CN105483219A - 结核分枝杆菌复合群核酸检测方法及试剂盒 - Google Patents

结核分枝杆菌复合群核酸检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种结核分枝杆菌复合群核酸检测方法，通过使用结核分枝杆菌复合群的特异性引物，利用交叉引物恒温扩增技术对样本中的结核分枝杆菌复合群核酸的靶基因特定片段进行扩增，然后通过分子信标对靶基因特定片段进行实时荧光检测以实现结核分枝杆菌复合群的筛查检测；所述方法以枯草芽孢杆菌为内控，用于对检测进行质量监控，具体是将枯草芽孢杆菌孢子与样本混合一起进行核酸提纯、扩增和检测；所述检测方法的所有过程在同一个试剂盒中进行，实现了核酸提取和纯化、核酸扩增及检测分析三个过程的全自动一体化。

Description

结核分枝杆菌复合群核酸检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种结核分枝杆菌复合群核酸的检测技术，特别涉及一种主要应用全自动检测系统的核酸检测方法及试剂盒，适合对结核分枝杆菌复合群核酸的定性检测。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌等引起的慢性传染性疾病，可累及全身各个器官，以肺结核最为多见。结核分枝杆菌主要是经空气传播，大多数人在感染结核分枝杆菌后并无症状，称为潜伏感染。潜伏感染可持续几十年，仅有5％—10％的潜伏感染者发展为活动性肺结核。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。近年来，全球结核病疫情的回升，引起了国际社会的高度重视，WHO已将结核病作为重点控制的传染病之一，并宣布全球结核病处于紧急状态。世卫组织在结核防治报告中指出，改进检测工作，可以促进国际结核病控制努力，并应对巨大的市场需求，同时呼吁对以低收入和中等收入国家为目标的新的诊断工具进行工业投资。
在结核病的细菌学检验中，通常将分枝杆菌分为结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex)和非结核分枝杆菌(Nontuberculosismycobacteria,NTM)。结核分枝杆菌复合群包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛结核分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)和田鼠分枝杆菌(M.microti)。在结核分枝杆菌复合群内各种中，除田鼠分枝杆菌对人无致病力外，其他三种菌均可对人致病，产生大致相同的临床表现。因此，临床上往往只做结核分枝杆菌复合群的鉴定而不进行亚种水平的鉴定。
目前应用于结核病诊断的实验室技术有很多种，这些常规检查方法在技术上虽然比较成熟，但目前尚存在一些问题：国际推荐的涂片和培养方法还分别存在特异性差、敏感性低和结果报出时间太长的不足，国际认可的结核菌快速培养系统虽大大提高了培养结果的报出时间，但由于仪器设备昂贵，检测成本太高而较难推广普及。PCR技术虽然具备快速、灵敏、特异等特点，但由于实验室扩增物污染极易造成假阳性结果而限制了其在临床上的广泛应用，而且其扩增检测所需要的仪器价格极其昂贵，基层单位难于常规应用。而结核病高发区主要集中于农村、边远地区及贫穷落后国家，世卫组织调查认为在全世界结核病患者或生活在结核病高危地区的人当中，大多数人都很难获得迅速而准确的检测。世卫组织控制结核司司长MarioRaviglione博士说“世界迫切需要新的、安全的和可负担得起的诊断方法，以简化病例发现过程”。因此，开发简便、快速、准确、经济，尤其适宜于基层单位推广使用的结核分枝杆菌复合群快速检测试剂及相应的检测设备成了各国企业研究的重点。
表1目前的结核分枝杆菌/结核分枝杆菌复合群检验方法汇总及其优劣势比较
专利ZL200810134583.1公开了一种核酸序列新的扩增技术，更具体地说，涉及利用交叉引物恒温扩增靶核酸序列的方法。
发明内容
本发明的其中一个发明目的在于提出一种检测结核分支杆菌复合群的方法，不仅检测效率更高，而且检测精度也更高。
本发明的另一发明目的在于提出一种全自动一体化核酸检测试剂盒，它可以对样品进行制备(核酸提取)、核酸扩增和检测分析的全自动一体化处理，用于检测结核分枝杆复合群核酸。
为了实现本发明之目的，采用如下技术方案：
结核分枝杆菌复合群核酸检测方法，其特点是：通过使用结核分枝杆菌复合群的特异性引物，利用交叉引物恒温扩增技术对样本中的结核分枝杆菌复合群核酸的靶基因特定片段进行扩增，然后通过分子信标对靶基因特定片段进行实时荧光检测以实现结核分枝杆菌复合群的筛查检测；所述方法以枯草芽孢杆菌为内控，用于对检测进行质量监控，具体是将枯草芽孢杆菌孢子与样本混合一起进行核酸提纯、扩增和检测；所述检测方法的所有过程在同一个测试剂盒中进行，实现了核酸提取和纯化、核酸扩增及检测分析三个过程的全自动一体化。
上述的结核分枝杆菌复合群核酸检方法中，所述要进行扩增的靶基因特定片段为两组，且相应地利用两组不同的特异性引物同时进行两组扩增反应，并对两组扩增反应同时进行荧光检测，以实现两个反应体系下的检测。
前述的结核分枝杆菌复合群核酸的检测试剂盒中，所述结核分枝杆菌复合群核酸中需要进行扩增的靶基因特定片段为TB_IS6110和TB_gyrB327；
针对TB_IS6110的结核分枝杆菌复合群的特异性引物为SEQ#1～SEQ#7；
针对TB_gyrB327的结核分枝杆菌复合群的特异性引物为：SEQ#14～SEQ#20；
所述枯草芽孢杆菌核酸中需要进行扩增的靶基因特定片段Bsu_rpoB473；
针对Bsu_rpoB473的特异性引物为SEQ#8～SEQ#13。
各基因序列具体参见下表。
其中，上述基因序列的方向均为5’-3’，Cy5为5’-端标记的Cy5荧光基团，BHQ2为3’-端均标记的BHQ2淬灭基团；FAM为5’-端标记的FAM荧光基团，BHQ1为3’-端均标记的BHQ1淬灭基团。
前述的结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒中，所述针对TB_IS6110的扩增反应体系的反应液成份配比为：
前述的结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒，所述针对TB_gyrB327的扩增反应体系的反应液成份配比为：
TB_gyrB327&Bsu_rpoB473 工作浓度
TB_gyrB327_FB1 0.1～0.5uM
TB_gyrB327_RB2 0.2～1uM
TB_gyrB327_OP 0.6～2.6uM
TB_gyrB327_MB-IP3 0.4～1.6uM
TB_gyrB327_CPR 0.5～2.5uM
TB_gyrB327_MB-FAM 0.1～0.5uM
TB_gyrB327_FB2 0.4～0.6uM
Bsu_rpoB473_FB 0.12～0.24uM
Bsu_rpoB473_RB1 0.08～0.16uM
Bsu_rpoB473_OP 0.56～1.12uM
Bsu_rpoB473_MB2-IP 0.08～0.16uM
Bsu_rpoB473_OP-CPR 0.4～0.8uM
Bsu_rpoB473_MB2-CY5 0.1～0.5uM
GspFbuffer 1～2.5x
MgSO4(硫酸镁) 2～8mM
dNTP 0.2～1mM
Betaine(甜菜碱) 0～1M
酶 4～15U
内控孢子(枯草芽孢杆菌孢子) 3e3～5E6拷贝
ddH2O(双蒸水) 溶剂
实现前述方法的全自动一体化核酸检测试剂盒，其特点是：包括主管和主管下方的支管，支管内设有第一分隔层和第二分隔层(采用热变性材料，如石蜡)，第一分隔层位于管和支管的连接处，第二分隔层位于第一分隔层下方；所述主管内设有裂解液，裂解液内设有可被磁化的混匀装置(全部或部分可被磁化，受外部磁性材料的引力)；第一分隔层和第二分隔层之间设有清洗液，清洗液由附加分隔层分隔为两部分(可进行两次独立的清洗)，第二分隔层下方设有反应液。
前述的全自动一体化核酸检测试剂盒中，所述主管内设有纳米磁珠和枯草芽孢杆菌孢子。
前述的全自动一体化核酸检测试剂盒中，针对双系统下的扩增反应及检测，所述支管的数目为两个，每个支管的第二分隔层内包裹有部分反应组份(酶，引物，探针，dNTP等)，反应组分可以承载在可被磁化的载体上，从而可利用外部磁力带入反应液；部分反应组份和反应液合并后构成了的反应液包含了扩增反应所需的所有成份，两个支管内的部分反应组份和反应液分别用于两组不同的扩增反应。其中一个支管内包含针对TB_IS6110的扩增反应体系的反应液成份，另一个支管包含针对TB_gyrB327的扩增反应体系的反应液成份。
前述的全自动一体化核酸检测试剂盒中，所述主管上端为开口处，开口处设有止流圈，止流圈上封有封口膜，封口膜上设有预压缝，且开口处外侧设有上盖。
前述的全自动一体化核酸检测试剂盒中内含纳米磁性颗粒，裂解液，清洗液，洗脱液，内控(枯草芽孢杆菌孢子)，反应试剂(酶、引物、探针)，其阳性对照为含有结核分枝杆菌TB_IS6110片段和TB_gyrB327片段的质粒混合液；阴性对照为无菌双蒸水。它主要是采用纳米磁珠牵引下的多层液相移动技术和热变性材料控制的多级温控阀门系统，以具体实现对核酸提取纯化，扩增及检测一体化。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、操作简单，可重复性高：操作者只需经过一步加样处理，“一键式”完成整个检测过程，因而可重复性高；
2、检出率高：全自动一体化核酸检测试剂盒的“二分管”设计，具有两个支管，可以同时独立完成结核分枝杆菌复合群的两个不同基因靶序列扩增，避免因基因片段缺失造成的漏检，从而提高检出率；
3、全封闭一体化检测：本发明可采用多级磁性介质(纳米磁珠)牵引下的多层液相移动技术和热变性材料(石蜡)控制的多级温控阀门，使得可以利用外部磁性体作为动力源,并通过加热对试剂盒内的样品进行隔离式的混匀及转送处理，同时在管内设置可被磁化的混匀装置，因而样品从核酸提取至扩增和检测的多个处理步骤均可发生在同一个检测管内，并且全自动一体化核酸检测试剂盒为全封闭状态，从而减少了样本交叉污染和扩增产物污染的机会，因此不仅检测效率更高，而且检测精度也更高。
4、全程内控：内控与样本一同经历从核酸抽提到扩增检测的全过程，可以监控核酸抽提效率、扩增试剂失效、扩增仪器故障或样本中的抑制物；
5、适用性好：可同时满足集中型中心实验室和基层医疗机构的样品检测需求；
6、对操作者技能和使用环境无特殊要求：由于本试剂盒操作简单，并且全程封闭检测，因而对操作技能和仪器使用环境无特殊要求。
附图说明
图1是本发明全自动一体化核酸检测试剂盒的结构示意图。
1-主管，2-支管，3-上盖，4-止流圈，5-封口膜，6-混匀装置，7-纳米磁珠，8-枯草芽孢杆菌孢子，9-部分反应组份，10-裂解液，11-第一分隔层，12、14-清洗液1，13-附加分隔层，，15-第二分隔层，16-反应液。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
全自动一体化核酸检测试剂盒，如图1所示：包括主管1和主管1下方的支管2，支管2内设有第一分隔层11和第二分隔层15，第一分隔层11位于管1和支管2的连接处，第二分隔层15位于第一分隔层11下方；所述主管1内设有裂解液10，裂解液10内设有可被磁化的混匀装置6(如带铁芯的混匀装置)；第一分隔层11和第二分隔层15之间的空间被附加分隔层13(可采用油作为附加分隔层13)隔为两个区间；两个区间内均设有清洗液12、14，第二分隔层15下方设有反应液16。所述主管1内设有纳米磁珠7和枯草芽孢杆菌孢子8。所述支管2的数目为两个，每个支管2的第二分隔层15内包裹有部分反应组份9；部分反应组份9和反应液16合并后构成了的反应液包含了扩增反应所需的所有成份，两个支管2内的部分反应组份9和反应液16分别用于两组不同的扩增反应。所述主管1上端为开口处，开口处设有止流圈4，止流圈4上封有封口膜5，封口膜5上设有预压缝，且开口处外侧设有上盖3。其中一个支管中的部分反应组份9和反应液16合并后构成权利要求4所述的针对TB_IS6110的扩增反应体系的反应液成份配比；另一个支管中的部分反应组份9和反应液16合并后构成权利要求5所述的针对TB_gyrB327的扩增反应体系的反应液成份配比。
其中，所述反应液如下：
所述针对TB_IS6110的结核分枝杆菌复合群的特异性引物为：
SEQ#1:TAGCAGACCTCACCTATGTGTC
SEQ#2:TAGCAGACCTCACCTATGTGTCTTCGGTGACAAAGGCCACGT
SEQ#3:ACAGCCCGTCCCGCCGAT
SEQ#4:AGGACCACGATCGCTGATC
SEQ#5：TGGCCATCGTGGAAGCGA
SEQ#6：5-FAM-CGACGCaGCCGCTTCGGACCACCAGGCGTCG-BHQ1-3
SEQ#7：CTGGGCAGGGTTCGCCT
所述针对TB_gyrB327的结核分枝杆菌复合群的特异性引物为：
SEQ#14:TCGGACGCGTATGCGATA
SEQ#15:GCGATATCTGGTGGTCTGC
SEQ#16:CGGTGGTTAACGCGCTATC
SEQ#17:CGGTGGTTAACGCGCTATCAACCTGAGACCACTCGTAC
SEQ#18：GCGCCCCTTGCTTGAGG
SEQ#19：FAM-CGCCCGGCTCGAAGTCGAGATCAAGGGCG-BHQ2
SEQ#20：CGGCTCGAAGTCGAGAT
所述枯草芽孢杆菌核酸中需要进行扩增的靶基因特定片段Bsu_rpoB473；其特异性引物为：
SEQ#8:TACCGCAACTGTCATTCCA
SEQ#9:CGTGGCGCATGGTTAGAATA
SEQ#10:CGTGGCGCATGGTTAGAATAAGAACCGTAACCGGCAAC
SEQ#11:GTATTTCGCAGGTACTCGTTCTC
SEQ#12：TGTCCGCATTGATCGCACAC
SEQ#13：Cy5-CGGCCGTGTCCGCATTGATCGCACACCGGCCG-BHQ2
其中，上述基因序列的方向均为5’-3’，Cy5为5’-端标记的荧光基团，BHQ2为3’-端均标记的淬灭基团。
所述针对TB_IS6110的扩增反应体系的反应液成份配比为：
IS6110&rpoB473 工作浓度范围 优先选择
TB_IS6110_CPR 0.2～1.8uM 0.93uM
TB_IS6110_AP 0.2～1uM 0.47uM
TB_IS6110_RB 0.1～0.5uM 0.09uM
TB_IS6110_FB 0.1～0.5uM 0.09uM
TB_IS6110_OP 0.2～1.8uM 1.35uM
TB_IS6110_MB-IP1 0.2～1.8uM 0.67uM
TB_IS6110_MB-FAM 0.1～0.5uM 0.3uM
Bsu_rpoB473_FB 0.12～0.5uM 0.3uM
Bsu_rpoB473_RB1 0.08～0.5uM 0.2uM
Bsu_rpoB473_OP 0.2～1.8uM 1.4uM
Bsu_rpoB473_MB2-IP 0.2～1.8uM 0.2uM
Bsu_rpoB473_OP-CPR 0.2～1.8uM 1uM
Bsu_rpoB473_MB2-CY5 0.1～0.5uM 0.3uM
酶缓冲液 1～2.5x 1x
MgSO4(硫酸镁) 2～8mM 4mM
dNTP 0.2～1mM 0.6mM
Betaine 0～1M 0.375M
酶 4～15U 6U
内控孢子 3e3～5E6拷贝 5E5拷贝
ddH2O(双蒸水) 补足至25～50ul
total 25～50ul
所述针对TB_gyrB327的扩增反应体系的反应液成份配比为
阳性对照：含有结核分枝杆菌IS6110基因(MycobacteriumtuberculosisH37Rv全基因组上共有16个该插入序列)[NCBI：emb/AL123456.3,range:889737..889935]以及GyrB基因[NCBI:emb/AL123456.3,range:5570..5726]的DNA。阳性对照的制备步骤：利用两条外围引物和以结核分枝杆菌的基因组DNA模板进行PCR扩增获得目的基因；用上海生工纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过上海生工T-easy质粒试剂盒，构建含有目的基因片段的质粒；用分光光度计测A260定量并稀释至106拷贝/微升，-20℃保存。
阴性对照：无菌双蒸水。
上述全自动一体化核酸检测试剂盒的工作原理：首先，通过刺穿全自动一体化核酸检测试剂盒封口膜将待测样品(可以是待测的已液化的痰液，但不局限于痰液)加入管内，同时外部热源加热促使样品裂解，然后外部磁性体控制检测管内的纳米磁珠上下移动和可被磁化的混匀装置移动，以促使样品、磁珠与裂解液充分混匀，促进磁珠和核酸的结合，从而实现核酸抽提。然后，外部热源使第一分隔层融化，外部磁性体带动纳米磁珠，使吸附有核酸的纳米磁珠进入清洗液进行清洗，从而实现核酸纯化。接着，第二分隔层融化，纳米磁珠携带核酸进入反应液，同时在第二分隔层中的反应组分也进入反应液。核酸在反应液中洗脱后，纳米磁珠离开反应液。外部热源使支管底部维持恒温，核酸在反应液中进行恒温扩增反应，同时外部实时搜集荧光信号进行检测。其中两个支管内可设置针对不同核酸片段的反应液(有不同的特异性引物)，实现不同体系下的检测。
本发明的试剂盒中阳性对照中的结核分枝杆菌质粒DNA制备方法，包括下列步骤：
(1)利用两条外围引物SEQ#4/5和SEQ#14/18和进行PCR扩增，分别获得TB_IS6110和TB_gyrB327两个目的基因片段；
(2)对步骤(1)得到的PCR扩增产物进行纯化；
(3)将步骤(2)得到的纯化后的扩增产物通过质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因SEQ#21和SEQ#23所示的质粒序列；
(4)将所抽提的质粒定量并稀释至107拷贝/微升。
(5)将上述两种质粒DNA混合，使其终浓度均为106拷贝/微升，-20℃保存。
其中，在步骤(2)中，采用上海生工的PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；在步骤(3)中采用上海生工的T-easy质粒转染试剂盒。
利用本发明的试剂盒检测结核分枝杆菌复合群的具体方法：
取500ul-2ml样本至全自动一体化核酸检测试剂盒内；对照的全自动一体化核酸检测试剂盒中分别加入阳性对照模板和阴性对照模板。
将加样后的全自动一体化核酸检测试剂盒放入恒温扩增多段磁导核酸分析仪，启动特定程序开始进行检测，其中恒温扩增在60～65℃下扩增反应40～60分钟，优选63℃下扩增反应60分钟。
反应结束后，保存数据文件。通过仪器的自动分析系统获得：MTC阳性或者MTC阴性或者无效等结果。在本研究中，内控表现正常时，如果恒温时间(Tt，即扩增曲线与阈值线的交叉处对应的时间)小于或等于58分钟，检测结果为阳性；如果恒温时间(Tt)大于58分钟，检测结果为阴性。内控表现不正常时，检测结果为“复检”。
上述所述样本包括痰液，但不限于痰液，可以是菌液。
用本发明的全自动一体化试剂盒检测结核分枝杆菌复合群核酸的具体方法：
a、取1ml液化后的痰液至全自动一体化核酸检测试剂盒内；对照的全自动一体化核酸检测试剂盒中分别加入阳性对照模板和阴性对照模板。
B、恒温扩增多段磁导核酸分析仪按照如下程序进行检测：
核酸提取：
裂解液区：85℃加热2min；磁铁运动频次15次/min,2min；
洗脱区：80次2min,磁铁运动频次40次/min,2min；
扩增：63℃保温60min；
荧光信号收集：荧光信号收集每分钟进行一次。
熔解曲线：由63℃升到95℃，再从95℃降到40℃，
由40℃开始熔解，一直到95℃。
c、反应结束后，保存数据文件。通过仪器的自动分析系统获得结果：MTC阳性或者MTC阴性或者复检。在本研究中，内控表现正常时，如果恒温时间(Tt，即扩增曲线与阈值线的交叉处对应的时间)小于或等于58分钟，检测结果为阳性；如果恒温时间(Tt)大于58分钟，检测结果为阴性。内控表现不正常时，检测结果为“复检”。
反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒来检测重复性好，且对样本的检测仅仅需要约1-1.5个小时就能完成，大大缩短检测时间。同时本试剂盒只需要1个人就可以完成所有的操作过程，这样也减少了人力的浪费。

Claims (10)

1.结核分枝杆菌复合群核酸检测方法，其特征在于：通过使用结核分枝杆菌复合群的特异性引物，利用交叉引物恒温扩增技术对样本中的结核分枝杆菌复合群核酸的靶基因特定片段进行扩增，然后通过分子信标对靶基因特定片段进行实时荧光检测以实现结核分枝杆菌复合群的筛查检测；所述方法以枯草芽孢杆菌为内控，用于对检测进行质量监控，具体是将枯草芽孢杆菌孢子与样本混合一起进行核酸提纯、扩增和检测；所述检测方法的所有过程在同一个试剂盒中进行，实现了核酸提取和纯化、核酸扩增及检测分析三个过程的全自动一体化。
2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌复合群核酸检方法，其特征在于：所述要进行扩增的靶基因特定片段为两组，且相应地利用两组不同的特异性引物同时进行两组扩增反应，并对两组扩增反应同时进行荧光检测，以实现两个反应体系下的检测。
3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌复合群核酸检测方法，其特征在于：所述结核分枝杆菌复合群核酸中需要进行扩增的靶基因特定片段为TB_IS6110和TB_gyrB327；
TB_IS6110片段为SEQ#21：
CtgatgaccaaactcggcctgtccgggaccacccgcggcaaagcccgcAGGACCACGATCGCTGATCcggccacagcccgtcccgccgatctcgtccagcgccgcttcggaccaccagcacctaaccggctgtgggtagcagacctcacctatgtgtcgacctgggcagggttcgcctacgtggcctttgtcaccgacgcctacgctcgcaggatcctgggctggcgggTCGCTTCCACGATGGCCAcctccatggtcctcgacgcgatcgagcaagccatctggacccgccaacaagaaggcgtactc
TB_gyrB片段为SEQ#23：
TCGACTCGGACGCGTATGCGATATCTGGTGGTCTGCACGGCGTCGGCGTGTCGGTGGTTAACGCGCTATCCACCCGGCTCGAAGTCGAGATCAAGCGCGACGGGTACGAGTGGTCTCAGGTTTATGAGAAGTCGGAACCCCTGGGCCTCAAGCAAGGGGCGCCGACCAAGAAGACGGGGTCAACGGTGCGGTTCTGGGCCGACCCCGCTGTTTTCGAAACCACGGAATACGACTTCGAAACCGTCGCCCGCCGGCTGCAAGAGATGGCGTTCCTC
针对TB_IS6110的结核分枝杆菌复合群的特异性引物包括以下序列：
SEQ#1(OP):TAGCAGACCTCACCTATGTGTC
SEQ#2(CPR):TAGCAGACCTCACCTATGTGTCTTCGGTGACAAAGGCCACGT
SEQ#3(AP):ACAGCCCGTCCCGCCGAT
SEQ#4(FB):AGGACCACGATCGCTGATC
SEQ#5(RB)：TGGCCATCGTGGAAGCGA
SEQ#6：5-FAM-CGACGCAGCCGCTTCGGACCACCAGGCGTCG-BHQ1-3
SEQ#7(IP1)：CTGGGCAGGGTTCGCCT
针对TB_gyrB327的结核分枝杆菌复合群的特异性引物包括以下序列：
SEQ#14(FB):TCGGACGCGTATGCGATA
SEQ#15(AP,FB2):GCGATATCTGGTGGTCTGC
SEQ#16(OP):CGGTGGTTAACGCGCTATC
SEQ#17(CPR):CGGTGGTTAACGCGCTATCAACCTGAGACCACTCGTAC
SEQ#18(RB2)：GCGCCCCTTGCTTGAGG
SEQ#19：FAM-CGCCCGGCTCGAAGTCGAGATCAAGGGCG-BHQ1
SEQ#20(IP3)：CGGCTCGAAGTCGAGAT
其中，上述基因序列的方向均为5’-3’，FAM为5’-端标记的FAM荧光基团，BHQ1为3’-端均标记的BHQ1淬灭基团；
所述枯草芽孢杆菌核酸中需要进行扩增的靶基因特定片段Bsu_rpoB473；
Bsu_rpoB473片段为序列SEQ#22：
gtgtatatttcagtggtaaagtagacaaaaacggtaaaaaaggttttaccgcaactgtcattccaaaccgtggcgcatggttagaatacgaaactgatgcgaaagatgttgtttatgtccgcattgatcgcacacgtaagttgccggttacggttcttttgcgtgctctcggcttcggttccgatcaagagattcttgatctcgtaggagagaacgagtacctgcgaaatacgcttgataaagataacacagaaaacagcgacaaagcgttgctcgaaattta
针对Bsu_rpoB473的特异性引物包括以下序列：
SEQ#8(FB):TACCGCAACTGTCATTCCA
SEQ#9(OP):CGTGGCGCATGGTTAGAATA
SEQ#10(CPR):CGTGGCGCATGGTTAGAATAAGAACCGTAACCGGCAAC
SEQ#11(RB1):GTATTTCGCAGGTACTCGTTCTC
SEQ#12(IP)：TGTCCGCATTGATCGCACAC
SEQ#13：Cy5-CGGCCGTGTCCGCATTGATCGCACACCGGCCG-BHQ2
其中，上述基因序列的方向均为5’-3’，Cy5为5’-端标记的Cy5荧光基团，BHQ2为3’-端均标记的BHQ2淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的结核分枝杆菌复合群核酸检测方法，其特征在于，所述针对TB_IS6110的扩增反应体系的反应液成份配比为：
TB_IS6110 &Bsu_rpoB473 工作浓度范围 TB_IS6110_CPR 0.2～1.8uM TB_IS6110_AP 0.2～1uM TB_IS6110_RB 0.1～0.5uM TB_IS6110_FB 0.1～0.5uM TB_IS6110_OP 0.2～1.8uM TB_IS6110_MB-IP1 0.2～1.8uM TB_IS6110_MB-FAM 0.1～0.5uM Bsu_rpoB473_FB 0.12～0.5uM Bsu_rpoB473_RB1 0.08～0.5uM Bsu_rpoB473_OP 0.2～1.8uM Bsu_rpoB473_MB2-IP 0.2～1.8uM Bsu_rpoB473_OP-CPR 0.2～1.8uM Bsu_rpoB473_MB2-CY5 0.1～0.5uM 酶缓冲液 1～2.5x MgSO4 2～8mM dNTP 0.2～1mM Betaine 0～1M 酶 4～15U 内控孢子 3e3～5E6拷贝 ddH2O 溶剂
5.根据权利要求3所述的结核分枝杆菌复合群核酸检测方法，其特征在于，所述针对TB_gyrB327的扩增反应体系的反应液成份配比为
6.实现权利要求1至5任一权利要求所述方法的全自动一体化核酸检测试剂盒，其特征在于：包括主管(1)和主管(1)下方的支管(2)，支管(2)内设有第一分隔层(11)和第二分隔层(15)，第一分隔层(11)位于管(1)和支管(2)的连接处，第二分隔层(15)位于第一分隔层(11)下方；所述主管(1)内设有裂解液(10)，裂解液(10)内设有可被磁化的混匀装置(6)；第一分隔层(11)和第二分隔层(15)之间的空间被附加分隔层(13)隔为两个区间；两个区间内均设有清洗液(12、14)，第二分隔层(15)下方设有反应液(16)。
7.根据权利要求6所述的全自动一体化核酸检测试剂盒，其特征在于：所述主管(1)内设有纳米磁珠(7)和枯草芽孢杆菌孢子(8)。
8.根据权利要求6所述的全自动一体化核酸检测试剂盒，其特征在于：所述支管(2)的数目为两个，每个支管(2)的第二分隔层(15)内包裹有部分反应组份(9)；部分反应组份(9)和反应液(16)合并后构成了的反应液包含了扩增反应所需的所有成份，两个支管(2)内的部分反应组份(9)和反应液(16)分别用于两组不同的扩增反应。
9.根据权利要求6所述的全自动一体化核酸检测试剂盒，其特征在于：所述主管(1)上端为开口处，开口处设有止流圈(4)，止流圈(4)上封有封口膜(5)，封口膜(5)上设有预压缝，且开口处外侧设有上盖(3)。
10.根据权利要求8所述的全自动一体化核酸检测试剂盒，其特征在于：其中一个支管中的部分反应组份(9)和反应液(16)合并后构成权利要求4所述的针对TB_IS6110的扩增反应体系的反应液成份配比；另一个支管中的部分反应组份(9)和反应液(16)合并后构成权利要求5所述的针对TB_gyrB327的扩增反应体系的反应液成份配比。
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