CN102149822A - 用于检测结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的组合物和使用所述组合物通过多重实时pcr来同时检测结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的方法 - Google Patents

用于检测结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的组合物和使用所述组合物通过多重实时pcr来同时检测结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于检测结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的组合物，其包含：(i)靶向IS6110的引物和/或探针，所述IS6110为结核分枝杆菌复合群-特异性基因；(ii)靶向rpoB的引物和/或探针，所述rpoB为分枝杆菌属-特异性基因；和视需要的(iii)作为内对照的靶向植物源基因的引物和/或探针。当使用本发明的组合物进行多重实时PCR时，可以通过单轮PCR测定检测结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌属。因此，本发明实现了具有高可靠性的快速且容易的临床诊断。

Description

用于检测结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的组合物和使用所述组合物通过多重实时PCR来同时检测结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosis complex)或分枝杆菌属(Mycobacterium genus)的组合物和一种使用所述组合物通过多重实时PCR来同时检测结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的方法。更具体地说，本发明涉及一种用于检测结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的组合物，所述组合物包含：(i)靶向IS6110的引物和/或探针，所述IS6110为结核分枝杆菌复合群特异性基因；(ii)靶向rpoB的引物和/或探针，所述rpoB为分枝杆菌属特异性基因；和视需要的(iii)作为内对照的靶向植物源基因的引物和/或探针。
背景技术
结核是自古以来世界上导致死亡的主要传染病。结核的成因性细菌病原体是致结核细菌，所述致结核细菌属于分枝杆菌属并且具有杆状(杆菌)形态，其厚度为0.2-0.5μm并且长度为1-4μm。
分枝杆菌属涵盖导致人类和动物的呼吸道疾病(包括结核)、麻风(韩森氏病(Hansen′s disease))等的各种病原性物种。目前为止，已经识别出大于100种分枝菌物种(Shinnick TM et al.，Mycobacterial Taxonomy.Eur JClin Microbiol Infect Dis.1994；13(11)：884-901)。
已知结核分枝杆菌是导致人类结核的主要菌株。人类结核的罕见病例是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)所致。已知麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)会导致麻风病，即韩森氏疾病(Shinnick TM andGood RC.，Mycobacterial Taxonomy.Eur J Clin Microbiol Infect Dis.1994；13(11)：884-901)。
在经济欠发达的国家，结核是疾病和死亡的主要原因之一。在韩国，估计每年有120,000人感染结核病原体。根据2004年韩国国家统计局(Korea National Statistical Office，KNSO)的统计数据，在2003年的调查中，新结核患者的发病率多达30,687例(每100,000人中64例)，而且就结核死亡率而言，韩国在30个OECD成员国中不体面地排名最高。
近年来，归因于感染AIDS或其他免疫缺陷患者或免疫受损婴儿受非结核性分枝杆菌(NTM)感染，显示类似于结核感染临床症状的非典型结核病例的发病率正稳定增长。
非结核性分枝杆菌(NTM)的实例可以包括鸟分枝杆菌胞内复合群(M.avium-intracellulare complex)或鸟分枝杆菌复合群(M.avium complex)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、苏尔加分枝杆菌(M.szulagai)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、非洲分枝杆菌(M.africanum)和日内瓦分枝杆菌(M.genavense)(Barnes PFet al.，Tuberculosis in patients with human immunodeficiency virus infection.N Engl J Med.1991；324(23)：1644-1650)。
上述例示的NTM的多种细菌菌株对于抗结核药显示多重耐药性，这使得难以对结核取得有效疗效(Kam KM et al.，Trends inMultidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis in Relation to Sputum SmearPositivity in Hong Kong，1989-1999.Clin Infect Dis.2002；34(3)：324-329)。
具体地讲，与结核菌相比，已知鸟分枝杆菌胞内复合群或鸟分枝杆菌复合群(MAC)(其是最常见的NTM物种)对一线抗结核药显示十到一百分之一的较低敏感性。为此，美国胸科学会(American Thoracic Society，ATS)提出一种用于诊断和治疗NTM疾病的方针(美国胸科学会，Diagnosis andtreatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria.Am J Respir CritCare Med.1997；156(2)：S1-S25)。
也就是说，NTM疾病的病原性症状十分类似于结核感染，但用于治疗这两种疾病的治疗性药物彼此间可能完全不同。为了提供对应于受结核或非结核分枝杆菌感染的个别患者的合理治疗方案，有必要尽早且准确地检测和诊断所关注患者的结核和非结核分枝杆菌。
诊断结核的传统方法可以包括患者临床症状的检查、结核菌素皮肤测试、X射线照相术和细菌学测试。虽然结核菌素皮肤测试是用于辨别受结核感染的患者的最简单的手段，但缺点是由于严重结核、麻疹(风疹)和免疫抑制而在无反应性诱导条件下可能经常产生假阴性结果。此外，X射线诊断的效能由读取者的能力决定，并且平均25％的由X射线检查诊断为阳性的患者经其他诊断测试诊断为阴性。因此，由X射线照相术来诊断结核取决于得到异常阴影和读取者对所述异常阴影的准确判读。
细菌学测试(即，结核菌的检测)是诊断结核感染的可靠方法，并且可以包括涂片测试、培养测试、分子诊断测试等。
涂片测试通常使用萋-尼氏染色(Ziehl-Neelsen staining)，萋-尼氏染色是用于辨别耐酸有机物(主要为分枝菌)的一种特殊技术。虽然萋-尼氏染色是简单且快速的诊断技术，但难以辨别结核和非结核性分枝杆菌，而且检测灵敏度也低。
培养测试有利地提供用于准确诊断和辨别结核菌的高检测灵敏度。也就是说，即使在约10个细菌/毫升测试样本的极低浓度下，仍可以检测病原菌。遗憾地是，由于需要约4-8周的长期培养和由良好培训的专业人员检查以得到测试结果，因此这种方法在疗法上并不有利于治疗结核患者。
BACTEC方法(Becton Dickinson，美国)是一种用于诊断结核的新颖方法，其通过放射性同位素来测量由接种到含有C14-棕榈酸酯的液态介质上的细菌新陈代谢产生的14CO2的量并且将所测量的量表示为生长商数。该方法平均要花16天来取得结果。然而，问题在于，需要各种措施和技术人员来安全处理和管理放射性同位素。
基于电泳的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种能够在2-3小时的短时期内通过放大特异性基因区域迅速且准确地诊断结核的方法。PCR测定是一种有用的技术，其实现了在一天内以高灵敏度和95％或更高的特异性来检测临床样本中的结核菌(Wilson SM et al.，Progress toward a simplified polymerase chain reaction and its application todiagnosis of tuberculosis.J Clin Microbiol.1993；31(4)：776-78)。
然而，PCR测定具有诸如遗留污染的高风险和需要PCR技术人员的缺点(Noordhoek GT et al.，Sensitivity and specificity of PCR for detection ofMycobacterium tuberculosis：a blind comparison study among sevenlaboratories.J Clin Microbiol.1994；32(2)：277-284)。
关于结核诊断，PCR测定显示高灵敏度和特异性，尤其是在涂片阳性样本中。因此，应认为可能性在于，当所关注样本是耐酸涂片阳性且PCR阴性时，其可能含有NTM。
在NTM肺病的病发率很高的美国，推荐进行如下诊断。当耐酸涂片阳性样本是PCR阳性时，可初步诊断所关注的受验者患有肺结核。当耐酸涂片阳性样本是PCR阴性时，即便在确认样本中存在/不存在PCR抑制物质之后，也可在再次发现样本为PCR阴性时初步诊断所关注的受验者感染了NTM。NTM感染的最后诊断要花4-8周的培养期(疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)。更新资料：Nucleicacid amplification tests for tuberculosis.MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2000；49：5934)。即使可根据此方针评估受验者暴露于NTM物种，但如果可以直接辨别NTM，则在临床上将会更加有用。
在韩国，结核发病率较高，而NTM疾病的病发率较低。因此，当受验者的测试样本为耐酸涂片阳性时，通常将大部分疑似病例视为具有结核，随后施以抗结核药的恰当药物治疗。然而，在韩国，NTM的隔离率和NTM疾病的病发率最近一直已经在增加。免疫受损个体可能易受NTM疾病感染，然而诊断NTM感染却并非易事。此外，因为NTM物种具有高耐药性，难以有效治疗NTM疾病。另外，NTM疾病还显示出高复发风险(Scientific Committee in Korean Academy of Tuberculosis and RespiratoryDiseases.National survey of mycobacterial diseases other than tuberculosis inKorea.Tuberc Respir Dis 1995；42：277-94)。为此，迫切需要开发能够检测和辨别NTM物种的诊断方法。
作为当前检测NTM物种的可用方法，可以提及AFB染色法。作为用于辨别分枝菌物种的分子生物技术，当前通用的是使用限制性内切酶的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(polymerase chainreaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)和使用特异性探针的PCR杂化。
上述方法显示出低检测灵敏度，且因此不利地需要在实际测试之前进行预先细胞培养或者应涉及复杂的实验步骤。因而，这些传统方法不利于早期检测结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌属。
发明内容
因此，鉴于上述问题而完成了本发明，并且本发明的一个目的为提供一种对结核分枝杆菌复合群特异性基因IS6110具有优异灵敏度的引物和/或探针，其用于准确诊断结核分枝杆菌。
本发明的另一目的为通过对来自所有分枝杆菌属物种所共有的rpoB基因的高特异性基因区进行检测而提供一种具有优异灵敏度的引物和/或探针，以使得可以检测到分枝杆菌属的存在。
本发明的又一个目的为提供一种能够通过使用上述引物和/或探针的多重实时PCR而实现同时检测结核分枝杆菌复合群和非结核性分枝杆菌(NTM)的方法。
附图说明
图1是绘示本领域中传统上已知的分枝菌物种的rpoB基因的局部碱基序列的表；
图2是示出使用根据本发明的分析组合物的结核分枝杆菌复合群-阳性样本的多重实时PCR结果的照片；
图3是示出使用根据本发明的分析组合物的分枝杆菌属-阳性样本的多重实时PCR结果的照片；和
图4是示出使用根据本发明的分析组合物的阴性样本的多重实时PCR结果的照片。
具体实施方式
1.用于检测结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的引物
一方面，本发明提供一种用于检测结核分枝杆菌复合群或非结核分枝杆菌的组合物，所述组合物包含选自由以下各者组成的群组的至少一种引物：含有如SEQ ID NO：1中所述的碱基序列的引物；含有如SEQ IDNO：2中所述的碱基序列的引物；含有如SEQ ID NO：3中所述的碱基序列的引物；和含有如SEQ ID NO：4中所述的碱基序列的引物。
如本文所用，术语“含有如SEQ ID NO：x中所述的碱基序列的引物”旨在涵盖具有95％或更高的序列同源性的碱基序列。原因如下：在引物的长度为20bp时，如果改变两个或两个以上碱基，则引物的解链温度下降5℃或更多，因而导致不希望的结果。另一方面，如果改变单个碱基，则可以通过在PCR过程中略微降低退火温度来获得大体上相同的结果。
为了在本发明的上下文中简洁且方便地进行阐释，“含有SEQ ID NO：x的碱基序列的引物”简称为“SEQ ID NO：x的引物”。
在本发明的上下文中，SEQ ID NO：1的引物和SEQ ID NO：2的引物是旨在靶向IS6110基因区的引物，该IS6110基因区为结核分枝杆菌复合群-特异性基因区。
通常，即使“结核菌”是指人类型结核杆菌(即，狭义上的结核分枝杆菌)，但该术语在本发明的上下文中旨在广义上涵盖牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)和非洲分枝杆菌以及结核分枝杆菌，并且若有必要，则可与术语“结核分枝杆菌复合群”或“TB复合群”互换使用。
IS6110基因是一种插入序列，见于包括人类型结核分枝杆菌和牛型牛分枝杆菌的结核分枝杆菌复合群中。已知结核分枝杆菌复合群含有通常用于结核的PCR诊断中的10-12个IS6110拷贝(Thierry，D.et al.，ClinMicrobiol.1990；28(12)：2668-2673)。然而，KENT等人报道了IS6110视引物的选择位置而显示出假阳性风险的差异(J.Clin Microbiol1995；33(9)：2290-2293)。
为此，本发明的发明人使用碱基序列分析对低假阳性风险区进行了研究并且发现(如在以下实施例中将确认)SEQ ID NO：1的引物和SEQ IDNO：2的引物是能够仅扩增结核分枝杆菌复合群的IS6110基因的引物碱基序列，并且显示出大于97％的极高灵敏度和针对结核分枝杆菌复合群的IS6110基因区的大于99％的阳性预测值，从而确认极低风险的假阳性。据我们所知，尚无此类具有高灵敏度和阳性预测值的引物的报道。
因此，当SEQ ID NO：1的引物和SEQ ID NO：2的引物中的任一者或两者用于诊断结核感染时，有利的是可以以非常高的可靠性来检测结核分枝杆菌复合群。
同时，Doucet-Populaire和同事报道了约7％的非结核性分枝杆菌(NTM)含有IS6110的片段或类似物，从而潜在地存在假阳性的风险(TuberLung Dis 1996；77(4)：358-62)。
因此，辨别分枝杆菌属对于确认非结核性分枝杆菌的存在/不存在十分重要。就此而论，rpoB基因为分枝杆菌属所共有，且因此已知rpoB的存在可以用于辨别分枝菌物种(Lee，Hye-Young等人，韩国专利申请公开案第10-2001-0038701号)。
然而，上述韩国专利使用PCR-RFLP，所述PCR-RFLP由于低灵敏度而不利地需要先前细胞培养或者涉及复杂的实验步骤。因此，该方法不适合在初期迅速检测结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌属。
为此，本发明的发明人打算使用能够迅速且容易地执行对于分枝杆菌属而言灵敏度高的实时PCR的分析方法。
然而，迄今已知用于检测rpoB基因的可用引物形成非常大的扩增产物(340-360bp)，因此其不适合实时PCR。
为了解决该问题，本发明人开发出了形成具有适于实时PCR的大小的扩增产物的引物。也就是说，SEQ ID NO：3的引物和SEQ ID NO：4的引物是用于靶向分枝杆菌属-特异性基因rpoB的引物，并且形成具有100bp或更短的长度的PCR扩增产物。有利的是，使用这些引物产生分枝杆菌属的高度可靠、快速且准确的检测。
视需要地，根据本发明用于检测结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的组合物可进一步包含内对照引物。掺入内对照旨在确认假阴性的问题，即，是否恰当实施了PCR。为此，可视需要选择适当的基因，所述基因不论在所关注样本中存在/不存在结核分枝杆菌或其他分枝菌物种的情况下均正常表达。
在本发明的一个实施方案中，上述内对照引物可为添加到所有测试样本中的植物源基因-特异性引物。
植物源基因优选可为凝集素基因。凝集素基因-特异性引物可为含有如SEQ ID NO：28中所述的碱基序列的引物或含有如SEQ ID NO：29中所述的碱基序列的引物。
下表1示出SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：28和SEQ IDNO：29的引物的碱基序列。
【表1】
引物的碱基序列
如之前所评述，本发明提供一种用于检测结核分枝杆菌复合群的组合物，所述组合物包含含有如SEQ ID NO：1中所述的碱基序列的正义引物和/或含有如SEQ ID NO：2中所述的碱基序列的反义引物，如新颖的结核分枝杆菌复合群IS6110-特异性引物。
此外，本发明提供一种用于检测分枝杆菌属的组合物，所述组合物包含含有如SEQ ID NO：3中所述的碱基序列的正义引物和/或含有如SEQ IDNO：4中所述的碱基序列的反义引物，如新颖的分枝杆菌rpoB-特异性引物。
分枝杆菌rpoB-特异性引物形成具有适合实时PCR的小于100bp的长度的PCR扩增产物。
在本发明的一个实施方案中，分枝菌物种可以为结核分枝杆菌或牛分枝杆菌。通过结合结核分枝杆菌复合群的IS6110基因来协同分析rpoB基因，可以进一步提高结核菌的检测可靠性。
在本发明的另一实施方案中，分枝杆菌菌株可以为非结核性分枝杆菌(NTM)。在此情况下，有利地可以通过rpoB基因的碱基测序来确认除结核分枝杆菌复合群以外的非结核性分枝杆菌的存在/不存在和种类。
图1中示出非结核性分枝杆菌中具有已知rpoB基因序列者。
除了图1给出的分枝菌物种之外，本发明人部分地分析了以下分枝杆菌菌株的rpoB基因的碱基序列：阿卡普分枝杆菌(M.acapulsensis)、微黄分枝杆菌(M.flavescens)、盖斯丁分枝杆菌(M.gastin)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌、粉尘分枝杆菌(M.pulveris)、猿分枝杆菌(M.simiae)、舒华巴契(Schwabacher)蟾蜍分枝杆菌(M.xenopiSchwabacher)、南非分枝杆菌(M.austroafricanum)、隐藏分枝杆菌(M.celatum)、胃分枝杆菌(M.gastri)、戈登分枝杆菌、田野分枝杆菌(M.agri)、亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)、西卡分枝杆菌(M.cekatum)、迪氏分枝杆菌(M.diernhoferi)、偶发分枝杆菌、不产色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、草分枝杆菌(M.phlei)和日内瓦分枝杆菌。
此外，本发明人确认具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的碱基序列的引物对于辨别以下42种分枝菌物种有效并且对其显示出特异性。
Figure BDA0000049926140000081
2.用于检测结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的探针
另一方面，本发明提供一种用于检测结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的组合物，所述组合物包含：选自由以下各者组成的群组的至少一种探针：含有如SEQ ID NO：5中所述的碱基序列的探针；含有如SEQ ID NO：6中所述的碱基序列的探针；和含有如SEQ ID NO：7中所述的碱基序列的探针。
视需要地，所述组合物可以进一步包含内对照探针。所述内对照探针优选为对凝集素基因具有特异性的探针，该凝集素基因为植物源基因。内对照探针可以是含有如SEQ ID NO：30中所述的碱基序列的探针。
如本文所用，术语“含有如SEQ ID NO：x中所述的碱基序列的探针”旨在涵盖具有95％或更高的序列同源性的碱基序列。为了在本发明的上下文中进行简洁且方便地阐释，“含有SEQ ID NO：x的碱基序列的探针”简称为SEQ ID NO：x的探针。
SEQ ID NO：5的探针特异性地与IS6110基因区反应，并且SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7的探针是共同与可检测的分枝杆菌属的任何成员的rpoB基因反应的探针。
以此方式，可以使用IS6110和rpoB-特异性探针进一步清楚地检测所关注样本中的分枝杆菌菌株是否为致结核细菌。通过确认存在/不存在rpoB基因，还可以确认存在/不存在非结核性分枝杆菌。
具体地讲，根据本发明的IS6110或rpoB-特异性探针可以通过TaqMan测定或分子信标测定而有效用于PCR定量分析中。
在本发明的一个优选实施方案中，上述探针用荧光染料在其5′端和3′端标记。就此而论，5′-标记的荧光染料(报道剂)和3′-标记的荧光染料(淬灭剂)可以为彼此间显示相互干扰的荧光染料。因此，当所述探针与样本中的IS6110或rpoB基因结合时，限制了所述探针的显色。然后，当探针经PCR分解时，3′-标记的荧光染料淬灭，而5′-荧光染料受到显色。
对5′-标记的荧光染料没有具体限制。5′-标记的荧光染料的实例可以包括(但不限于)6-羧基荧光素(FAM)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、四氯-6-羧基荧光素和花青-5(Cy5)。
另外，3′-标记的荧光染料的实例可以包括(但不限于)6-羧基四甲基-罗丹明(TAMRA)和黑洞淬灭剂-1，2，3(BHQ-1，2，3)。
下表2示出SEQ ID NO：5到SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：30的探针的碱基序列。
【表2】
探针的碱基序列
Figure BDA0000049926140000091
Figure BDA0000049926140000101
3.用于实时PCR测定的组合物和试剂盒
本发明进一步提供一种用于通过实时PCR分析结核分枝杆菌复合群和/或分枝杆菌属的组合物，所述组合物包含：
选自由以下各者组成的群组的至少一种引物：含有如SEQ ID NO：1中所述的碱基序列的引物；含有如SEQ ID NO：2中所述的碱基序列的引物；含有如SEQ ID NO：3中所述的碱基序列的引物；和含有如SEQ IDNO：4中所述的碱基序列的引物；和
选自由以下各者组成的群组的至少一种探针：含有如SEQ ID NO：5中所述的碱基序列的探针；含有如SEQ ID NO：6中所述的碱基序列的探针；和含有如SEQ ID NO：7中所述的碱基序列的探针。
所述组合物可以进一步包含内对照引物和内对照探针以防止假阴性。
内对照引物可以为含有如SEQ ID NO：28中所述的碱基序列的正义引物或含有如SEQ ID NO：29中所述的碱基序列的反义引物。内对照探针可以是含有如SEQ ID NO：30中所述的碱基序列的探针。
也就是说，根据本发明的定量分析组合物包含：用于检测结核菌或非结核性分枝杆菌的引物；用于检测结核菌或非结核性分枝杆菌的探针；和视需要地，内对照引物和探针。
使用根据本发明的组合物，可以实施实时PCR测定，涉及结合提取自临床样本的DNA分子在单管内同时扩增两种或三种基因，以及实时分析和检测所得扩增产物。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物可以包含：
(i)结核分枝杆菌复合群IS6110-特异性引物和探针混合物，其包含：含有SEQ ID NO：1的碱基序列的正义引物和含有SEQ ID NO：2的碱基序列的反义引物以及含有SEQ ID NO：5的碱基序列的探针；
(ii)分枝杆菌属rpoB-特异性引物和探针混合物，其包含：含有SEQID NO：3的碱基序列的正义引物和含有SEQ ID NO：4的碱基序列的反义引物；以及含有SEQ ID NO：6的碱基序列的探针和/或含有SEQ ID NO：7的碱基序列的探针；
(iii)内对照-特异性引物和探针混合物，其包含：含有SEQ ID NO：28的碱基序列的正义引物和含有SEQ ID NO：29的碱基序列的反义引物；以及含有SEQ ID NO：30的碱基序列的探针；和
(iv)PCR反应混合物，其含有缓冲剂、DNA聚合酶、dNTP和无菌蒸馏水。
如上所述，本发明的分析组合物包含三对引物和三种探针。使用上述组合物，本发明人实施多重实时PCR。因此，经确认，可以在大体上完全排除假阳性风险的情况下，检测和诊断分析物样本中的结核菌和其他分枝杆菌菌株。
具体来说，混合物(i)能够仅扩增结核分枝杆菌复合群，并且包括：具有大于97％的高灵敏度和针对IS6110基因区的大于99％的阳性预测值的引物；和特异性地结合到使用上述引物扩增的IS6110基因区的探针。
此外，混合物(ii)能够扩增作为分枝杆菌属-特异性基因的rpoB基因，并且包括：形成具有适合基于实时PCR测定的长度的rpoB基因区的引物；和特异性地结合到使用上述引物扩增的rpoB基因区的探针。
上述探针结合到可探测的分枝杆菌属的任何成员的rpoB基因上，藉此可以通过将探针结合到rpoB基因上来检测存在/不存在分枝菌物种。
如果需要，则所述组合物可以进一步包含一或多个探针，所述探针含有具有提取自不同分枝菌物种的不同碱基序列的rpoB基因区。在此情况下，可以辨别对应于额外掺入的探针的分枝菌物种。
因此，当使用包含上述组合物的测定试剂盒时，可以更方便且精确地定量结核-特异性基因并且确认存在/不存在非结核性分枝杆菌。本发明的组合物可广泛用于准确诊断结核感染。
可以使用市售的实时PCR装备来进行实时PCR测定。实时PCR装备的实例可以包括(但不限于)SLAN实时PCR检测系统(LG LifeSciences，韩国)、LightCyclerTM(Roche，德国)、ABI PRISMTM 7000/7700(Applied Biosystems，美国)、iCyclerTM(Bio-Rad，美国)、Rotor-GeneTM(Corbett，澳大利亚)和OpticonTM(PharmaTech，美国)。
4.结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的分析
根据本发明的分析组合物可以用于定性分析以确认存在/不存在结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属，或者可以用于定量分析结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属。也就是说，本发明提供一种使用上述分析组合物来定量或定性分析结核菌或非结核性分枝杆菌的方法。
通过确认借助于使用分析组合物的实时PCR来观察到的峰值处的时间点，可以进行旨在辨别存在/不存在结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的定性分析。
此外，通过与标准曲线比较，可以进行定量分析。在本发明的一个优选的实施方案中，根据使用分析组合物的以下程序步骤可以进行定量分析：
(1)混合分析组合物与提取自所关注样本的细菌DNA以制备基因分析样本；
(2)对步骤(1)的基因分析样本进行实时PCR以获得PCR产物；
(3)定量步骤(2)的PCR产物以获得定量曲线；和
(4)使用所述定量曲线，定量样本的细菌DNA中的IS6110-特异性基因、rpoB-特异性基因和内对照-特异性基因。
也就是说，将样本提取的细菌DNA添加到包含三种引物对和三种探针的定量分析组合物中，所述三种引物对和三种探针包括结核分枝杆菌复合群IS6110-特异性引物对和探针、分枝杆菌属rpoB-特异性引物对和探针以及内对照-特异性引物对和探针，然后进行实时PCR。因此，将IS6110-特异性引物对和探针、rpoB-特异性引物对和探针以及内对照(凝集素基因)-特异性引物对和探针中的每一者连接到DNA分子以引起PCR产物的扩增。
当TaqMan测定用作定量PCR产物的方法时，通过在连接到IS6110基因、rpoB基因和凝集素基因的探针分解之后发射的荧光来确认基因的扩增，可以定量IS6110-特异性基因、rpoB-特异性基因和内对照-特异性基因。
5.分枝杆菌属rpoB-特异性核苷酸
此外，本发明提供分枝杆菌属的rpoB-特异性核酸，所述核酸包含选自由以下SEQ ID NO：8到SEQ ID NO：27的碱基序列组成的群组中的至少一种碱基序列：
含有如SEQ ID NO：8中所述的碱基序列的阿卡普分枝杆菌(M.acapulsensis)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：9中所述的碱基序列的微黄分枝杆菌-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：10中所述的碱基序列的盖斯丁分枝杆菌(M.gastin)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：11中所述的碱基序列的胞内分枝杆菌-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：12中所述的碱基序列的堪萨斯分枝杆菌-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：13中所述的碱基序列的粉尘分枝杆菌-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：14中所述的碱基序列的猿分枝杆菌-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：15中所述的碱基序列的舒华巴契(Schwabacher)蟾蜍分枝杆菌-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：16中所述的碱基序列的南非分枝杆菌-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：17中所述的碱基序列的隐藏分枝杆菌-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：18中所述的碱基序列的胃分枝杆菌-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：19中所述的碱基序列的戈登分枝杆菌-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：20中所述的碱基序列的田野分枝杆菌-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：21中所述的碱基序列的亚洲分枝杆菌-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：22中所述的碱基序列的西卡分枝杆菌(M.cekatum)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：23中所述的碱基序列的迪氏分枝杆菌-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：24中所述的碱基序列的偶发分枝杆菌-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：25中所述的碱基序列的不产色分枝杆菌-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：26中所述的碱基序列的草分枝杆菌-特异性核酸；和
含有如SEQ ID NO：27中所述的碱基序列的日内瓦分枝杆菌-特异性核酸。
所有上述例示的核苷酸均含有rpoB基因。使用这些碱基序列，可以构筑共同与分枝杆菌属反应的引物或探针，或者可以容易地构筑具有对应于各分枝菌物种的特异性的引物或探针。
实施例
现在，将结合以下实施例来更详细地描述本发明。提供这些实施例仅用于说明本发明，而不应该解释为限制本发明的范围和精神。
实施例1：用于多重实时PCR的引物和探针的构筑
通过使用可得自Hitachi Software的基因分析程序DNAsis分析以存取编号NC000962存放于由生物技术信息国家中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)、美国国家卫生研究院(National InstitutesofHealth，NIH)管理的GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)的DNA序列，挑选恰当序列，然后用BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)再次分析所述DNA序列，经确认，本文所用IS6110-特异性引物和探针为能够仅扩增结核分枝杆菌复合群的引物和探针序列。
此外，通过从GenBank/Entrez蛋白质数据库获得分枝杆菌rpoB基因，使用软件Clustal-X分析rpoB基因的保存区(参见图1)，挑选恰当序列，然后用BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)再次分析DNA序列，经确认，本文所用rpoB-特异性引物和探针为能够仅扩增分枝杆菌属的引物和探针序列。
此后，使用标准菌株获得未知的其他碱基序列(参见图2)。经确认，经测序的引物还能够扩增新获得的标准菌株的基因。
从本领域公开的专利参考文献获得植物源基因-特异性引物和探针的碱基序列。
实施例2：引物的合成
根据诸如在Molecular Cloning第三版(Sambrook and Russell，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York，USA，2001年)的段落10.42中描述的″Synthesis of Oligonucleotide″之类方法，按Metabion(德国)的要求合成实施例1中分析的引物。
实施例3：从临床样本或标准菌株培养基中提取分枝杆菌DNA
将1-2mL的疑似结核患者唾液或标准菌株培养基和相同量的4NNaOH放入15mL试管中，充分搅拌，然后以4,000rpm离心20分钟。丢弃上清液，向沉淀物中添加10mL PBS缓冲剂(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4)，并且彻底搅拌所得混合物并且以4,000rpm离心20分钟。再次丢弃上清液。将沉淀物转移到1.5毫升试管中，并且向其中添加1mL PBS缓冲剂。搅拌所得混合物并且以13,000rpm离心5分钟。再次丢弃上清液。向沉淀物中添加50-100μl的5％(w/v)Chelex 100树脂(Bio-Rad)，且在100℃下加热所得混合物20分钟并且以13,000rpm离心3分钟。将具有提取的DNA的上清液用作PCR扩增的模板。
实施例4：使用引物和探针的多重实时PCR测定
(1)根据下表3中给出的组合物配方制备PCR组合物，并且在下表4中所述的反应条件下于SLAN实时PCR检测系统(LG Life Sciences，韩国)中进行PCR。
(2)基于实时来测定反应产物。在反应完成之后，使用SLAN 7.0程序分析结果。
(3)经测定如下：图2：结核分枝杆菌复合群-阳性，图3：分枝杆菌属-阳性，和图4：阴性。
【表3】
实时PCR组合物
Figure BDA0000049926140000151
Figure BDA0000049926140000161
【表4】
实时PCR条件
  温度/时间   重复次数
  50℃/2分钟   1
  95℃/10分钟   1
  95℃/10秒，62℃/40秒   35
实施例6：针对结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的传统培养方法 (MGIT，BP，美国)与本发明试剂盒的诊断比较
比较在传统培养方法(MGIT，BD，美国)与本发明的试剂盒之对结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的诊断。
根据制造商的指示进行比较性培养方法。对于培养的阳性样本，用amplicor MTB试剂盒(Roche Diagnostic Systems，NJ，美国)和碱基序列分析来确认分枝菌物种。所得结果在下表5中给出。
【表5】
比较实验结果
A.结果表
Figure BDA0000049926140000162
*TB：结核分枝杆菌复合群/NTM：非结核性分枝杆菌B.灵敏度和特异性
Figure BDA0000049926140000163
如本文所用，术语“灵敏度”是指测试结果呈阳性的患病人员的比例。术语“特异性”是指测试结果呈阴性的无病人员的比例。如本文所用的术语“阳性预测值”是指在诊断测试结果阳性的人员中疾病存在的概率。如本文所用的术语“阴性预测值”是指在诊断测试结果阴性的人员中疾病不存在的概率。
根据表5的结果，当使用根据本发明的组合物进行RT-PCR时，清楚地确认，在与作为结核菌和非结核性分枝杆菌的当前最可靠测定的培养方法比较之后，获得了大体上相当的可靠性。具体地讲，对结核分枝杆菌复合群的灵敏度为97％或更高，且特异性为99％，从而表示本发明的组合物实现了大体上准确地辨别结核细菌物种。
实施例7：针对结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的传统AFB染色 与本发明试剂盒的诊断比较
使实施例3中获得的样本分别进行传统上用于确认非结核性分枝杆菌(NTM)的AFB染色和使用本发明的试剂盒的RT-PCR。为了比较，所得结果在下表6中给出。
【表6】
Figure BDA0000049926140000171
在表6中，(-)表示NTM-阴性，(+)表示NTM-阳性，并且(+)的数量增加表示NTM的浓度更高。
如从表6中可见，通过AFB染色测定为NTM-阳性的所有样本在根据本发明获得的RT-PCR结果中也为NTM-阳性。另一方面，经确认，在通过AFB染色测定为NTM-阴性的样本中，根据本发明的RT-PCR结果发现不少于三个样本为NTM-阳性。
根据这些结果，当使用本发明的组合物时，当与传统AFB染色方法相比时，可以显著更高的灵敏度和可靠性辨别NTM，该传统AFB染色方法为本领域中广泛使用的NTM测定法。
实施例8：对各种分枝菌物种的本发明的RT-PCR测定
类似于实施例3和4，对总计42个分枝菌物种进行RT-PCR。所得结果在下表7中给出。
【表7】
Figure BDA0000049926140000181
在表7中，值小于35表示“分枝杆菌-阳性”并且IC表示“内对照”。另外，Ct表示阈循环数量，即，在执行RT-PCR时通过临界值的循环的数量，因此无Ct表示不存在阈循环。
如从表7中可见，根据本发明的RT-PCR的结果显示，H37Rv结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、BCG牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌(所有均属于结核分枝杆菌复合群)为结核-阳性，而剩余的分枝杆菌物种为分枝杆菌-阳性。因此，清楚地确认，使用本发明的分析组合物的RT-PCR有用于检测结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌属。
工业适用性
如从以上描述显而易见，当使用根据本发明的包含特异性引物和探针的分析组合物来进行实时PCR时，与传统方法相比，可以在较短期内以优异灵敏度和特异性执行对结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的检测。
虽然已经出于说明性目的公开了本发明的优选实施方案，但所属领域的技术人员将理解，在不脱离如随附权利要求书中公开的本发明的范围和精神的情况下，可以存在各种修改、增加和代替。
Figure IDA0000049926190000011
Figure IDA0000049926190000021
Figure IDA0000049926190000031
Figure IDA0000049926190000041
Figure IDA0000049926190000051
Figure IDA0000049926190000061
Figure IDA0000049926190000071
Figure IDA0000049926190000081
Figure IDA0000049926190000091
Figure IDA0000049926190000101
Figure IDA0000049926190000111

Claims (17)

1.一种用于检测结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosiscomplex)或分枝杆菌属(Mycobacterium genus)的组合物，其包含：选自由以下各者所组成的群组的至少一种引物：含有如SEQ ID NO：1中所述的碱基序列的引物；含有如SEQ ID NO：2中所述的碱基序列的引物；含有如SEQ ID NO：3中所述的碱基序列的引物；和含有如SEQ ID NO：4中所述的碱基序列的引物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含内对照引物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述内对照引物是植物源基因-特异性引物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述植物源基因是凝集素基因并且所述植物源基因-特异性引物为含有如SEQ ID NO：28中所述的碱基序列的引物或含有如SEQ ID NO：29中所述的碱基序列的引物。
5.一种用于检测结核分枝杆菌复合群的组合物，其包含含有如SEQ IDNO：1中所述的碱基序列的正义引物和/或含有如SEQ ID NO：2中所述的碱基序列的反义引物作为对结核分枝杆菌复合群的IS6110基因具有特异性的引物。
6.一种用于检测分枝杆菌属的组合物，其包含含有如SEQ ID NO：3中所述的碱基序列的正义引物和/或含有如SEQ ID NO：4中所述的碱基序列的反义引物作为对分枝杆菌属的rpoB基因具有特异性的引物。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中对所述分枝杆菌属的所述rpoB基因具有特异性的所述引物形成长度小于100bp的PCR扩增产物。
8.一种用于检测结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的组合物，其包含：
选自由以下各者组成的群组的至少一种探针：含有如SEQ ID NO：5中所述的碱基序列的探针；含有如SEQ ID NO：6中所述的碱基序列的探针；和含有如SEQ ID NO：7中所述的碱基序列的探针。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述探针在其5′端和3′端标记有荧光染料，并且5′-标记的荧光染料(报道剂)和3′-标记的荧光染料(淬灭剂)彼此间显示出相互干扰。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述5′-标记的荧光染料选自由以下各者组成的群组：6-羧基荧光素(FAM)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、四氯-6-羧基荧光素和花青-5(Cy5)，并且所述3′-标记的荧光染料是6-羧基四甲基-罗丹明(TAMRA)或黑洞淬灭剂-1，2，3(BHQ-1，2，3)。
11.一种用于通过实时PCR分析结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的组合物，其包含：
选自由以下各者组成的群组的至少一种引物：含有如SEQ IDNO：1中所述的碱基序列的引物；含有如SEQ ID NO：2中所述的碱基序列的引物；含有如SEQ ID NO：3中所述的碱基序列的引物；和含有如SEQ ID NO：4中所述的碱基序列的引物；和
选自由以下各者组成的群组的至少一种探针：含有如SEQ IDNO：5中所述的碱基序列的探针；含有如SEQ ID NO：6中所述的碱基序列的探针；和含有如SEQ ID NO：7中所述的碱基序列的探针。
12.根据权利要求11所述的组合物，其进一步包含内对照引物和内对照探针。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述内对照引物是含有如SEQID NO：28中所述的碱基序列的正义引物或含有如SEQ ID NO：29中所述的碱基序列的反义引物，并且所述内对照探针是含有如SEQ IDNO：30中所述的碱基序列的探针。
14.根据权利要求11所述的组合物，其中所述组合物包含：
(i)结核分枝杆菌复合群IS6110-特异性引物和探针混合物，其包含：含有SEQ ID NO：1的碱基序列的正义引物和含有SEQ ID NO：2的碱基序列的反义引物；以及含有SEQ ID NO：5的碱基序列的探针；
(ii)分枝杆菌属rpoB-特异性引物和探针混合物，其包含：含有SEQ ID NO：3的碱基序列的正义引物和含有SEQ ID NO：4的碱基序列的反义引物；以及含有SEQ ID NO：6的碱基序列的探针和/或含有SEQ ID NO：7的碱基序列的探针；
(iii)内对照-特异性引物和探针混合物，其包含：含有SEQ IDNO：28的碱基序列的正义引物和含有SEQ ID NO：29的碱基序列的反义引物；以及含有SEQ ID NO：30的碱基序列的探针；和
(iv)PCR反应混合物，其含有缓冲剂、DNA聚合酶、dNTP和无菌蒸餾水。
15.一种用于分析结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的试剂盒，其包含根据权利要求14所述的组合物。
16.一种用于使用根据权利要求14所述的组合物来分析结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的方法，其包含：
(1)混合根据权利要求14所述的组合物与提取自所关注样本的细菌DNA以制备基因分析样本；
(2)对步骤(1)的所述基因分析样本进行实时PCR以获得PCR产物；
(3)定量步骤(2)的所述PCR产物以获得定量曲线；和
(4)使用所述定量曲线，定量所述样本的细菌DNA中的IS6110-特异性基因、rpoB-特异性基因和内对照-特异性基因。
17.一种分枝杆菌属的rpoB-特异性核酸，其中所述核酸是选自由以下SEQ ID NO：8到SEQ ID NO：27的碱基序列组成的群组中的至少一者：
含有如SEQ ID NO：8中所述的碱基序列的阿卡普分枝杆菌(M.acapulsensis)-异性核酸；
含有如SEQ ID NO：9中所述的碱基序列的微黄分枝杆菌(M.flavescens)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：10中所述的碱基序列的盖斯丁分枝杆菌(M.gastin)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：11中所述的碱基序列的胞内分枝杆菌(M.intracellulare)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：12中所述的碱基序列的堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：13中所述的碱基序列的粉尘分枝杆菌(M.pulveris)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：14中所述的碱基序列的猿分枝杆菌(M.simiae)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：15中所述的碱基序列的舒华巴契(Schwabacher)蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi Schwabacher)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：16中所述的碱基序列的南非分枝杆菌(M.austroafricanum)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：17中所述的碱基序列的隐藏分枝杆菌(M.celatum)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：18中所述的碱基序列的胃分枝杆菌(M.gastri)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：19中所述的碱基序列的戈登分枝杆菌(M.gordonae)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：20中所述的碱基序列的田野分枝杆菌(M.agri)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：21中所述的碱基序列的亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：22中所述的碱基序列的西卡分枝杆菌(M.cekatum)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：23中所述的碱基序列的迪氏分枝杆菌(M.diernhoferi)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：24中所述的碱基序列的偶发分枝杆菌(M.fortuitum)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：25中所述的碱基序列的不产色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)-特异性核酸；
含有如SEQ ID NO：26中所述的碱基序列的草分枝杆菌(M.phlei)-特异性核酸；和
含有如SEQ ID NO：27中所述的碱基序列的日内瓦分枝杆菌(M.genavense)-特异性核酸。
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