CN104388554B - 检测八种金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明新型公开了一种检测八种金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒及检测方法；该试剂盒，其特征在于非标记荧光PCR扩增过程中的反应体系由以下组分组成：HRM反应预混液，dNTPs混合液，Taq聚合酶，上游引物，下游引物，荧光染料，DNA模版，水；本发明一种检测方法，其特征在于包括以下步骤：A、根据八种金黄色葡萄球菌耐药基因设计引物对；B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行荧光PCR扩增；C、应用带HRM模块的荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物Tm值，从而判定结果；本发明的目的是为了提供一种操作简便、快速，成本低的多重荧光PCR检测八种耐药基因的方法，而且检测结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及高分辨率熔解曲线HRM分析和荧光PCR技术，本方法为一种基于高分辨熔解曲线HRM分析技术可同时检测八种金黄色葡萄球菌耐药基因的多重荧光PCR检测试剂盒。其中八种耐药基因包括耐甲氧西林基因mecA、红霉素耐药基因ermc、四环素耐药基因tetM、氨基糖苷类药物耐药基因aph3、消毒剂耐药基因qacA/qacB、万古霉素耐药基因vanA和莫匹罗星耐药基因mupA和耐药性辅助基因femB。
背景技术
由于抗生素的使用，细菌也为了自身发展而不断变异，就形成了细菌对抗菌药物的耐药性，使本来有效的抗菌药物在遇到耐药菌引起的感染时疗效下降甚至完全无效。金黄色葡萄球菌至今仍然是国内外医院获得性感染最常见的细菌之一。随着β-内酞胺类抗生素在临床的广泛应用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA在临床分离的葡萄球菌中比例不断增加，MRSA几乎对所有β-内酞胺类抗生素都耐药。1996年，又出现了首例对万古霉素敏感性下降的MRSA。不仅对甲氧西林和其他β-内酞胺类抗生素耐药,而且还常对氨基糖苷类、红霉素等耐药,因此准确及时的检出,对于耐药金黄色葡萄球菌感染的早期快速诊断，指导临床用药及防止耐药菌的播散极为重要。因此，本发明对金黄色葡萄球菌八种耐药基因包括包括耐甲氧西林基因mecA、 红霉素耐药基因ermc、四环素耐药基因tetM、氨基糖苷类药物耐药基因aph3、消毒剂耐药基因qacA/qacB、万古霉素耐药基因vanA和莫匹罗星耐药基因mupA和耐药性辅助基因femB，采用HRM分析技术并结合荧光PCR技术对其开展多重PCR检测技术研究。
荧光PCR检测技术大致分为两大类：荧光探针法标记荧光PCR和通用型的荧光染料法非标记荧光PCR。前者则利用荧光标记的特异性探针或者引物来识别模版，优点是特异性更高，适用于扩增序列专一检测，不过检测成本高。后者主要是利用荧光染料与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加，无需另外设计荧光探针，简便易行，成本较低。相对以往普通非探针标记荧光PCR所用非饱和染料，新型饱和燃料如LC Green等具有以下优点：①饱和的染料对PCR反应没有任何抑制作用。②DNA高温变性时，非饱和荧光染料加入则会造成DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生迁移，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降，而饱和染料则不会出现此类情况。③高温稳定，对于高GC含量的PCR产物，Tm值较高，在DNA双链高温熔解时，饱和荧光染料结合核酸更稳定。
针对金黄色葡萄球菌各类耐药基因，研究人员已开展了多重常规PCR和多重荧光PCR方法研究，但是同时针对这八种主要耐药基因开展多重荧光PCR检测的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种操作 简便、快速，成本低的多重荧光PCR检测八种耐药基因的方法，而且检测结果准确。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种检测八种金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒，其特征在于非标记荧光PCR扩增过程中的反应体系由以下组分组成：
如上所述的一种检测八种金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒，其特征在于所述的上游引物和下游引物，包括下表中的引物：
本发明一种检测方法，其特征在于包括以下步骤：
A、根据八种金黄色葡萄球菌耐药基因设计引物对；
B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行荧光PCR扩增；
C、应用带HRM模块的荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物Tm值，从而判定结果；
其中步骤B中进行荧光PCR扩增反应体系由以下组分组成：
所述的上游引物和下游引物，包括下表中的引物：
如上所述的一种检测方法，其特征在于所有致病菌检测时PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～96℃变性10～30s,55℃～63℃退火10～30s,72℃10～30s，共进行45～55个循环；
(3)72℃延伸10～30s。
如上所述的一种检测方法，其特征在于步骤C中所述HRM分析按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至92℃～96℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
如上所述的检测方法，其特征在于所述的荧光染料为DNA饱和性染料。
如上所述的检测方法，其特征在于所述的DNA饱和性染料为Eva Green染料、LC PLUS染料、SYTO 9染料中的一种或两种以上的混合物。
如上所述的检测方法，其特征在于所述dNTP混合液为由2.5mM dATP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP、2.5mM dGTP组成的混合液。
本发明中标准品模板的制备
以常规PCR方法扩增耐药基因目的基因。PCR产物经1％凝胶电泳分析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后 的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选但菌落至含含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
PCR扩增和HRM分析
提取样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；应用带HRM模块的荧光定量PCR仪，包括Corbett Rotor公司的Gene6000、Roche公司LightCycler 480等，对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物的Tm值和基因。
在所述荧光定量PCR反应中所采用的反应液，包含下列成分：
所述荧光染料选自DNA饱和性染料，所述的DNA饱和性染料为Eva Green染料、LCPLUS染料、SYTO 9染料中的一种或者两者以上的混合物。
检测的反应程序如下：
4)敏感性和特异性试验
采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加入前述反应体系，进行敏感性实验。结果各耐药基因检测灵敏度均低于10fg，且具有很好重复性。各耐药基因稀释模板浓度和Cp值之间呈良好的线性关系，R2均大于0.95，说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
本发明的检测方法相比其他方法，具有以下优点:
1)简化了检测流程，大大缩短了检测周期和检测成本，一次最多可检测384样本。检测时间只是传统培养分析方法的1/3；
2)用HRM方法进行分析时，样品经PCR扩增后直接进行HRM分析，与其他多重常规PCR通过电泳区分PCR扩增产物片段大小相 比，整个过程，PCR产物无需再转入其它分析装置，实现闭管操作，避免交叉污染，而且可同时完成定量分析；
3)HRM只需设计PCR引物，进行PCR反应，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限；相比传统的探针法荧光PCR，本方法大大降低了使用成本；
4)HRM只检测PCR样品中荧光强度的变化，不消耗任何PCR样品，不损伤PCR扩增产物，PCR产物可以进行下游分析。
附图说明
图1为八种金黄色葡萄球菌耐药基因特异性实验扩增曲线图；
图2为八种金黄色葡萄球菌耐药基因HRM分析所得Tm calling图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：
本发明非标记荧光PCR结合HRM分析技术检测八种金黄色葡萄球菌耐药基因的方法包括以下步骤：
A、根据八种金黄色葡萄球菌耐药基因设计引物对；
B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行荧光PCR扩增；
C、应用带HRM模块的荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物Tm值。
其中步骤B中进行荧光PCR扩增反应体系由以下组分组成：
其中所述的荧光染料为DNA饱和性染料，所述的DNA饱和性染料为Eva Green染料、LC PLUS染料、SYTO 9染料中的一种或两种以上的混合物。所述dNTP混合液为由2.5mM dATP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP、2.5mM dGTP组成的混合液。
其中本发明所述步骤B中非标记荧光PCR扩增的扩增反应按以下步骤进行：
1)92℃～96℃预变性30s；
2)92℃～96℃变性10～30s,55℃～63℃退火10～30s,72℃10～30s，共进行45～55个循环；
3)72℃延伸10～30s。
步骤C中对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
1)92℃～96℃变性1min；
2)40℃复性1min；
3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至92℃～96℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
实施例1
使用本发明所述荧光PCR结合HRM分析技术检测金黄色葡萄球 菌的八种耐药基因
DNA提取和PCR反应
取1.5mL培养物10000rpm离心2min；沉淀物加入500μL的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30μL 10％SDS和15μL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h；加入100μL 5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来；沉淀用1mL的70％乙醇洗涤后，加入TE溶液溶解沉淀，然后取1μL提取物加入到如下反应体系：
按照如下反应条件进行PCR反应:
PCR扩增产物循环次数分析和熔解曲线分析
采用HRM模块的荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行循环次数曲线分析，如果样品非标记荧光PCR有明显扩增曲线，且Cp值<38,判为阳性，Cp值>38而<45，重复一次，如果仍有明显上升曲线，则判为阳性，Cp值>45或无上升曲线判为阴性。
采用genescan或Tm calling软件对扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物Tm值并综合扩增曲线判定结果，其中各耐药基因判定参考Tm值分别为mecA:76.26±0.15℃、ermc:78.37±0.15℃、tetM:84.15±0.15℃、aph3:81.26±0.15℃、qacA/qacB:84.04±0.15℃、vanA:81.86±0.15℃、mupA:81.27±0.15℃、femB:81.65±0.15℃。有明显扩增曲线，而Tm值超过判定参考值，可能为扩增序列点突变所致，直接将扩增产物测序，根据序列进行最终判定。
实施例2
本发明能同时检测八种金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒，其中 非标记荧光PCR扩增过程中的反应体系由以下组分组成：
其中所述的上游引物包括有：
耐甲氧西林基因mecA上游引物：GCAATCGCTAAAGAACTA
红霉素耐药基因ermc上游引物：TGCCATTGAAATAGACCA
四环素耐药基因tetM上游引物：AAAATCCGCACCCTCTAC
氨基糖苷类药物耐药基因aph3上游引物：AAAATACCGCTGCGTAAA
消毒剂耐药基因qacA/qacB上游引物：GGGTCGTGTTATTAGGCA
万古霉素耐药基因vanA上游引物：TGAATCGGCAAGACAATA
莫匹罗星耐药基因mupA上游引物：TCACGAATACGCACCAAG
耐药性辅助基因femB上游引物：CGAATCGTGGTCCAGTAA
所述的下游引物包括有：
耐甲氧西林基因mecA下游引物：TGGGACCAACATAACCTA
红霉素耐药基因ermc下游引物：AAACCCGTATTCCACGAT
四环素耐药基因tetM下游引物：ATCCGTCACATTCCAACC
氨基糖苷类药物耐药基因aph3下游引物：GGAGTGAAAGAGCCTGATG
消毒剂耐药基因qacA/qacB下游引物：TGGCATTATCTTTGGCTC
万古霉素耐药基因vanA下游引物：TCCTGATGAATACGAAAGA
莫匹罗星耐药基因mupA下游引物：TAGAGCCGCTATCAAACC
耐药性辅助基因femB下游引物：TCCAGCACGCTCTTCAGT。
所述的DNA饱和性染料为Eva Green染料、LC PLUS染料、SYTO 9染料中的一种或两种以上的混合物。
所述dNTP混合液为由2.5mM dATP、2.5mM dCTP、2.5mMdTTP、2.5mM dGTP组成的混合液。
实施例3
本发明一种检测方法，包括以下步骤：
A、根据八种金黄色葡萄球菌耐药基因设计引物对；
B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行荧光PCR扩增；
C、应用带HRM模块的荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物Tm值，从而判定结果；
其中步骤B中进行荧光PCR扩增反应体系由以下组分组成：
其中所述的上游引物包括有：
耐甲氧西林基因mecA上游引物：GCAATCGCTAAAGAACTA
红霉素耐药基因ermc上游引物：TGCCATTGAAATAGACCA
四环素耐药基因tetM上游引物：AAAATCCGCACCCTCTAC
氨基糖苷类药物耐药基因aph3上游引物：AAAATACCGCTGCGTAAA
消毒剂耐药基因qacA/qacB上游引物：GGGTCGTGTTATTAGGCA
万古霉素耐药基因vanA上游引物：TGAATCGGCAAGACAATA
莫匹罗星耐药基因mupA上游引物：TCACGAATACGCACCAAG
耐药性辅助基因femB上游引物：CGAATCGTGGTCCAGTAA
所述的下游引物包括有：
耐甲氧西林基因mecA下游引物：TGGGACCAACATAACCTA
红霉素耐药基因ermc下游引物：AAACCCGTATTCCACGAT
四环素耐药基因tetM下游引物：ATCCGTCACATTCCAACC
氨基糖苷类药物耐药基因aph3下游引物：GGAGTGAAAGAGCCTGATG
消毒剂耐药基因qacA/qacB下游引物：TGGCATTATCTTTGGCTC
万古霉素耐药基因vanA下游引物：TCCTGATGAATACGAAAGA
莫匹罗星耐药基因mupA下游引物：TAGAGCCGCTATCAAACC
耐药性辅助基因femB下游引物：TCCAGCACGCTCTTCAGT。
本发明中所有致病菌检测时PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～96℃变性10～30s,55℃～63℃退火10～30s,72℃10～30s，共进行45～55个循环；
(3)72℃延伸10～30s。
本发明步骤C中所述HRM分析按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至92℃～96℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
Claims (7)
1.一种检测八种金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒，其特征在于非标记荧光PCR扩增过程中的反应体系由以下组分组成：
所述的上游引物包括有：
耐甲氧西林基因mecA上游引物：GCAATCGCTAAAGAACTA
红霉素耐药基因ermc上游引物：TGCCATTGAAATAGACCA
四环素耐药基因tetM上游引物：AAAATCCGCACCCTCTAC
氨基糖苷类药物耐药基因aph3上游引物：AAAATACCGCTGCGTAAA
消毒剂耐药基因qacA/qacB上游引物：GGGTCGTGTTATTAGGCA
万古霉素耐药基因vanA上游引物：TGAATCGGCAAGACAATA
莫匹罗星耐药基因mupA上游引物：TCACGAATACGCACCAAG
耐药性辅助基因femB上游引物：CGAATCGTGGTCCAGTAA
所述的下游引物包括有：
耐甲氧西林基因mecA下游引物：TGGGACCAACATAACCTA
红霉素耐药基因ermc下游引物：AAACCCGTATTCCACGAT
四环素耐药基因tetM下游引物：ATCCGTCACATTCCAACC
氨基糖苷类药物耐药基因aph3下游引物：GGAGTGAAAGAGCCTGATG
消毒剂耐药基因qacA/qacB下游引物：TGGCATTATCTTTGGCTC
万古霉素耐药基因vanA下游引物：TCCTGATGAATACGAAAGA
莫匹罗星耐药基因mupA下游引物：TAGAGCCGCTATCAAACC
耐药性辅助基因femB下游引物：TCCAGCACGCTCTTCAGT。
2.一种非诊断目的的检测八种金黄色葡萄球菌耐药基因的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、根据八种金黄色葡萄球菌耐药基因设计引物对；
B、提取样本DNA后，利用设计的引物对样本DNA进行荧光PCR扩增；
C、应用带HRM模块的荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物Tm值，从而判定结果；
其中步骤B中进行荧光PCR扩增反应体系由以下组分组成：
所述的上游引物包括有：
耐甲氧西林基因mecA上游引物：GCAATCGCTAAAGAACTA
红霉素耐药基因ermc上游引物：TGCCATTGAAATAGACCA
四环素耐药基因tetM上游引物：AAAATCCGCACCCTCTAC
氨基糖苷类药物耐药基因aph3上游引物：AAAATACCGCTGCGTAAA
消毒剂耐药基因qacA/qacB上游引物：GGGTCGTGTTATTAGGCA
万古霉素耐药基因vanA上游引物：TGAATCGGCAAGACAATA
莫匹罗星耐药基因mupA上游引物：TCACGAATACGCACCAAG
耐药性辅助基因femB上游引物：CGAATCGTGGTCCAGTAA
所述的下游引物包括有：
耐甲氧西林基因mecA下游引物：TGGGACCAACATAACCTA
红霉素耐药基因ermc下游引物：AAACCCGTATTCCACGAT
四环素耐药基因tetM下游引物：ATCCGTCACATTCCAACC
氨基糖苷类药物耐药基因aph3下游引物：GGAGTGAAAGAGCCTGATG
消毒剂耐药基因qacA/qacB下游引物：TGGCATTATCTTTGGCTC
万古霉素耐药基因vanA下游引物：TCCTGATGAATACGAAAGA
莫匹罗星耐药基因mupA下游引物：TAGAGCCGCTATCAAACC
耐药性辅助基因femB下游引物：TCCAGCACGCTCTTCAGT。
3.根据权利要求2所述的一种非诊断目的的检测八种金黄色葡萄球菌耐药基因的方法，其特征在于所有致病菌检测时PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～96℃变性10～30s,55℃～63℃退火10～30s,72℃10～30s，共进行45～55个循环；(3)72℃延伸10～30s。
4.根据权利要求3所述的一种非诊断目的的检测八种金黄色葡萄球菌耐药基因的方法，其特征在于步骤C中所述HRM分析按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至92℃～96℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
5.根据权利要求2所述的一种非诊断目的的检测八种金黄色葡萄球菌耐药基因的方法，其特征在于所述的荧光染料为DNA饱和性染料。
6.根据权利要求5所述的一种非诊断目的的检测八种金黄色葡萄球菌耐药基因的方法，其特征在于所述的DNA饱和性染料为Eva Green染料、LC PLUS染料、SYTO 9染料中的一种或两种以上的混合物。
7.根据权利要求2所述的一种非诊断目的的检测八种金黄色葡萄球菌耐药基因的方法，其特征在于所述dNTP混合液为由2.5mM dATP、2.5mM dCTP、2.5mM dTTP、2.5mM dGTP组成的混合液。
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