PCR检测体系，并开发了金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌多重PCR检测用试剂盒；同时，结合样品前增菌和前处理技术，建立了检测覆盖范围广、特异性强且灵敏度高的检测方法，由此完成了本发明。

在第一方面，本发明提供了一种用于快速检测食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的多重PCR检测用引物组，所述引物组包括如下引物对：

金黄色葡萄球菌耐甲氧西林关键因子A基因(femA基因)扩增用引物对：

femA-F：AAGCACACAACAAGCGAGATAAC(SEQ ID NO.1)；

femA-R：TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG(SEQ ID NO.2)，

沙门氏菌侵袭基因正调节蛋白A基因(hilA基因)扩增用引物对：

hilA-F：TGAATTACGCTCACAACACCTG(SEQ ID NO.3)；

hilA-R：TGCTAAGCAACCAGATTACGATG(SEQ ID NO.4)，

以及

志贺氏菌侵染性质粒抗原H基因(ipaH基因)扩增用引物对：

ipaH-F：CTCACATGGAACAATCTCCG(SEQ ID NO.5)；

ipaH-R：TCATTCTCTTCACGGCTTCTG(SEQ ID NO.6)。

在第二方面，本发明提供了一种用于快速检测食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的多重PCR检测用试剂盒，所述试剂盒中包含本发明的多重PCR检测用引物组，所述引物组包括如下引物对：

金黄色葡萄球菌耐甲氧西林关键因子A基因(femA基因)扩增用引物对：

femA-F：AAGCACACAACAAGCGAGATAAC(SEQ ID NO.1)；

femA-R：TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG(SEQ ID NO.2)，

沙门氏菌侵袭基因正调节蛋白A基因(hilA基因)扩增用引物对：

hilA-F：TGAATTACGCTCACAACACCTG(SEQ ID NO.3)；

hilA-R：TGCTAAGCAACCAGATTACGATG(SEQ ID NO.4)，

以及

志贺氏菌侵染性质粒抗原H基因(ipaH基因)扩增用引物对：

ipaH-F：CTCACATGGAACAATCTCCG(SEQ ID NO.5)；

ipaH-R：TCATTCTCTTCACGGCTTCTG(SEQ ID NO.6)。

在第三方面，本发明还提供了一种使用本发明的多重PCR检测用引物组或试剂盒对食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌进行快速检测的方法，所述方法包括以下步骤：

a)从所述食品中获取模板DNA的前处理步骤；

b)使用本发明的多重PCR检测用引物组或试剂盒对所述模板DNA进行多重PCR扩增的步骤；

c)对扩增产物进行检测的步骤，

从而对所述食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的存在及含量进行分析。

本发明所建立的针对食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的多重PCR检测用引物组和试剂盒及检测方法通过组合使用金黄色葡萄球菌的耐药性相关基因femA、沙门氏菌的种属特异性鉴别基因hilA以及志贺氏菌的种属特异性鉴别基因ipaH，具有检测适用面广、对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌种属覆盖相对全面、特异性强、灵敏度高等优势，从而提供了一种同时针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌进行多重PCR检测的方法。此外，本发明提供的针对食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的多重PCR检测方法还具备灵敏度高、特异性强、检测耗时短、操作较简单、设备要求低等特点，可大大节省检测成本和时间，提高检测的通量及准确性，具有广泛的推广应用市场前景。

具体实施方式

根据本发明的一些实施方式，除本发明的多重PCR检测用引物组外，本发明的多重PCR检测用试剂盒中可进一步包含反应缓冲液、4种脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶等成分。

根据本发明一些优选的实施方式，除本发明的多重PCR检测用引物组外，本发明的多重PCR检测用试剂盒中可进一步包含具有如下成分的PCR反应基础溶液：Tris-HCl；KCl；MgCl₂；dATP、dTTP、dGTP及dCTP；以及Taq DNA聚合酶。

根据本发明一些更为优选的实施方式，在本发明的多重PCR检测用试剂盒中，各成分以如下浓度包含于25μL的PCR最终反应溶液中：

根据本发明一些优选的实施方式，本发明的多重PCR检测用试剂盒中还含有阴性对照DNA和阳性对照DNA。

根据本发明一些进一步优选的实施方式，本发明的多重PCR检测用试剂盒中的所述阴性对照DNA来自大肠杆菌(大肠埃希氏菌，Escherichia coli)菌株CGMCC1.3373，所述阳性对照DNA来自金黄色葡萄球菌金黄亚种(Staphylococcus aureus subsp.aureus)菌株CGMCC1.2465、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)菌株CICC21482和福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)菌株CGMCC1.1868。

根据本发明的一些实施方式，在从食品中获取模板DNA的前处理步骤中，可利用可商购的细菌基因组DNA提取试剂盒获取样品中的DNA；或者，也可通过水煮裂解法获取样品中的DNA。

根据本发明一些优选的实施方式，在利用可商购的细菌基因组DNA提取试剂盒获取样品中的DNA时，可采用OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒提取样品中的细菌基因组DNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定浓度，分装后于-20℃保存备用。

根据本发明另一些优选的实施方式，在通过水煮裂解法获取样品中的DNA时，可取相应培养物1mL于1.5mL离心管中，10000r/min离心5min，弃去上清液；将沉淀用500μL TES缓冲液洗涤2次，弃去上清；加入200μL TES缓冲液于离心管中重悬菌体，100℃水浴15min，涡旋振荡裂解释放基因组DNA，随后13000r/min、4℃离心10min，取上清分装后于-20℃保存备用。

根据本发明一些优选的实施方式，在使用本发明的多重PCR检测用引物组或试剂盒对食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌进行检测的方法中，可在从所述食品中获取模板DNA的前处理步骤前，进一步引入对所述食品进行金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌富集培养的步骤(即增菌步骤)。例如，可将待测食品样品与增菌液混合并进行培养，从而实现富集效果。

在本发明一些更为优选的实施方式中，所述增菌步骤为：采用营养肉汤培养基对所述食品进行金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌富集培养，培养温度为37±1℃，培养时间为12-15小时。

根据本发明的一些实施方式，在使用本发明的多重PCR检测用引物组或试剂盒对食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌进行检测的方法中，进行所述多重PCR扩增的反应体系为：以总体积为25μL计，加入浓度为1pg/μL～100ng/μL的模板DNA1μL；反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸7min。

在本发明中，PCR反应的检测灵敏度依照如下方式进行计算：对于某一菌种而言，在25μL的PCR反应体系内分别加入不同浓度的模板DNA1μL，所能检出的模板DNA的最低浓度即为该PCR反应的检测灵敏度。例如，当在25μL的PCR反应体系内分别加入100fg/μL、1pg/μL、10pg/μL、100pg/μL、1ng/μL、10ng/μL及100ng/μL的金黄色葡萄球菌的模板DNA1μL时，若能够在加入1pg/μL、10pg/μL、100pg/μL、1ng/μL、10ng/μL及100ng/μL的金黄色葡萄球菌的模板DNA1μL时检测到相应的目的条带，则所能检出的金黄色葡萄球菌的模板DNA的最低浓度为1pg/μL，该PCR反应对于金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为1pg/μL。

附图说明

图1A-图1C分别示出了金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌基因组DNA的单重PCR检测的电泳结果。

图2A-图2C分别示出了金黄色葡萄球菌/沙门氏菌、金黄色葡萄球菌/志贺氏菌和沙门氏菌/志贺氏菌基因组DNA的二重PCR检测的电泳结果。

图3示出了金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌基因组DNA的三重PCR检测的电泳结果。

实施例

以下实施例和比较例的目的在于对本发明的多重PCR检测用引物组、试剂盒及检测方法的原理及应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的范围。

本部分实验所用的主要培养基和试剂来源为：营养肉汤培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；细菌DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit)购自美国OMEGA公司；Taq DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖购自Biowest公司。

本部分实验所用的主要仪器和设备包括：基因扩增仪(美国ABI公司)、凝胶电泳及成像设备(美国BioRad公司)、以及超微量分光光度计NanoDrop2000(美国ThermoFisher公司)。

本部分实验所用的主要标准菌株均购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)及美国模式培养物集存库(ATCC)。

实施例1：单重PCR反应体系及反应条件的建立

1.引物设计及筛选

根据不同基因在金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌不同菌株基因组中分布的特异性及广泛性，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌各选择3个以上基因作为研究对象。通过NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)的GenBank数据库获取相应序列，并进行生物信息学分析。经过再次筛选，分别选择金黄色葡萄球菌的耐药性相关基因femA、沙门氏菌的种属特异性鉴别基因hilA和志贺氏菌的种属特异性鉴别基因ipaH作为目标检测基因。

采用Primer Premier5.0软件设计分析引物，经过组合优化试验验证，筛选出特异性高的3对引物组合，如表1所示。

表1femA基因、hilA基因及ipaH基因扩增用引物对序列

2.单重PCR反应体系及反应条件的建立

本实施例中，以femA基因为模板的单重PCR体系采用总共25μL的如下反应体系：

其中，所述femA基因扩增用引物对为：

femA-F:AAGCACACAACAAGCGAGATAAC；

femA-R:TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG。

本实施例中，以hilA基因为模板的单重PCR体系采用总共25μL的如下反应体系：

其中，所述hilA基因扩增用引物对为：

hilA-F：TGAATTACGCTCACAACACCTG；

hilA-R：TGCTAAGCAACCAGATTACGATG。

本实施例中，以ipaH基因为模板的单重PCR体系采用总共25μL的如下反应体系：

其中，所述ipaH基因扩增用引物对为：

ipaH-F:CTCACATGGAACAATCTCCG；

ipaH-R:TCATTCTCTTCACGGCTTCTG。

进行上述单重PCR反应的反应条件均为：

95℃预变性2min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸7min。

3.单重PCR检测中引物特异性的验证

利用上述单重PCR反应体系及反应条件，通过正交反应多次试验，对15株购买的标准菌株(如表2所示)进行单重PCR检测，结果表明：

(1)当使用femA基因扩增用引物对进行单重PCR检测时，分别含有2株金黄色葡萄球菌菌株(CGMCC1.2465及CICC21600)的样品均扩增出130bp的目的片段，其它13株非金黄色葡萄球菌菌株则无任何扩增条带。该结果表明，本发明筛选出的针对femA基因的引物对对靶细菌金黄色葡萄球菌具有特异性。

(2)当使用hilA基因扩增用引物对进行单重PCR检测时，分别含有2株沙门氏菌菌株(CICC21482及CGMCC1.1190)的样品均扩增出430bp的目的片段，其它13株非沙门氏菌菌株则无任何扩增条带。该结果表明，本发明筛选出的针对hilA基因的引物对对靶细菌沙门氏菌具有特异性。

(3)当使用ipaH基因扩增用引物对进行单重PCR检测时，分别含有3株志贺氏菌株(CICC21534、CGMCC1.1868及ATCC25931)的样品均扩增出320bp的目的片段，其它12株非志贺氏菌菌株则无任何扩增条带。该结果表明，本发明筛选出的针对ipaH基因的引物对对靶细菌沙门氏菌具有特异性。

表2所使用的菌株列表

4.单重PCR检测中引物灵敏度的验证

分别培养金黄色葡萄球菌CGMCC1.2465、沙门氏菌CICC21482及志贺氏菌CGMCC1.1868，抽提基因组DNA，用超微量分光光度计NanoDrop2000检测DNA浓度，进行10倍梯度稀释，分别以1μL不同浓度的DNA作为模板进行PCR扩增，反应体系及反应条件如本实施例中“2.单重PCR反应体系及反应条件的建立”所述；为更好地检测灵敏度，进一步补充了以100fg/μL的DNA1μL作为模板的实验。

对PCR产物进行电泳分析，结果如图1A-图1C所示。

图1中，M表示100bp ladder Marker；femA--130表示以femA为目标检测基因的单重PCR检测；hilA--430表示以hilA为目标检测基因的单重PCR检测；ipaH--320表示以ipaH为目标检测基因的单重PCR检测。

图1A-图1C中的“-”表示利用1μL浓度为100ng/μL的阴性对照大肠杆菌菌株CGMCC1.3373的基因组DNA分别以femA、hilA和ipaH为目标检测基因的单重PCR检测；图1A中的“+”表示利用1μL浓度为100ng/μL的阳性对照金黄色葡萄球菌菌株CGMCC1.2465的基因组DNA以femA为目标检测基因的单重PCR检测；图1B中的“+”表示利用1μL浓度为100ng/μL的阳性对照沙门氏菌菌株CICC21482的基因组DNA以hilA为目标检测基因的单重PCR检测；图1C中的“+”表示利用1μL浓度为100ng/μL的阳性对照志贺氏菌菌株CGMCC1.1868的基因组DNA以ipaH为目标检测基因的单重PCR检测。从左至右，各泳道所标注的100fg、1pg、10pg、100pg、1ng及10ng分别表示在25μL的PCR反应体系中，所加入的1μL模板DNA的浓度分别为100fg/μL、1pg/μL、10pg/μL、100pg/μL、1ng/μL及10ng/μL。

如图1所示，使用本发明的引物对时，各自以femA、hilA和ipaH基因为目标检测基因的单重PCR检测反应灵敏度均达到1pg/μL。

比较例1：引物灵敏度的比较

将使用本发明引物对的检测方法的灵敏度与现有技术的检测灵敏度进行比较，结果如表3所示：

使用本发明的引物对时，各自以femA、hilA和ipaH基因为目标检测 基因的单重PCR检测反应灵敏度均达到1pg/μL，均远高于现有技术的记载，表明本发明的引物对、引物组及相应的检测方法能够获得较高的灵敏度，具备更好地满足食品安全国家标准的前景。

表3检测用引物对及灵敏度

实施例2：二重PCR反应体系及反应条件的建立

1.二重PCR反应体系及反应条件的建立

基于单重PCR检测的反应体系及反应条件，本发明对二重PCR检测中的各参数进行了优化，确定了最佳的反应体系及反应条件。

最佳二重PCR反应体系为(以25μL的PCR最终反应溶液计)：

对于以金黄色葡萄球菌和沙门氏菌为检测目标的二重PCR反应，本实施例中采用总共25μL的如下反应体系：

其中，所述femA基因扩增用引物对为：

femA-F:AAGCACACAACAAGCGAGATAAC；

femA-R:TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG，

所述hilA基因扩增用引物对为：

hilA-F：TGAATTACGCTCACAACACCTG；

hilA-R：TGCTAAGCAACCAGATTACGATG。

对于以金黄色葡萄球菌和志贺氏菌为检测目标的二重PCR反应，本实施例中采用总共25μL的如下反应体系：

其中，所述femA基因扩增用引物对为：

femA-F:AAGCACACAACAAGCGAGATAAC；

femA-R:TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG，

所述ipaH基因扩增用引物对为：

ipaH-F:CTCACATGGAACAATCTCCG；

ipaH-R:TCATTCTCTTCACGGCTTCTG。

对于以沙门氏菌和志贺氏菌为检测目标的二重PCR反应，本实施例 中采用总共25μL的如下反应体系：

其中，所述hilA基因扩增用引物对为：

hilA-F：TGAATTACGCTCACAACACCTG；

hilA-R：TGCTAAGCAACCAGATTACGATG。

所述ipaH基因扩增用引物对为：

ipaH-F:CTCACATGGAACAATCTCCG；

ipaH-R:TCATTCTCTTCACGGCTTCTG。

进行上述二重PCR反应的反应条件均为：

95℃预变性2min；94℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸7min。

2.二重PCR检测中引物特异性的验证

利用上述二重PCR反应体系及反应条件，通过正交反应多次试验，对15株购买的标准菌株(如表2所示)进行二重PCR检测，结果表明：

当将本发明筛选出的针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的引物对两两联用时，可在同时含有所对应的菌株的基因组DNA的样品中扩增出相应的两个目的片段。该结果表明，本发明筛选出的三组引物对两两联用时，各引物对可适用相同的反应条件、且彼此间不会互相干扰，具备用于同时对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌中的多个目标基因进行多重PCR检测的潜能。

3.二重PCR检测中引物灵敏度的验证

分别培养金黄色葡萄球菌CGMCC1.2465、沙门氏菌CICC21482及 志贺氏菌CGMCC1.1868，抽提基因组DNA，用超微量分光光度计NanoDrop2000检测DNA浓度，进行10倍梯度稀释，分别以2μL混合DNA(金黄色葡萄球菌、沙门氏菌以及志贺氏菌基因组DNA两两等体积等浓度混合)作为模板进行PCR扩增，反应体系及反应条件如本实施例中“1.二重PCR反应体系及反应条件的建立”所述；为更好地检测灵敏度，进一步补充了将金黄色葡萄球菌、沙门氏菌以及志贺氏菌基因组DNA两两混合，各菌株体积均为1μL、浓度均为100fg/μL的情况。

对PCR产物进行电泳分析，结果如图2所示。

图2A-图2C中，M表示100bp ladder Marker；femA--130/hilA--430表示同时以femA及hilA为目标检测基因的二重PCR检测；femA--130/ipaH--320表示同时以femA及ipaH为目标检测基因的二重PCR检测；hilA--430/ipaH--320表示同时以hilA及ipaH为目标检测基因的二重PCR检测；“-”表示利用2μL浓度为100ng/μL的阴性对照大肠杆菌菌株CGMCC1.3373的基因组DNA进行的相应的二重PCR检测；图2A中的“+”表示利用1μL浓度为100ng/μL的阳性对照金黄色葡萄球菌菌株CGMCC1.2465的基因组DNA及1μL浓度为100ng/μL的阳性对照沙门氏菌菌株CICC21482的基因组DNA同时以femA及hilA为目标检测基因的二重PCR检测；图2B中的“+”表示利用1μL浓度为100ng/μL的阳性对照金黄色葡萄球菌菌株CGMCC1.2465的基因组DNA及1μL浓度为100ng/μL的阳性对照志贺氏菌菌株CGMCC1.1868的基因组DNA同时以femA及ipaH为目标检测基因的二重PCR检测；图2C中的“+”表示利用1μL浓度为100ng/μL的阳性对照沙门氏菌菌株CICC21482的基因组DNA及1μL浓度为100ng/μL的阳性对照志贺氏菌菌株CGMCC1.1868的基因组DNA同时以hilA及ipaH为目标检测基因的二重PCR检测。从左至右，各泳道所标注的10ng、1ng、100pg、10pg、1pg及100fg分别表示：在25μL的PCR反应体系中，所加入的1μL金黄色葡萄球菌基因组DNA以及1μL沙门氏菌基因组DNA的浓度分别为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL及100fg/μL；或在25μL的PCR反应体系中，所加入的1μL金黄色葡萄球菌基因组DNA以及1μL志贺氏菌基因组DNA的浓度分别为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL 及100fg/μL；或在25μL的PCR反应体系中，所加入的1μL沙门氏菌基因组DNA以及1μL志贺氏菌基因组DNA的浓度分别为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL及100fg/μL。

从图2中可以看出，同时以femA和hilA作为目标基因，对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌进行多重PCR检测的灵敏度达到1pg/μL；同时以femA和ipaH作为目标基因，对金黄色葡萄球菌和志贺氏菌进行多重PCR检测的灵敏度达到1pg/μL；同时以hilA和ipaH作为目标基因，对沙门氏菌和志贺氏菌进行多重PCR检测的灵敏度达到1pg/μL。

可以看出，通过使用本发明的多重PCR检测用引物组进行上述二重PCR检测方法，可以在基本不牺牲灵敏度的条件下，对不同种属的菌(金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌)中的多个目标基因进行检测，即，提高了PCR检测的通量。

实施例3：三重PCR反应体系及反应条件的建立

1.三重PCR反应体系及反应条件的建立

基于单重和二重PCR检测的反应体系及反应条件，本发明对三重PCR检测中的各参数进行了优化，确定了最佳的反应体系及反应条件。

最佳三重PCR反应体系为(以25μL的PCR最终反应溶液计)：

其中，所述femA基因扩增用引物对为：

femA-F：AAGCACACAACAAGCGAGATAAC；

femA-R：TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG，

所述hilA基因扩增用引物对为：

hilA-F：TGAATTACGCTCACAACACCTG；

hilA-R：TGCTAAGCAACCAGATTACGATG，

所述ipaH基因扩增用引物对为：

ipaH-F：CTCACATGGAACAATCTCCG；

ipaH-R：TCATTCTCTTCACGGCTTCTG。

在本实施例中，同时以金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌为检测目标的三重PCR反应采用总共25μL的如下反应体系：

其中，所述femA基因扩增用引物对为：

femA-F:AAGCACACAACAAGCGAGATAAC；

femA-R:TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG，

所述hilA基因扩增用引物对为：

hilA-F：TGAATTACGCTCACAACACCTG；

hilA-R：TGCTAAGCAACCAGATTACGATG，

所述ipaH基因扩增用引物对为：

ipaH-F:CTCACATGGAACAATCTCCG；

ipaH-R:TCATTCTCTTCACGGCTTCTG。

进行上述三重PCR反应的反应条件为：

95℃预变性2min；94℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸7min。

2.三重PCR检测中引物特异性的验证

利用上述三重PCR反应体系及反应条件，通过正交反应多次试验，对15株购买的标准菌株(如表2所示)进行三重PCR检测，结果表明：

当将本发明所筛选出的全部3个引物对联用时，仅含有金黄色葡萄球菌菌株(CGMCC1.2465或CICC21600)的样品扩增出130bp的目的片段；仅含有沙门氏菌菌株(CICC21482或CGMCC1.1190)的样品扩增出430bp的目的片段；仅含有志贺氏菌菌株(CICC21534、CGMCC1.1868及ATCC25931)的样品扩增出320bp的目的片段；同时含有金黄色葡萄球菌菌株和沙门氏菌菌株的样品扩增出130bp和430bp的目的片段；同时含有金黄色葡萄球菌菌株和志贺氏菌菌株的样品扩增出130bp和320bp的目的片段；同时含有沙门氏菌菌株和志贺氏菌菌株的样品扩增出430bp和320bp的目的片段；同时含有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌菌株的样品扩增出130bp、320bp和430bp的目的片段。含有除金黄色葡萄球菌菌株、沙门氏菌菌株和志贺氏菌菌株外的其它菌株的样品则无任何扩增条带。该结果表明，本发明筛选出的3个引物对对金黄色葡萄球菌菌株、沙门氏菌菌株和志贺氏菌菌株具有特异性，能够用于同时对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌进行三重PCR检测。

3.三重PCR检测中引物灵敏度的验证

分别将等浓度的1μL金黄色葡萄球菌CGMCC1.2465的基因组DNA、1μL沙门氏菌CICC21482的基因组DNA和1μL志贺氏菌CGMCC1.1868的基因组DNA混合作为模板，用超微量分光光度计NanoDrop2000检测模板中的DNA浓度，进行10倍梯度稀释，分别以不同浓度的DNA作为模板进行PCR扩增，反应体系及反应条件如本实施例中“1.三重PCR反应体系及反应条件的建立”所述；为更好地检测灵敏度，进一步补充了三者浓度均为100fg/μL的情况。

对PCR产物进行电泳分析，结果如图3所示。

图3中，M表示100bp ladder Marker；femA--130/hilA--430/ipaH--320表示同时以femA、hilA及ipaH为目标检测基因的三重PCR检测；“-”表示利用3μL浓度为100ng/μL的阴性对照大肠杆菌菌株CGMCC1.3373 的基因组DNA进行的相应的三重PCR检测；“+”表示利用1μL浓度为100ng/μL的阳性对照金黄色葡萄球菌菌株CGMCC1.2465的基因组DNA、1μL浓度为100ng/μL的阳性对照志贺氏菌菌株CGMCC1.1868的基因组DNA及1μL浓度为100ng/μL的阳性对照沙门氏菌菌株CICC21482的基因组DNA进行的相应的三重PCR检测。从左至右，各泳道所标注的10ng、1ng、100pg、10pg、1pg及100fg表示在25μL的PCR反应体系中，所加入的1μL金黄色葡萄球菌基因组DNA、1μL沙门氏菌基因组DNA及1μL志贺氏菌基因组DNA的浓度各自分别为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL及100fg/μL。

可以看出，同时以femA、hilA和ipaH作为目标基因，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的共同检出灵敏度高达1pg/μL。可见，本发明筛选出的针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的引物对联用时具有很高的灵敏度和特异性。同时，由于可在同一体系中同时完成对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的检测，这样的检测方法将通量提高了三倍。

实施例4：应用于实际样品的检测试验

利用实施例2或实施例3中建立的多重PCR反应体系及反应条件，采用本发明特定选择的金黄色葡萄球菌耐药性相关基因femA、沙门氏菌种属特异性鉴别基因hilA和志贺氏菌种属特异性鉴别基因ipaH作为目标基因，对奶油面包、肉馅、牛奶、火腿肠等食品样品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌进行实际检测。同时，采用国家标准方法(GB/T4789.10-2010)和检验检疫行业标准(SN/T0172-2010)对金黄色葡萄球菌进行检测；采用国家标准方法(GB/T4789.4-2010)和检验检疫行业标准(SN/T2552.5-2010)对沙门氏菌进行检测；采用国家标准方法(GB/T4789.5-2012)对志贺氏菌进行检测，以进行对比。

用本发明的方法和行业标准方法检测所得到的结果如表4所示。表4的结果显示，本发明的检出结果与采用相关的国家标准方法和/或检验检疫行业标准所检测的结果完全一致，说明本发明的二重PCR和/或三重PCR检测方法针对食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的检出准确度为100％。此外，本实施例中，采用国家标准方法和/或检验检疫行业标准检测每个样品中的单一致病菌平均总耗时(包括样品制备)≥96h；而使用本发明所提供的多重PCR检测方法，同时检测每个样品中的两种或三种致病菌平均总耗时(包括样品制备)≤18h。

表4本发明的方法和行业标准方法对三个菌种检测结果的比较

注：S.a表示金黄色葡萄球菌，S.e表示沙门氏菌，S.f表示志贺氏菌；阳性结果表示为+，阴性结果表示为-。

以上比较结果表明，本发明所提供的针对食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的多重PCR检测方法具有较好的准确性和实用性，并且检测耗时短，具有广泛的推广应用市场前景。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明描述的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是容易实现的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种对食品中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：

a)从所述食品中获取模板DNA的前处理步骤；

b)使用多重PCR检测用引物组或包含所述多重PCR检测用引物组的多重PCR检测用试剂盒对所述模板DNA进行多重PCR扩增的步骤；

c)对扩增产物进行检测的步骤，

从而对所述食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的存在及含量进行分析，

其中，所述引物组包括如下引物对：

金黄色葡萄球菌检测用引物对、沙门氏菌检测用引物对以及志贺氏菌检测用引物对，

所述金黄色葡萄球菌检测用引物对为：

femA基因扩增用引物对：

femA-F：AAGCACACAACAAGCGAGATAAC；

femA-R：TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG，

所述沙门氏菌检测用引物对为：

hilA基因扩增用引物对：

hilA-F：TGAATTACGCTCACAACACCTG；

hilA-R：TGCTAAGCAACCAGATTACGATG，

以及所述志贺氏菌检测用引物对为：

ipaH基因扩增用引物对：

ipaH-F：CTCACATGGAACAATCTCCG；

ipaH-R：TCATTCTCTTCACGGCTTCTG，

并且其中，在步骤b)中，所述多重PCR扩增的反应体系为：以总体积为25μL计，加入浓度为1pg/μL～100ng/μL的模板DNA1μL；

所述多重PCR扩增的反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸7min。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多重PCR检测用试剂盒进一步包含具有如下成分的PCR反应基础溶液：Tris-HCl；KCl；MgCl₂；dATP、dTTP、dGTP及dCTP；以及Taq DNA聚合酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，在所述多重PCR检测用试剂盒中，各成分以如下浓度包含于25μL的PCR最终反应溶液中：

4.根据权利要求3所述的方法，其中，在所述多重PCR检测用试剂盒中，各成分以如下浓度包含于25μL的PCR最终反应溶液中：

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述多重PCR检测用试剂盒进一步包含阴性对照DNA和阳性对照DNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述阴性对照DNA来自大肠杆菌菌株CGMCC1.3373，所述阳性对照DNA来自金黄色葡萄球菌金黄亚种菌株CGMCC 1.2465、肠炎沙门氏菌菌株CICC 21482和福氏志贺氏菌菌株CGMCC 1.1868。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在步骤a)之前对所述食品进行金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌富集培养的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述富集培养的步骤采用营养肉汤培养基对所述食品进行金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌富集培养，培养温度为37±1℃，培养时间为12-15小时。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述前处理步骤为：采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取法或水煮裂解法从所述食品中获取模板DNA。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述细菌基因组DNA提取试剂盒提取法包括如下步骤：采用OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒提取金黄色葡萄球菌的基因组DNA，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定浓度，分装后备用。