CN104988219A - 检测金黄色葡萄球菌及blaz用的引物、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测金黄色葡萄球菌及blaz用的引物、试剂盒及方法，引物：gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC；gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC；blazF：ACTTCAACACCTGCTGCTT；blazR：ACTCTTGGCGGTTTCACT。试剂盒：HRM反应预混液10μL；引物0.2-3.4μL；DNA模版1μL；水补齐至20μL。检测方法：提取样品DNA；利用试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。本发明试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于双重荧光PCR检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧新林耐药基因blaz的引物、试剂盒方法，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。

Description

检测金黄色葡萄球菌及blaz用的引物、试剂盒及方法
技术领域
本发明设计一种基于HRM技术检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧新林耐药基因blaz用的引物；本发明还涉及一种包括上述引物的双重荧光PC检测试剂盒，本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧新林耐药基因blaz的方法。
背景技术
葡萄球菌是革兰氏阳性球菌中的一种,广泛分布于自然界,如空气、水、饲料和一些食品中,也存在于人和动物的体表、鼻咽部及肠道。致病性葡萄球菌常引起各种化脓性疾患、败血症或脓毒败血症，当污染食品时,可引起食物中毒。1974年葡萄球菌属分为三种:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌脚。其中金黄色葡萄球菌staphylococcus.aureus致病力最强，也最重要。金黄色葡萄球菌除了常引起皮肤、组织及器官的化脓性炎症外，其产生的肠毒素可沾染食物而致食物中毒。
由于抗生素的使用，细菌也为了自身发展而不断变异，就形成了细菌对抗菌药物的耐药性，使本来有效的抗菌药物在遇到耐药菌引起的感染时疗效下降甚至完全无效。金黄色葡萄球菌至今仍然是国内外医院获得性感染最常见的细菌之一。随着β-内酞胺类抗生素在临床的广泛应用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA在临床分离的葡萄球菌中比例不断增加，MRSA几乎对所有β-内酞胺类抗生素都耐药。1996年，又出现了首例对万古霉素敏感性下降的MRSA。一旦对万古霉素耐药，临床可选用药物将非常有限，从而造成治疗上的困难。研究可靠的检测方法，对其准确、及时的检出，对于控制耐药菌的播散极为重要。
本发明选择的目的基因为谷氨酸铁还原合成酶glutamatesynthase-ferredoxin large subunit,gltB，序列同源性相对保守，能够较好的将金黄色葡萄球菌和其他食源性致病菌进行区分。也是1870-2007《食品中致病菌检测方法实时PCR法》中检测金黄色葡萄球菌的靶基因。
本发明选择的另外一个目的基因为blaz基因，该基因负责编码青霉素结合蛋白2a(PBP2a)，它降低β-内酰胺抗生素亲和力，而PBP2a与固有的PBP2共同作用，使得细菌尽管在β-内酰胺抗生素的环境中也能合成细胞壁，使细菌对青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类抗生素耐药。blaz基因位于葡萄球菌染色体mec盒staphylococcal cassettechromosome mec简称SCC mec侧面DNA的特有片段上。SCC mec是一个携带mec基因复合体的可移动基因岛genomic islands，GI，甲氧西林耐药和其他抗生素耐药基因在此不断积累，形成耐药岛resistance island,RI，导致MRSA对抗生素双重耐药。
传统细菌耐药性方法虽然能够满足临床的部分需要，但这些方法仍然存在一些缺点，例如检测时间较长和检测结果不够准确等。因此，随着分子生物学技术的应用，近年来发展了一系列快速细菌鉴定或分子检测技术，这类方法的特点是快速而准确，一般在几个小时之内就可以得到检测结果，大大缩短了检测时间。针对金黄色葡萄球菌和blaz相关基因，研究人员已开展了常规PCR和荧光PCR方法研究，但常规PCR方法需要PCR扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且容易引起污染，还需要使用可能致癌的荧光燃料，而探针法荧光PCR方法虽然灵敏准确，但是其检测成本较高，而且试剂有效期短，很容易降解。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于双重荧光PCR检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧新林耐药基因blaz的试剂盒；
本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测金黄色葡萄球菌及耐药基因blaz的方法，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种检测金黄色葡萄球菌及blaz用的引物，其特征在于该引物的序列分别为：
上游引物gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
下游引物gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC
上游引物blazF：ACTTCAACACCTGCTGCTT
下游引物blazR：ACTCTTGGCGGTTTCACT。
一种检测金黄色葡萄球菌及blaz用的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20μL反应体系包括以下组分：
其中所述上游引物gltBF的序列：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
所述下游引物gltBR的序列：GGATAATGAAGGGAAACC
所述上游引物blazF的序列：ACTTCAACACCTGCTGCTT
所述下游引物blazR的序列：ACTCTTGGCGGTTTCACT。
如上所述的一种检测金黄色葡萄球菌及blaz用的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20μL反应体系包括以下组分：
一种检测金黄色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取样品DNA；
B、利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；
C、扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。
如上所述检测金黄色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于步骤B中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～95℃变性10s～30s，54℃～64℃退火10s～30s，72℃10s～30s，共进行35～45个循环；
(3)72℃延伸10s～30s。
如上所述检测金黄色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于步骤C中所述高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至90℃～95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
如上所述检测金黄色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于步骤A中所述提取样品DNA的具体步骤如下：
取1.5mL培养物10000rpm离心2min；沉淀物加入500μL的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，8000r/min离心3min，去尽上清，向沉淀中加入200μl的50mg/mL的溶菌酶溶液30μL 10％SDS和15μL的蛋白酶K，涡旋混匀后，于37℃温育1h；加入100μL的5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min；加入等体积的酚或氯仿或异戊醇混匀，离心4-5min，将上清转入一只新管中，加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来；沉淀用1mL的70％乙醇洗涤后，加入TE溶液溶解沉淀。
本发明中标准品模板的制备：
以常规PCR方法扩增耐药基因目的基因。PCR产物经1％凝胶电泳分析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
本发明中敏感性和特异性试验：
采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加入前述反应体系，进行敏感性实验。结果各耐药基因检测灵敏度均低于0.1pg，且具有很好重复性。各耐药基因稀释模板浓度和Cp值之间呈良好的线性关系，R2均大于0.95，说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
本发明与现有技术相比，具有以下优点:
1)本发明试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于荧光PCR检测金黄色葡萄球菌和blaz基因；
2)本发明检测方法简化了检测流程，大大缩短了检测周期，检测时间比传统培养分析方法缩短两天左右；
3)本发明检测方法整个过程，PCR产物无需再转入其它分析装置，实现闭管操作，避免交叉污染，而且可同时完成定量分析。
4)采用本发明检测方法同一反应管即可实现同时金黄色葡萄球菌和blaz基因同时检测，操作简便、快速，成本低，结果准确。
附图说明
图1：仅有金黄色葡萄球菌gltB基因检出的扩增曲线图；
图2：仅有金黄色葡萄球菌gltB基因检出的HRM分析图；
图3：仅有耐药基因blaz检出的扩增曲线图；
图4：仅有耐药基因blaz检出的的HRM分析图；
图5：gltB基因和blaz基因同时检出的扩增曲线图；
图6：gltB基因和blaz基因同时检出的HRM分析图；
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：
实施例1
1、本发明一种检测金黄色葡萄球菌及blaz用的引物，其中该引物的序列分别为：
上游引物gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
下游引物gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC
上游引物blazF：ACTTCAACACCTGCTGCTT
下游引物blazR：ACTCTTGGCGGTTTCACT。
实施例2
本发明一种检测金黄色葡萄球菌及blaz用的试剂盒，其中该试剂盒中20μL反应体系包括以下组分：
其中上下游引物序列为:
上游引物gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
下游引物gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC
上游引物blazF：ACTTCAACACCTGCTGCTT
下游引物blazR：ACTCTTGGCGGTTTCACT。
实施例3
本发明检测金黄色葡萄球菌及blaz用的试剂盒，其中20.0μL
反应体系由以下组分组成：
其中:
其中引物序列如下:
上游引物gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
下游引物gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC
上游引物blazF：ACTTCAACACCTGCTGCTT
下游引物blazR：ACTCTTGGCGGTTTCACT。
实施例4
本发明试剂盒中制备20μL反应体系由以下组分组成：
其中引物序列如下:
上游引物gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
下游引物gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC
上游引物blazF：ACTTCAACACCTGCTGCTT
下游引物blazR：ACTCTTGGCGGTTTCACT。
实施例5
本发明试剂盒中制备20μL反应体系由以下组分组成：
其中引物序列如下:
上游引物gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
下游引物gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC
上游引物blazF：ACTTCAACACCTGCTGCTT
下游引物blazR：ACTCTTGGCGGTTTCACT。
实施例6
本发明试剂盒中制备20μL反应体系由以下组分组成：
其中引物序列如下:
上游引物gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
下游引物gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC
上游引物blazF：ACTTCAACACCTGCTGCTT
下游引物blazR：ACTCTTGGCGGTTTCACT。
实施例7
本发明试剂盒中制备20μL反应体系由以下组分组成：
其中引物序列如下:
上游引物gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
下游引物gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC
上游引物blazF：ACTTCAACACCTGCTGCTT
下游引物blazR：ACTCTTGGCGGTTTCACT。
实施例8
本发明检测金黄色葡萄球菌及blaz的方法，包括以下步骤：
A、提取样品DNA；
B、对步骤A中的样品DNA进行荧光PCR扩增，其中反应体系由以下组分组成：
其中上下游引物序列为:
上游引物gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
下游引物gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC
上游引物blazF：ACTTCAACACCTGCTGCTT
下游引物blazR：ACTCTTGGCGGTTTCACT。
所述的荧光PCR扩增按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～96℃变性5s～10s，55℃～65℃退火20s～40s，共进行35～45个循环。
C、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
其中对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至92℃～96℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
实施例4
取1.5mL培养物10000rpm离心2min；沉淀物加入500μL的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，8000r/min离心3min，去尽上清，向沉淀中加入200μl的50mg/mL的溶菌酶溶液、30μL 10％SDS和15μL的蛋白酶K，涡旋混匀后，于37℃温育1h；加入100μL的5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min，将上清转入一只新管中，加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来；沉淀用1mL的70％乙醇洗涤后，加入TE溶液溶解沉淀。取1μL提取物加入到以下反应体系.
其中上下游引物序列为:
上游引物gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
下游引物gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC
上游引物blazF：ACTTCAACACCTGCTGCTT
下游引物blazR：ACTCTTGGCGGTTTCACT。
进行荧光PCR扩增，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～96℃变性5s～10s，55℃～65℃退火20s～40s，共进行35～45个循环。
A、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至92℃～96℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
本发明中标准DNA模版的制备：
以常规PCR方法扩增目的基因gltB和blaz。PCR产物经1％凝胶电泳分析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
结果分析
如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值<35,而且熔解曲线有一个特异性波峰，Tm值为76.85±0.15℃，可判为金黄色葡萄球菌检测阳性。
如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值<35，熔解曲线有一个特异性波峰，Tm值为78.85±0.15℃，可判为blaz检测阳性。
如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值<35，而且有两个波峰，Tm值分别为71.45±0.15℃和75.16±0.15℃，可判为金黄色葡萄球菌和blaz均检出阳性
如果样品荧光PCR扩增曲线明显，35<Ct值<40，重复一次，如果仍有明显上升曲线，则至少有一个目的基因为检出，同时根据前述熔解曲线分析图波峰发生情况和Tm值进行相应判断。
如果样品荧光PCR扩增曲线明显Ct值>40，或无明显扩增曲线和Tm值，判为金黄色葡萄球菌和blaz均检测阴性。
本发明中敏感性和特异性试验：
采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加入前述反应体系，进行敏感性实验。结果各耐药基因检测灵敏度均低于0.1pg，且具有很好重复性。各耐药基因稀释模板浓度和Cp值之间呈良好的线性关系，R2均大于0.95，说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种检测金黄色葡萄球菌及耐药基因blaz用的引物，其特征在于该引物的序列分别为：
上游引物gltBF：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
下游引物gltBR：GGATAATGAAGGGAAACC
上游引物blazF：ACTTCAACACCTGCTGCTT
下游引物blazR：ACTCTTGGCGGTTTCACT。
2.一种检测金黄色葡萄球菌及耐药基因blaz用的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20μL反应体系包括以下组分：
其中所述上游引物gltBF的序列：TAATCTTTAGTAGTACCGAAGC
所述下游引物gltBR的序列：GGATAATGAAGGGAAACC
所述上游引物blazF的序列：ACTTCAACACCTGCTGCTT
所述下游引物blazR的序列：ACTCTTGGCGGTTTCACT。
3.根据权利要求2所述的一种检测金黄色葡萄球菌及blaz用的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20μL反应体系包括以下组分：
4.一种检测金黄色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取样品DNA；
B、利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；
C、扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。
5.根据权利要求4所述检测金黄色葡萄球菌及耐药基因blaz的方法，其特征在于步骤B中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～95℃变性10s～30s，54℃～64℃退火10s～30s，72℃10s～30s，共进行35～45个循环；
(3)72℃延伸10s～30s。
6.根据权利要求5所述检测金黄色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于步骤C中所述高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至90℃～95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
7.根据权利要求6所述检测金黄色葡萄球菌及blaz的方法，其特征在于步骤A中所述提取样品DNA的具体步骤如下：
取1.5mL培养物10000rpm离心2min；沉淀物加入500μL的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，8000r/min离心3min，去尽上清，向沉淀中加入200μl的50mg/mL的溶菌酶溶液、30μL 10％SDS和15μL的蛋白酶K，涡旋混匀后，于37℃温育1h；加入100μL的5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min；加入等体积的酚或氯仿或异戊醇混匀，离心4-5min，将上清转入一只新管中，加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来；沉淀用1mL的70％乙醇洗涤后，加入TE溶液溶解沉淀。
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