CN104450908A - 多重荧光pcr检测mrsa用的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒及检测方法,该试剂盒，其特征在于包括：mecA正向引物；mecA反向引物；femA正向引物；femA反向引物；femB正向引物；femB反向引物；mecA探针；femA探针；femB探针。检测方法包括以下步骤：提取样品DNA；对步骤A中的样品DNA进行荧光PCR扩增，对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于多重荧光PCR检测MRSA的试剂盒；本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测MRSA的方法，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
Description
技术领域
本发明设计一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒，本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测MRSA的方法。本发明基于Taqman技术，建立了一种多重荧光PCR技术，可同时检测金黄色葡萄球菌耐甲氧西林methicillin resistant staphylococcus aureus,简称MRSA的三种相关基因，即mecA、FemA、FemB。
背景技术
由于抗生素的使用，细菌也为了自身发展而不断变异，就形成了细菌对抗菌药物的耐药性，使本来有效的抗菌药物在遇到耐药菌引起的感染时疗效下降甚至完全无效。金黄色葡萄球菌至今仍然是国内外医院获得性感染最常见的细菌之一。随着β-内酞胺类抗生素在临床的广泛应用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)在临床分离的葡萄球菌中比例不断增加，MRSA几乎对所有β-内酞胺类抗生素都耐药。1996年，又出现了首例对万古霉素敏感性下降的MRSA。
传统细菌耐药性方法虽然能够满足临床的部分需要，但这些方法仍然存在一些缺点，例如检测时间较长和检测结果不够准确等。因此，随着分子生物学技术在临床检验领域的应用近年来发展了一系列快速细菌鉴定或)耐药检测技术，例如基于PCR技术和DNA探针杂交以及生物芯片技术等，这类方法的特点是快速而准确，一般在几个小时之内就可以得到检测结果，大大缩短了检测时间。
MRSA产生了mecA基因，该基因负责编码青霉素结合蛋白2a(PBP2a)，它降低β-内酰胺抗生素亲和力，而PBP2a与固有的PBP2共同作用，使得细菌尽管在β-内酰胺抗生素的环境中也能合成细胞壁，使细菌对青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类抗生素耐药。mecA基因位于葡萄球菌染色体mec盒staphylococcal cassette chromosomemec简称SCC mec侧面DNA的特有片段上。SCC mec是一个携带mec基因复合体的可移动基因岛genomic islands，GI，甲氧西林耐药和其他抗生素耐药基因在此不断积累，形成耐药岛resistance island，RI，导致MRSA对抗生素多重耐药。
Berger克隆了femA基因,在其中插人一个转座子,使甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌转变成敏感性金黄色葡萄球菌,证明femA与金黄色葡萄球菌的β-内酞胺类抗生素抗性紧密相关。N.KOBAYASHJF的研究则表明，部分表皮葡萄球菌中也发现有mecA的存在，而femA和femB基因并不存在于表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌S.haemolyticus和头葡萄球菌S.capitis。因此仅仅检测mecA并不能很好的预测MRSA的存在，N.KOBAYASHJF认为同时检测三种基因是预测MRSA最可靠方法。
针对金黄色葡萄球菌这三种MRSA相关基因，研究人员已开展了多重常规PCR方法研究，基于Taqman技术建立MRSA检测单一基因，如mecA基因方法也已经研究成功，但是这种方法存在很多局限，而且存在部分金黄色葡萄球菌，mecA荧光PCR检测阳性，却没有表现出耐甲氧西林的耐药性，所以存在很多MRSA被漏检的情况。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于多重荧光PCR检测MRSA的试剂盒；
本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测MRSA的方法，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒，其特征在于包括：
mecA正向引物：5’-GGTCCCATTAACTCTGAA-3’；
mecA反向引物：5’-TGTGCGATTGTATTGCTA-3’；
femA正向引物：5’-AAGCGTTAAAGGATATTGAA-3’；
femA反向引物：5’-CCACCAGCATAATAAACAA-3’；
femB正向引物:5’-CCACCAGCATAATAAACAA-3’；
femB反向引物:5’-CCGAATTTGACAACTTTG-3’；
mecA探针：5’-(FAM)ACGATTGTGACACGATAGCCATCT(Eclipse)-3’；
femA探针：5’-(HEX)AAAGCACACAACAAGCGAGATAACT(Eclipse)-3’；
femB探针：5’-(CY5)AGCCATCATTCTCACGGGTAACT(BHQ3)-3’。
如上所述的一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒，其特征在于还包括有PCR反应液、dNTPs混合液、Taq聚合酶、DNA模版和水。
如上所述的一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒，其特征在于
制备20μL反应体系由以下组分组成：
如上所述的一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒，其特征在于所述各2.5mM的dNTPs混合液由2.5mM dATP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP、2.5mM dGTP组成。
一种采用如上所述的多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒检测MRSA的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取样品DNA；
B、对步骤A中的样品DNA进行荧光PCR扩增，其中反应体系由以下组分组成：
C、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
如上所述的检测方法，其特征在于步骤B中所述的荧光PCR扩增按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～96℃变性5s～10s，55℃～63℃退火20s～40s，共进行35～45个循环。
如上所述的检测方法，其特征在于步骤C中对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至92℃～96℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
如上所述的检测方法，其特征在于步骤A中所述提取样品DNA按以下步骤进行：
取1.5mL培养物10000rpm离心2min；沉淀物加入500μL的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30μL 10％SDS和15μL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h；加入100μL 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min，将上清转入一只新管中，加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来；沉淀用1mL的70％乙醇洗涤后，加入TE溶液溶解沉淀。
本发明中标准品模板的制备：
以常规PCR方法扩增耐药基因目的基因。PCR产物经1％凝胶电泳分析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选但菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
本发明中dNTPs混合液的终浓度为0.2mM，Taq聚合酶的终浓度0.1U/μL，正向引物的终浓度0.5pmol/L，反向引物的终浓度0.5pmol/L，探针的终浓度0.25pmol/L。
本发明中敏感性和特异性试验：
采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加入前述反应体系，进行敏感性实验。结果各耐药基因检测灵敏度均低于10fg，且具有很好重复性。各耐药基因稀释模板浓度和Cp值之间呈良好的线性关系，R2均大于0.95，说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
本发明与现有技术相比，具有以下优点:
1)本发明试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于多重荧光PCR检测MRSA；
2)本发明检测方法简化了检测流程，大大缩短了检测周期，检测时间比传统培养分析方法缩短两天左右；
3)本发明检测方法整个过程，PCR产物无需再转入其它分析装置，实现闭管操作，避免交叉污染，而且可同时完成定量分析。
4)采用本发明检测方法检测MRSA操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
附图说明
图1为MRSA单一耐药基因mecA扩增曲线图；
图2为MRSA单一耐药基因FemA扩增曲线图；
图3为MRSA单一耐药基因FemB扩增曲线图；
图4为MRSA三种耐药基因(mecA、FemA、FemB)同时扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：
实施例1
本发明多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒，包括：
mecA正向引物：5’-GGTCCCATTAACTCTGAA-3’；
mecA反向引物：5’-TGTGCGATTGTATTGCTA-3’；
femA正向引物：5’-AAGCGTTAAAGGATATTGAA-3’；
femA反向引物：5’-CCACCAGCATAATAAACAA-3’；
femB正向引物:5’-CCACCAGCATAATAAACAA-3’；
femB反向引物:5’-CCGAATTTGACAACTTTG-3’；
mecA探针：5’-(FAM)ACGATTGTGACACGATAGCCATCT(Eclipse)-3’；
femA探针：5’-(HEX)AAAGCACACAACAAGCGAGATAACT(Eclipse)-3’；
femB探针：5’-(CY5)AGCCATCATTCTCACGGGTAACT(BHQ3)-3’。
实施例2
本发明试剂盒中制备20μL反应体系由以下组分组成：
其中mecA正向引物：5’-GGTCCCATTAACTCTGAA-3’；
mecA反向引物：5’-TGTGCGATTGTATTGCTA-3’；
femA正向引物：5’-AAGCGTTAAAGGATATTGAA-3’；
femA反向引物：5’-CCACCAGCATAATAAACAA-3’；
femB正向引物:5’-CCACCAGCATAATAAACAA-3’；
femB反向引物:5’-CCGAATTTGACAACTTTG-3’；
mecA探针：5’-(FAM)ACGATTGTGACACGATAGCCATCT(Eclipse)-3’；
femA探针：5’-(HEX)AAAGCACACAACAAGCGAGATAACT(Eclipse)-3’；
femB探针：5’-(CY5)AGCCATCATTCTCACGGGTAACT(BHQ3)-3’。
所述各2.5mM的dNTPs混合液由2.5mM dATP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP、2.5mM dGTP组成。
实施例3
本发明多重荧光PCR检测MRSA的方法，包括以下步骤：
A、提取样品DNA；
B、对步骤A中的样品DNA进行荧光PCR扩增，其中反应体系由以下组分组成：
其中mecA正向引物：5’-GGTCCCATTAACTCTGAA-3’；
mecA反向引物：5’-TGTGCGATTGTATTGCTA-3’；
femA正向引物：5’-AAGCGTTAAAGGATATTGAA-3’；
femA反向引物：5’-CCACCAGCATAATAAACAA-3’；
femB正向引物:5’-CCACCAGCATAATAAACAA-3’；
femB反向引物:5’-CCGAATTTGACAACTTTG-3’；
mecA探针：5’-(FAM)ACGATTGTGACACGATAGCCATCT(Eclipse)-3’；
femA探针：5’-(HEX)AAAGCACACAACAAGCGAGATAACT(Eclipse)-3’；
femB探针：5’-(CY5)AGCCATCATTCTCACGGGTAACT(BHQ3)-3’。
所述各2.5mM的dNTPs混合液由2.5mM dATP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP、2.5mM dGTP组成。
所述的荧光PCR扩增按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～96℃变性5s～10s，55℃～63℃退火20s～40s，共进行35～45个循环。
C、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
其中对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至92℃～96℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
实施例4
取1.5mL培养物10000rpm离心2min；沉淀物加入500μL的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30μL 10％SDS和15μL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h；加入100μL 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来；沉淀用1mL的70％乙醇洗涤后，加入TE溶液溶解沉淀，然后取1μL提取物加入到以下反应体系，
其中mecA正向引物：5’-GGTCCCATTAACTCTGAA-3’；
mecA反向引物：5’-TGTGCGATTGTATTGCTA-3’；
femA正向引物：5’-AAGCGTTAAAGGATATTGAA-3’；
femA反向引物：5’-CCACCAGCATAATAAACAA-3’；
femB正向引物:5’-CCACCAGCATAATAAACAA-3’；
femB反向引物:5’-CCGAATTTGACAACTTTG-3’；
mecA探针：5’-(FAM)ACGATTGTGACACGATAGCCATCT(Eclipse)-3’；
femA探针：5’-(HEX)AAAGCACACAACAAGCGAGATAACT(Eclipse)-3’；
femB探针：5’-(CY5)AGCCATCATTCTCACGGGTAACT(BHQ3)-3’。
所述各2.5mM的dNTPs混合液由2.5mM dATP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP、2.5mM dGTP组成。
进行荧光PCR扩增，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～96℃变性5s～10s，55℃～63℃退火20s～40s，共进行35～45个循环。
A、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至92℃～96℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
本发明中标准DNA模版的制备：
以常规PCR方法扩增耐药基因目的基因。PCR产物经1％凝胶电泳分析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选但菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
结果分析
如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，且Ct值<38,判为阳性，Ct值>38而<45，重复一次，如果仍有明显上升曲线，则判为阳性，Ct值>45或无上升曲线判为阴性。
本发明中敏感性和特异性试验：
采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加入前述反应体系，进行敏感性实验。结果各耐药基因检测灵敏度均低于10fg，且具有很好重复性。各耐药基因稀释模板浓度和Cp值之间呈良好的线性关系，R2均大于0.95，说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
本发明检测方法简化了检测流程，大大缩短了检测周期，整个过程，PCR产物无需再转入其它分析装置，实现闭管操作，避免交叉污染。同时又很好的克服了以往只检测MRSA单一耐药基因导致的漏检和错检情况，为MRSA的快速检测提供了一个很好的方法，具有良好的应用前景。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (8)
1.一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒，其特征在于包括：
mecA正向引物：5’-GGTCCCATTAACTCTGAA-3’；
mecA反向引物：5’-TGTGCGATTGTATTGCTA-3’；
femA正向引物：5’-AAGCGTTAAAGGATATTGAA-3’；
femA反向引物：5’-CCACCAGCATAATAAACAA-3’；
femB正向引物:5’-CCACCAGCATAATAAACAA-3’；
femB反向引物:5’-CCGAATTTGACAACTTTG-3’；
mecA探针：5’-(FAM)ACGATTGTGACACGATAGCCATCT(Eclipse)-3’；
femA探针：5’-(HEX)AAAGCACACAACAAGCGAGATAACT(Eclipse)-3’；
femB探针：5’-(CY5)AGCCATCATTCTCACGGGTAACT(BHQ3)-3’。
2.根据权利要求1所述的一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒，其特征在于还包括有PCR反应液、dNTPs混合液、Taq聚合酶、DNA模版和水。
3.根据权利要求2所述的一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒，其特征在于制备20μL反应体系由以下组分组成：
4.根据权利要求3所述的一种多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒，其特征在于所述各2.5mM的dNTPs混合液由2.5mM dATP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP、2.5mM dGTP组成。
5.一种采用如权利要求3所述的多重荧光PCR检测MRSA用的试剂盒检测MRSA的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取样品DNA；
B、对步骤A中的样品DNA进行荧光PCR扩增，其中反应体系由以下组分组成：
C、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤B中所述的荧光PCR扩增按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～96℃变性5s～10s，55℃～63℃退火20s～40s，共进行35～45个循环。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤C中对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至92℃～96℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤A中所述提取样品DNA按以下步骤进行：
取1.5mL培养物10000rpm离心2min；沉淀物加入500μL的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30μL 10％SDS和15μL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h；加入100μL 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min，将上清转入一只新管中，加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来；沉淀用1mL的70％乙醇洗涤后，加入TE溶液溶解沉淀。
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| CN108179210A (zh) * | 2018-03-13 | 2018-06-19 | 苏州百源基因技术有限公司 | 用于检测金黄色葡萄球菌的特异性引物和探针以及实时荧光定量pcr试剂盒 |
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2014
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150325 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |