KR101323857B1 - 우결핵균 검출용 ｐｃｒ 조성물, 이를 포함하는 우결핵 진단용 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법 - Google Patents

우결핵균 검출용 ｐｃｒ 조성물, 이를 포함하는 우결핵 진단용 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101323857B1
KR101323857B1 KR1020110094898A KR20110094898A KR101323857B1 KR 101323857 B1 KR101323857 B1 KR 101323857B1 KR 1020110094898 A KR1020110094898 A KR 1020110094898A KR 20110094898 A KR20110094898 A KR 20110094898A KR 101323857 B1 KR101323857 B1 KR 101323857B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tuberculosis
pcr
bovis
real
seq
Prior art date
Application number
KR1020110094898A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130031146A (ko
Inventor
고바라다
배성열
나호명
박성도
김용환
문용운
Original Assignee
광주광역시
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 광주광역시 filed Critical 광주광역시
Priority to KR1020110094898A priority Critical patent/KR101323857B1/ko
Publication of KR20130031146A publication Critical patent/KR20130031146A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101323857B1 publication Critical patent/KR101323857B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/5695—Mycobacteria

Abstract

본 발명은 종래의 진단법 보다 신속성과 정확성이 획기적으로 개선된 우결핵의 진단방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명에 따른 우결핵 진단방법은 우결핵균으로서 마이코박테리움 보비스(이하, M. bovis)의 PCR 검출, 특히 실시간 PCR 검출을 통해 우결핵을 진단하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 상기 우결핵의 진단에 이용되는 마이코박테리움 보비스 검출용 PCR 조성물 및 상기 PCR 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

우결핵균 검출용 ＰＣＲ 조성물, 이를 포함하는 우결핵 진단용 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법{The PCR composition for identifying Mycobacterium bovis, the kit and method for diagnosing bovine tuberculosis comprising the same}
본 발명은 종래의 진단법 보다 신속성과 정확성이 획기적으로 개선된 우결핵의 진단방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명에 따른 우결핵 진단방법은 우결핵균으로서 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium. bovis; 이하, M. bovis)의 PCR 검출, 특히 실시간 PCR 검출을 통해 우결핵을 진단하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 상기 우결핵의 진단에 이용되는 마이코박테리움 보비스 검출용 PCR 조성물 및 상기 PCR 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
우(牛)결핵은 인수공통전염병(zoonosis)으로써 공중보건학적 측면에서 볼 때 경제적 손실이 크다는 점에서 중요한 질병으로 취급되고 있으며, 우리나라에서도 오래전부터 국가정책으로 박멸프로그램을 수행해 오고 있다.
M. bovis는 우결핵의 원인체로 알려져 있으며, 가축 간, 야생동물 간, 그리고 가축과 야생동물 간에서뿐만 아니라 동물에서 사람으로 또는 그 역으로 전파되는 것으로 알려져 있다. 몇몇 연구에 의하면, 선진국의 경우 M. bovis에 의한 사람의 감염률은 0.3∼1.5% 정도라고 추정하고 있다.
따라서, 우결핵균을 신속하고 정확하게 검출하여 우결핵을 진단하기 위한 방법의 개발이 무엇보다 중요하며, 다양한 우결핵균의 검출방법이 개발되어 왔다.
현재까지 개발된 우결핵균의 검출방법으로는 튜버큘린 피내반응검사 (intradermal tuberculin test, ITT), Ziehl-Neelsen (ZN) 염색방법, 4∼6주가 소요되는 세균배양, 폴리머라제 연쇄중합반응 (Polymerase chain reaction; PCR) 등이 있다.
이중 ZN 염색방법은 신속하지만 특이성이 결여되고 민감도가 50% 정도로 낮은 문제점을 갖고 있다.
또한, 세균 배양방법은 결핵균의 분리와 배양을 요구하고, 이에 소요되는 시간이 2-3개월로 매우 느리고 분리 및 배양된 균의 생화학 동정을 위해 2-3주가 더 소요될 뿐만 아니라, 배양 민감도가 100%가 아니며, 위(僞)음성의 결과도 나타나는 등의 많은 문제점을 가지고 있다.
한편, 현재 대부분 국가에서 우결핵 진단은 튜버큘린 피내반응검사(intradermal tuberculin test, ITT)를 이용하고 있으며, 우리나라에서도 젖소를 포함한 한우와 사슴에 대해 ITT를 이용한 결핵 검진방법이 사용되고 있다.
농림수산식품부 가축방역협의회 통계자료에 의하면, 2002년 이후부터 매년 평균적으로 430,000 여 마리의 젖소에 대해 ITT 방법으로 결핵검진을 실시하여 매년 600∼800여 마리의 결핵균 감염 소를 진단하고 있으며, 검출률은 0.13∼0.19% 수준으로 유지되고 있다. 그러나, ITT의 민감도 역시 보고자에 따라 차이는 있지만 약 70% 정도로 만족할 정도는 아니다.
이러한 종래 결핵균 진단방법의 문제점들을 개선하기 위해서 PCR 기법을 이용한 결핵균의 동정방법이 개발되었으며, PCR 기법은 마이코박테리움 튜버쿨로시스 복합체 (이하, M. tuberculosis complex 또는 MTC 라고도 함; M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti 가 포함됨)의 검출에 있어 민감도와 특이도를 높이면서 검사기간도 단축할 수 있다.
이러한 방법 중 하나는 M. bovis 확인을 위해서 PCR을 통한 유전자 증폭 부위로 결핵균에 특이적인 삽입서열(insertion sequence, IS)인 IS6110과 IS1081을 사용한다[Zumarraga 등, 2005, J Vet Diagn Invest 17: 232-238쪽; Taylor 등, 2007, BMC Vet Res 3:12]. IS6110은 MTC에서만 존재하고, M. tuberculosis의 유전자내에 일반적으로 5 copy 이상 가지고 있으나, M. bovis 에서는 5 copy 이하로 가지고 있고 대부분의 분리주에서는 1 copy만 존재하는 것으로 보고되었다 [Sreevatsan 등, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94: 9869-9874쪽]. 한편, IS1081은 M. tuberculosis complex(MTC)에서 일반적으로 6 copy가 존재하며, 크기는 1,324 bp이다 [Dziadek 등, 2001, Int J Tuberrc Lung Dis 5: 569-574쪽].
또한, M. tuberculosis는 그에만 삽입된 12.7 kb 절편 유전자 부위를 갖는데, 이 12.7kb 유전자 부위로 인해 병원성과 숙주 범위의 차이가 발생한다는 보고에 기초하여 M. bovis와 감별 진단할 수 있는 PCR 방법도 개발되었다[Zumarraga 등, 1999, Microbiology 145: 893-897쪽; Bakshi 등, 2005, Vet Microbiol 109: 211-216쪽; 고 등, 2007, 한국가축위생학회 30: 393-406쪽].
그러나, 이러한 PCR 기법은 결핵균의 검출을 위해 PCR 반응에 의한 증폭산물을 전기영동을 통해 확인하는 작업을 요구하는 등 번거롭게 시간이 많이 걸릴 뿐만 아니라, 비특이적 PCR 반응산물의 생성으로 우결핵 진단에 있어서 정확한 양성 판정에 문제가 있어 추가적인 검증실험에 시간이 많이 소요되는 단점이 있다.
최근, MTC를 검출하기 위하여 Minor Groove Binding(MGB) 프로브와 TaqMan 프로브를 이용한 실시간(real-time) PCR 방법과 올리고뉴클레오타이드 어레이(Oligonucleotide array)가 개발되었다.
Savelkoul 등과 Pounder 등은 MTC 검출을 위한 실시간 PCR 방법에 이용된 유전자로 IS6110 부분의 염기서열을 이용하였다 [Savelkou 등, 2006, J Microbiol Methods 66: 177-180쪽; Pounder 등, 2006, Diagn Microbiol Infect Dis 54: 217-222쪽].
또한, 최근 결핵균의 동정방법으로 세균 종간에 특이성을 나타내는 internal transcribed spacer(ITS)가 활용된다. ITS는 rRNA가 코딩된 부위에 존재하는 비교적 짧은 염기서열로 여러 부분으로 나누어진 공간으로 존재하기 때문에 다른 유전자보다 더 많은 양을 확보할 수 있어 결핵균의 종구분에 유용하게 이용될 수 있다. Parra 등과 Richardson 등은 MTC의 ITS 염기서열 검출을 위해 Sybr green 형광물질과 TaqMan 프로브를 이용한 실시간 PCR을 이용하였다 [Parra 등, 2008, Vet Microbiol, 127: 315-324쪽; Richardson 등, 2009, J Clin Microbiol, 47: 1497-1502쪽].
또한, Park 등은 저렴한 비용으로 ITS 염기서열을 사용하여 올리고뉴클레오타이드 어레이 기법으로 MTC 등 20개 결핵균을 감별하였다 [Park 등, 2005, Clin Microbiol 43: 1782-1788쪽].
그러나, 올리고뉴클레오타이드 어레이 기법은 염기서열 검증, 두 가지 시료 사이에서 상대적인 유전자 발현의 측정, 부실한 접착력에 의한 칩의 오류, 노동 집약적이며 고가의 장비와 고도의 숙련된 실험자가 필요하다는 점 등의 단점이 있다. 또한, 다양한 유전자의 염기서열을 이용한 실시간 PCR 방법은 M. tuberculosis와 M. bovis를 감별하지 못하는 단점이 있다.
특히, PCR은 변성(denaturation), 혼성화(annealing), 중합(polymerization) 단계를 반복하여 해당 유전자를 증폭하게 되는데, DNA 주형와 프라이머가 결합하는 혼성화(annealing) 온도는 주형와 프라이머간의 GC/AT 비율에 따라 결정되게 된다. 따라서 M. bovis에 대한 프라이머의 설계는 (i) 해당 균종의 DNA 주형에 특이적으로 결합하여 PCR 증폭이 되어야 하고, (ii) 각각 유전자부위별로 설계된 프라이머들은 모두 주형(template)에 결합하는 동일한 혼성화 온도를 공유해야 되며, (iii) PCR 증폭결과는 균종 간에 구별이 될 수 있는 특이성을 가져야만 한다. 그러나 결핵균은 상당히 많은 유전자 부위가 일치하고 있어 M. bovis만을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머를 설계하는 것은 매우 어려운 일이다.
따라서, 현재까지 개발된 우결핵균을 검출할 수 있는 유전자 검사방법보다 더욱 민감도하고 특이적인 진단방법이 당업계에서 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 M. tuberculosis와 M. bovis의 유전자은행 데이터베이스 (Genbank database)에서 제공된 염기서열을 정렬하였을 경우 12.7kb 절편의 염기서열이 M. tuberulosis에만 특이적으로 존재하지만 M. bovis에서는 결여되어 있어, M. tuberculosis 및 M. bovis 각각에 대해 서로 간에 교차반응 없이 특이적인 증폭을 가능케 하는 프라이머와 프로브를 설계할 수 있음을 착안하여, (i) M. bovis 및 M. tuberculosis 각각의 DNA 주형에 특이적으로 결합하여 PCR 증폭을 가능케 하고, (ii) 각각의 유전자 부위별로 설계된 프라이머들 모두가 주형에 결합하는 동일한 혼성화 온도를 공유하는 PCR용 프라이머, 및 실시간 PCR용 프라이머/프로브를 설계한 결과, 본 발명에 따라 제공된 서열의 프라이머 및 프로브가 해당하는 각각의 유전자 부위를 동일한 PCR 조건하에서 특이적 증폭 및 증폭된 산물의 특이적 표적화 검출을 가능하게 하여, 한번의 PCR을 수행하여도 M. bovis와 M. tuberculosis를 신속하고 정확하게 감별할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 우결핵균, 특히 M. bovis를 신속하고 정확하게 검출해낼 수 있는 PCR용 프라이머, 특히 실시간 PCR용 프라이머 및 프로브를 포함하는 PCR 조성물, 상기 PCR 조성물을 포함하는 우결핵 진단용 키트 및 이를 활용한 우결핵 진단방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 우결핵균, 특히 M. bovis 검출용 PCR 조성물은 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 결핵균, 특히 M. tuberculosis 검출용 PCR 조성물은 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 결핵균 복합체, 특히 MTC 검출용 PCR 조성물은 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 각각의 M. bovis, M. tuberculosis, MTC 검출용 프라이머를 포함하는 PCR 조성물은 단일 PCR, 다중 PCR 및 실시간 PCR에 사용될 수 있으며, 실시간 PCR에 사용되는 경우 프로브 또는 인터켈레이터를 포함하여 프라이머에 의한 증폭산물을 실시간으로 확인하는데 이용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 우결핵균의 검출을 위한 실시간 PCR에서 증폭산물의 실시간 증폭을 확인하기 위해서 여러 방법들을 사용할 수 있으며, 예를 들면 인터켈레이팅(interchelating) 방법, 분자 비콘(Molecualr beacon) 방법 및 TaqMan™ 프로브법 등이 사용될 수 있다.
인터컬레이팅 방법은 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 인터켈레이터 (interchelator: SYBR Green I, EtBr 등)를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법으로, 인터컬레이터(interchelator)가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 발광하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다.
분자 비콘 방법은 양 말단을 형광표지 인자(예: FAM, TAMRA 등)과 퀀쳐(quencher; 예: DABCYL등)로 수식한 헤어핀형 이차구조를 만드는 올리고뉴클레오티드 프로브(Molecular Beacon probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법이다. 분자 비콘 프로브는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하며 형광표지 인자와 퀀쳐 물질에 근접해 있어 형광발생이 억제되지만, 혼성화 단계에서 주형 DNA와 상보적인 영역에서 특이적으로 혼성화할때 형광표지 인자와 퀀쳐 물질과의 거리가 멀어져 퀀쳐 물질에 의한 억제가 해소됨으로써 프로브상의 형광색소가 형광을 나타내게 된다. 그러나, 혼성화되지 않은 분자 비콘 프로브는 헤어핀 구조를 유지하고 있어 형광을 나타내지 않게 된다.
TaqMan™ 프로브법은 5'-말단을 형광표지 인자로 3'말단을 퀀쳐(예: TAMRA 등)로 표지한 올리고뉴클레오티드(TaqMan™ probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqMan™ 프로브가 혼성화 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 퀀쳐에 의해 형광 발광이 억제되고, 중합 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3'엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리됨으로서 퀀쳐에 의한 억제가 해제되어 형광을 발광하게 된다.
본 발명에 따르면, 반응 효율, 시간, 형광표지 인자 타입 등을 적절히 고려하여, 위에 열거된 방법 중 적절한 실시간 PCR 증폭 확인방법을 선택할 수 있다. 본 발명에서는 TaqMan™ 프로브 방법을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머를 포함하는 PCR 조성물과 프로브를 이용하여 TaqMan™ 프로브 방법에 의한 실시간 PCR을 수행할 경우, 프로브는 본 발명에 따른 프라이머의 주형 DNA에 대한 혼성화(annealing) 온도에서 PCR 증폭산물에 특이적으로 결합하도록 설계된 염기서열을 갖는 것이 바람직하다.
이러한 염기서열을 갖도록 제조된 프로브를 포함하여 실시간 PCR을 통해 M. bovis, M. tuberculosis, MTC를 검출할 경우, 본 발명에 따른 실시간 PCR 조성물은 예를 들면 다음과 같을 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 실시간 PCR을 통한 우결핵균, 특히 M. bovis 검출용 PCR 조성물은 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 7 의 염기서열을 갖는 프로브를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 실시간 PCR을 통한 결핵균, 특히 M. tuberculosis 검출용 PCR 조성물은 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 7 의 염기서열을 갖는 프로브를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 실시간 PCR을 통한 결핵균 복합체, 특히 MTC 검출용 PCR 조성물은 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프로브를 포함할 수 있다.
본원 명세서에서 언급된 “PCR 조성물” 또는 “실시간 PCR 조성물”은 PCR 또는 실시간 PCR을 수행을 위한 반응액의 제조에 이용될 수 있는 사전혼합물(pre-mix)을 의미하며, 본 발명에 따른 프라이머 또는 프라이머와 프로브의 혼합물 이외에, 완충액, 중합효소, DNA 절단효소 억제제 등의 PCR 또는 실시간 PCR을 수행하기 위해 요구되는 당업계에 공지된 성분을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 PCR 조성물 또는 실시간 PCR 조성물에 포함되는 프라이머 및 프로브의 염기서열은 예를 들면 하기 표 1에서 보는 바와 같다:
균종 명칭 서열(5'→3') 서열번호 증폭산물의
크기(bp)
M.
tuberculosis complex (MTC)
 정방향
(IS1081-650F)		 CGGACTGGCTGCTGCAGC 서열번호 1 166bp
역방향
(IS1081-815R)		 AGCTCTTTGGCCATGATCGA 서열번호 2
프로브
(IS1081-712P)		 TGCTACCTGCTGGGAGTATCCACTCGC 서열번호 6
M. bovis 정방향
(THB-312851F)		 TGTGCGAGCTGAGCGATGTC 서열번호 3 187bp
역방향
(Tbovis-825R)		 AAATGGCTATTGACCAGCTAAGATAT 서열번호 4
프로브
(THB-312940P)		 CCGTAGTCGTGCAGAAGCGCAACAC 서열번호 7
M.
tuberculosis 		정방향
(THB-312851F)		 TGTGCGAGCTGAGCGATGTC 서열번호 3 153bp
역방향
(TH-313003R)		 GCGCCCTATTTGATCTCTGCAA 서열번호 5
프로브
(THB-312940P)		 CCGTAGTCGTGCAGAAGCGCAACAC 서열번호 7
본 발명에 따른 우결핵균 검출용 실시간 PCR 조성물에 포함되는 프로브는 실시간 PCR 반응에 의한 증폭산물의 검출이 가능하도록 통상적인 방식으로 검출 수단이 프로브에 연결, 결합 또는 부착되어 표지될 수 있으며, 이는 실시간 PCR을 통해 증폭산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인 가능하도록 할 수 있다.
예를 들면, 프로브는 통상적으로 사용되는 형광표지 인자, 발광물질, 생발광물질, 동위원소 등으로 표지될 수 있으나, 본 발명이 이로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따르면, 형광표지 인자로 표지되는 것이 바람직하다.
형광표지 인자는 현재 시중에 시판되어 용이하게 입수가능한 물질을 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 형광표지 인자로서 FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, NED, HEX, TET, SYBR Green, Cy3, Texas Red, Cy5, RED 610, RED670 등이 프로브의 5'-말단에 표지될 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 프로브의 3'-말단은 PCR 증폭반응이 일어날 경우에만 발광이 일어나도록 하기 위해서 PCR 증폭산물에 결합하기 이전에는 5'-말단에 표지된 형광표지 인자의 발광을 억제하는 퀀쳐가 연결되어 있는 것이 바람직하다.
한편, 형광표지 인자는 종류에 따라 여기 및 방사 파장이 다르므로, 2 이상의 다른 여기 및 방사 파장을 각각 별도로 검출할 수 있는 실시간 PCR 기기를 이용한다면, 각각의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 각각의 프로브에 다른 형광 표지인자로 표지하여 실시간 PCR을 수행함으로써 2 이상의 특이적 증폭산물을 동일 실시간 PCR 반응액을 통해 검출할 수 있어, 보다 빠르고 신속한 진단을 가능하게 할 수 있다. 이러한 형광표지 인자에 대한 사용방법 등의 구체적인 사항 및 선택은 당업자들에게 자명하다.
당업자라면 유전자의 특이적 증폭을 위한 프라이머의 염기서열 및 이에 의한 PCR 증폭산물의 특이적 표적검출(probing)을 위한 프로브의 염기서열을 알 경우 당업계 공지된 통상의 지식에 따라 PCR 또는 실시간 PCR을 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 실시간 PCR 방법은 통상적인 실시간 PCR 방법에 따라 수행될 수 있으며, 일예로 우라실-DNA 글루코실라아제(UDG) 활성을 위하여 50℃에서 2분간 처리하고, 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 10분간 수행한 후, 변성(denaturation, 94℃에서 15초) 및 혼성화(annealing, 55℃ 내지 60℃에서 60초)의 사이클링을 실시하는 조건을 취할 수 있다.
본 발명에 따른 실시간 PCR 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법으로 특이적인 증폭산물을 비특이적인 증폭산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 얻을 수 있다.
본 발명에 사용가능한 실시간 PCR 기기로는 ABI 사의 실시간(Real-time) PCR 기기 7900, 7500, 7300, Stratagene 사의 Mx3000p, 및 BioRad 사의 Chromo 4 기기 등이 있으나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. PCR 사이클마다 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광표지 인자의 형광강도를 감지하며, 감지된 측정값은 기기에 내장된 프로그램을 통해 자동으로 결과가 분석된다. 이는 일반 PCR에서 증폭결과물의 확인을 위한 PCR 후 전기영동을 불필요하게 한다.
또한, 실시간 PCR 방법은 전기영동법으로는 분별하기 어려운 매우 낮은 농도의 DNA 절편의 존재 유무나 100 bp 미만의 PCR 산물의 확인을 레이저 감광으로 구분할 수 있고, PCR 산물에 대한 2차 오염의 염려가 없으며, 결과가 분석되어 검사가 종료되기까지 모든 과정이 자동 시스템으로 운영되기 때문에 시험자의 실수, 검사의 오류 등이 발생할 확률이 낮으며, 데이터의 수집 및 분석이 용이하고 소요되는 검사시간과 노동력을 최소화시킬 수 있다는 점에서 매우 유용하다.
한편, 본 발명에 따른 M. bovis의 검출용 PCR 조성물은 이를 포함하는 키트 형태로 M. bovis의 검출을 통해 우결핵을 진단하려는 검사자에게 그들의 편익을 위해 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 본 발명의 M. bovis의 검출용 PCR 조성물 이외에 PCR 또는 실시간 PCR 반응을 수행하기 위한 성분들, 예를 들어 중합효소, 완충액, DNA 절단 억제제, 뉴클레오타이드 (NTP) 등을 각각 별도의 용기에 또는 하나의 반응 용기에 넣어 키트에 포함시킬 수 있다. PCR 또는 실시간 PCR 반응을 수행하기 위한 성분들은 당업자에게 자명하게 알려져 있다.
또한, 본 발명에 따른 우결핵 진단용 키트는 M. tuberculosis 검출용 PCR 조성물 또는 MTC 구분 검출용 PCR 조성물을 더 포함할 수 있다. 이 경우, 본 발명에 따른 우결핵 진단용 키트를 이용하여 우결핵균을 진단하면서 검체에 존재하는 균이 결핵균 복합체에 속하는지 또는 우결핵 유발균이 아닌 일반 결핵균인지를 한번의 PCR 또는 실시간 PCR을 수행함으로써 판단할 수 있다.
이 경우, M. tuberculosis 검출용 PCR 조성물은 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함할 수 있으며, MTC 구분 검출용 PCR 조성물은 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 우결핵 진단용 키트는 M. tuberculosis 검출용 PCR 조성물 또는 MTC 구분 검출용 PCR 조성물을 함께 포함할 경우, 실시간 PCR을 수행하기 위해서 M. tuberculosis 검출용 PCR 조성물은 서열번호 7 의 염기서열을 갖는 프로브를 포함할 수 있고, MTC 검출용 PCR 조성물은 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프로브를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 우결핵 진단방법은 PCR 조성물 또는 실시간 PCR 조성물, 또는 이를 포함하는 키트를 우결핵균 검출을 위한 PCR 또는 실시간 PCR에 이용하여 M. bovis를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 우결핵 진단방법은, 예를 들면 검체부터 우결핵균 함유 의심부위를 추출하는 단계; 이로부터 genomic DNA, 특히 M. bovis의 DNA를 수득하는 단계; 수득된 DNA를 주형으로 하여 본 발명에 따른 PCR 또는 실시간 PCR 조성물을 이용하여 PCR 또는 실시간 PCR을 수행함으로써 M. bovis를 검출하는 단계; 및 M. bovis의 존재여부에 따라 우결핵을 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 단계를 수행하는 방법은 당업자에게 자명하게 알려져 있다.
또한, 본 발명에 따른 진단방법은 M. bovis의 검출을 통해 우결핵을 진단함에 있어, 진단의 정확성을 높이기 위해서 M. bovis의 검출과 동시에 본 발명에 따른 M. tuberculosis 및 MTC 검출용 프라이머 및 프라이머/프로브를 이용하여 의심검체의 보유균이 M. tuberculosis인지 아니면 마이코박테리움 튜버쿨로시스 복합체에 해당하지는지를 함께 확인하는 것을 포함한다.
본 발명에 의하면, 결핵균 및 결핵균 감염 의심 검체로부터 DNA를 수득하는 방법은 당업계에 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)에 제시된 바에 따라 제조할 수 있으나, 본 발명이 이에 국한 되는 것은 아니다.
한편, 결핵균 검출을 위한 검체는 결핵감염 의심 소, 배양된 세균 검체 등 모든 시료일 수 있으며, 이들 시료로부터 DNA를 얻기 위한 검체는 동물의 세포, 조직, 기관 또는 신체 일부일 수 있으며, 예를 들면 결핵균이 존재하는 부위라면 어떤 것이든지 검체가 될 수 있으나, 바람직하게는 결핵감염 의심 조직 자체 또는 상기 조직으로부터의 결핵균 배양액이 검체가 될 수 있다. 이로부터 얻은 DNA는 실시간 PCR 등의 모든 PCR을 수행함에 있어서 주형 DNA로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 우결핵 진단용 PCR 조성물은 PCR 반응액에 포함시켜 PCR 반응을 수행하는데 사용될 수 있으며, PCR 반응은 95℃에서의 변성(denaturation) 단계, 60℃에서의 혼성화(annealing) 단계 및 72℃에서의 중합단계의 사이클을 반복하여 수행할 수 있다. PCR 반응이 완료되면 전기영동을 통하여 PCR 증폭산물의 분자크기를 확인하여 PCR 증폭여부를 통해 결핵균의 존재를 판별할 수 있다.
본 발명의 PCR 조성물, 우결핵 진단용 키트 및 진단방법은 병성감정, 또는 도축장에서 발견된 결핵감염 의심 소의 우결핵균 감염 감정, 또는 실험실에서 균배양시 결핵균 감염 여부를 정확하고 간단하게 확인하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 결핵균 유전자의 검출 최소 농도는 M. bovis 유전자(12.7kb 절편)의 경우 10.0 fg/uL이고, MTC 유전자(IS1081)의 경우 10.0 fg/uL로 본 발명에 따른 우결핵 진단방법은 상당한 민감하고 정교한 진단방법이다. 미세한 농도의 DNA에 대해서도 실시간 PCR을 통해 검출가능하기 때문에, 결핵균 의심검체로부터 결핵균만을 특이적으로 배양하지 않더라도 결핵균의 존재여부를 판단할 수 있어, 매우 빠르고 정교한 우결핵의 진단을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 우결핵 진단방법은 우결핵균으로서 M. bovis의 PCR 검출, 특히 실시간 PCR 검출을 통해 종래의 진단법 보다 신속성, 민감성 및 정확성이 획기적으로 개선된 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은 결핵병 발생 여부를 신속하고 정확하게 판단해야 하는 상황에 이용되어, 병의 확산을 조기에 방제하는데 이용될 수 있다.
도 1은 MTC에 특이적으로 존재하는 IS1081 염기서열을 검출하기 위한 PCR용 프라이머 및 프로브를 설계하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 M. tuberculosis에 특이적으로 존재하지만 M. bovis에 결여된 12.7kb 절편의 유전자 염기서열 부위를 이용하여 M. bovis에서만 특이적으로 증폭산물을 생성시킬 수 있는 PCR용 프라이머 및 프로브를 설계하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 M. tuberculosis에 특이적으로 존재하지만 M. bovis에 결여된 12.7kb 절편의 유전자 염기서열 부위를 이용하여 M. tuberculosis에서만 특이적으로 증폭산물을 생성시킬 수 있는 PCR용 프라이머 및 프로브를 설계하는 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 MTC DNA 검출용 프라이머/프로브 세트를 이용한 실시간 PCR 에 의한 MTC의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 M. bovis 검출용 프라이머/프로브 세트를 이용한 실시간 PCR 에 의한 M. bovis 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 M. tuberculosis 검출용 프라이머/프로브 세트를 이용한 실시간 PCR 에 의한 M. tuberculosis 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 MTC와 M. bovis 검출용 프라이머/프로브 세트를 이용한 실시간 PCR 에 의한 MTC와 M. bovis 동시 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 MTC와 M. tuberculosis 검출용 프라이머/프로브 세트를 이용한 실시간 PCR 에 의한 MTC와 M. tuberculosis 동시 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 9은 MTC 검출용 프라이머/프로브를 이용한 실시간 PCR 에 의해 M. bovis IS1081 유전자의 최소 검출농도 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 M. bovis 검출용 프라이머/프로브 세트를 이용한 실시간 PCR 에 의해 M. bovis IS1081 유전자의 최소 검출농도 결과를 나타낸 것이다.
도 11는 MTC와 M. bovis 검출용 프라이머/프로브 세트를 이용한 실시간 PCR 에 의해 우결핵 감염으로 판정된 소의 가검물에서 결핵으로 판정된 검체에 대한 검사결과이다.
이하, 본 발명의 기술적 사상을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실험재료 및 genomic DNA 추출
하기 실시예에서 결핵균 감염 의심 검체 (예를 들면, 소) 또는 각종 박테리아로부터 genomic DNA는 특별한 언급이 없는 한 문헌 [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)]에 개시된 방법에 따라 분리하였다.
한편, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브의 균주 특이적 PCR 또는 실시간 PCR 증폭을 확인하기 위하여 주형 DNA로 사용한 균주 및 대조군 균주는 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같으며, 이에 사용된 균주는 국립수의과학검역원에서 분양받아 실험하였다.
균주 입수처
마이코박테리움 보비스(M. bovis) 국립수의과학검역원
마이코박테리움 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) 국립수의과학검역원
마이코박테리움 에비움(M. avium) 국립수의과학검역원
마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellulare) 국립수의과학검역원
마이코박테리움 포튜튬(M. fortuitum) 국립수의과학검역원
마이코박테리움 펠라이(M. phlei) 국립수의과학검역원
마이코박테리움 페레그리늄(M. peregrinum) 국립수의과학검역원
마이코박테리움 스크로풀레슘(M. scrofulaceum) 국립수의과학검역원
마이코박테리움 세메그마티스(M. smegmatis) 국립수의과학검역원
마이코박테리움 칸사시(M. kansasii) 국립수의과학검역원
대조균주 입수처
대장균(Escherichia coli) 국립수의과학검역원
살모넬라균종(Samonella spp.) 국립수의과학검역원
포도상구균(Staphylococcus aureus) 국립수의과학검역원
클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringnes) 국립수의과학검역원
리스테리아 모노시토제네스(Listeria monocytogenes) 국립수의과학검역원
리스테리아 이노규아(L. innocua) 국립수의과학검역원
캠필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 국립수의과학검역원
캠필로박터 제주니(C. jejuni) 국립수의과학검역원
엔테로박터 페시움(Enterobacter faecium) 국립수의과학검역원
엔테로박터 피칼리스(E. facalis) 국립수의과학검역원
Genomic DNA 농도 측정
하기 실시예에서 각 검체으로부터 분리된 genomic DNA 의 농도는 NanoDrop™ ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer (NanoDrop Technologies, USA)를 이용하여 260:280nm에서 정량한 다음, 분리된 genomic DNA 용액을 멸균된 3차 증류수로 용해한 후 사용시까지 -20℃에서 보관하였다.
[ 실시예 1] 실시간 PCR 용 프라이머 및 프로브 제작
MTC 에 특이적으로 존재하는 IS1081 염기서열부위를 비교분석하여 프라이머와 프보르를 설계하였다. 설계된 프라이머 및 프로브에 해당하는 부위는 도 1에서 보는 바와 같다.
또한, 유전자은행 데이터베이스(Genbank database)를 통해 각 결핵균 복합체 균주의 염기서열을 정렬하여 확인한 결과, M. tuberculosis에만 존재하고 M. bovis에 결여된 12.7kb 절편의 유전자 염기서열을 이용하여 M. bovis 및 M. tuberculosis에 특이적인 프라이머와 프로브를 설계하였다. 설계된 프라이머 및 프로브에 해당하는 부위는 M. bovis에 대하여는 도 2에서, M. tuberculosis 에 대하여는 도 3에서 보는 바와 같다.
상기 각각의 프라이머 및 프로브의 서열은 표 4에서 보는 바와 같으며, Bioneer 社에 의뢰하여 제작한 것을 사용하였다. M. tuberculosis complex 프로브에 사용된 형광표지인자는 FAM을 사용하였으며, 퀀쳐로는 BHQ1을 사용하였다. 또한, M. bovis와 M. tuberculosis 프로브에 사용된 형광표지인자는 JOE을 사용하였으며, 퀀쳐로는 BHQ1을 사용하였다.
균종 프라이머명칭 서열(5'→3') 증폭산물의 크기(bp)
M.
tuberculosis complex (MTC)		 정방향 CGGACTGGCTGCTGCAGC 166bp
역방향 AGCTCTTTGGCCATGATCGA
프로브 FAM-TGCTACCTGCTGGGAGTATCCACTCGC-BHQ1
M. bovis 정방향 TGTGCGAGCTGAGCGATGTC 187bp
역방향 AAATGGCTATTGACCAGCTAAGATAT
프로브 JOE-CCGTAGTCGTGCAGAAGCGCAACAC-BHQ1
M.
tuberculosis 		정방향 TGTGCGAGCTGAGCGATGTC 153bp
역방향 GCGCCCTATTTGATCTCTGCAA
프로브 JOE-CCGTAGTCGTGCAGAAGCGCAACAC-BHQ1
상기 표 4의 프라이머 및 프로브 염기서열 각각에 대하여 유전자은행의 데이터 베이스 (NCBI, Blast, EMBL, GenBank)를 이용하여 특이도를 확인한 결과, 염기서열이 100% 일치하는 동물, 식물 및 미생물은 없었다.
[실시예 2] 실시간 PCR 반응
MTC를 확인하기 위한 목적으로는 표 5의 실시간 PCR 반응액 조성에 따라, M. bovis를 확인하기 위한 목적으로는 표 6의 실시간 PCR 반응액 조성에 따라, M. tuberculosis를 확인하기 위한 목적으로는 표 7의 실시간 PCR 반응액 조성에 따라, 하나의 실시간 PCR 반응액에서 MTC와 M. bovis 의 동시 확인을 위한 목적으로는 표 8의 실시간 PCR 반응액 조성에 따라, 하나의 실시간 PCR 반응액에서 MTC와 M. tuberculosis 의 동시 확인을 위한 목적으로는 표 9의 실시간 PCR 반응액 조성에 따라, 각 표에 기재된 농도로 해당 프라이머, 프로브 및 검사용 주형 genomic DNA를 혼합하고 표 10의 PCR 반응 조건으로 실시간 PCR을 실시하였다. 실시간 PCR 기기는 7500 FAST real-time PCR(Applied biosystems; USA)를 이용하였다.
구분 명칭 농도 함량
MTC 정방향 프라이머 4 pmol/㎕ 1㎕
역방향 프라이머 4 pmol/㎕ 1㎕
프로브 5 pmol/㎕ 1㎕
2X 마스터 믹스 10㎕
주형 DNA 2㎕
증류수 4.6㎕
ROX 0.4㎕
총 20㎕
Premix Ex Taq(2X, Perfect Real time, Takara)
구분 명칭 농도 함량
M. bovis 정방향 프라이머 4 pmol/㎕ 1㎕
역방향 프라이머 4 pmol/㎕ 1㎕
프로브 5 pmol/㎕ 1㎕
2X 마스터 믹스 10㎕
주형 DNA 2㎕
증류수 4.6㎕
ROX 0.4㎕
총 20㎕
Premix Ex Taq(2X, Perfect Real time, Takara)
구분 명칭 농도 함량
M.
tuberculosis 		정방향 프라이머 4 pmol/㎕ 1㎕
역방향 프라이머 4 pmol/㎕ 1㎕
프로브 5 pmol/㎕ 1㎕
2X 마스터 믹스 10㎕
주형 DNA 2㎕
증류수 4.6㎕
ROX 0.4㎕
총 20㎕
Premix Ex Taq(2X, Perfect Real time, Takara)
구분 명칭 농도 함량
MTC 정방향 프라이머 4 pmol/㎕ 1㎕
역방향 프라이머 4 pmol/㎕ 1㎕
프로브 5 pmol/㎕ 1㎕
M. bovis 정방향 프라이머 4 pmol/㎕ 1㎕
역방향 프라이머 4 pmol/㎕ 1㎕
프로브 5 pmol/㎕ 1㎕
2X 마스터 믹스 10㎕
주형 DNA 2㎕
증류수 1.6㎕
ROX 0.4㎕
총 20㎕
Premix Ex Taq(2X, Perfect Real time, Takara)
구분 명칭 농도 함량
MTC 정방향 프라이머 4 pmol/㎕ 1㎕
역방향 프라이머 4 pmol/㎕ 1㎕
프로브 5 pmol/㎕ 1㎕
M.
tuberculosis 		정방향 프라이머 4 pmol/㎕ 1㎕
역방향 프라이머 4 pmol/㎕ 1㎕
프로브 5 pmol/㎕ 1㎕
2X 마스터 믹스 10㎕
주형 DNA 2㎕
증류수 1.6㎕
ROX 0.4㎕
총 20㎕
Premix Ex Taq(2X, Perfect Real time, Takara)
온도 시간 사이클
95℃ 1분 1회
95℃ 15초 45회
60℃ 1분
그 결과는 도 4 내지 도 11에서 보는 바와 같다.
도 4는 M. bovis로부터 얻어진 genomic DNA와 M. tuberculosis로부터 얻어진 genomic DNA를 주형 DNA로 하여 표 5의 반응 조성액을 제조하여 실시간 PCR을 수행한 결과로, MTC DNA 검출용 프라이머/프로브를 이용할 경우, M. bovis 및 M. tuberculosis의 DNA 모두에서 증폭산물이 얻어짐을 알 수 있다.
도 5는 M. bovis로부터 얻어진 genomic DNA를 주형 DNA로 하여 표 6의 반응 조성액을 제조하여 실시간 PCR을 수행한 결과로, M. bovis 검출용 프라이머/프로브가 M. bovis의 DNA를 증폭함을 보여준다.
도 6은 M. tuberculosis로부터 얻어진 genomic DNA를 주형 DNA로 하여 표 7의 반응 조성액을 제조하여 실시간 PCR을 수행한 결과로, M. tuberculosis 검출용 프라이머/프로브가 M. tuberculosis의 DNA를 증폭함을 보여준다.
도 7은 M. bovis로부터 얻어진 genomic DNA를 주형 DNA로 하여 표 8의 실시간 PCR 반응 조성액을 제조하여 실시간 PCR을 수행한 결과로, MTC DNA 검출용 프라이머에 의한 증폭과 M. bovis 검출용 프라이머에 의한 증폭이 모두 일어남을 알 수 있다.
도 8은 M. tuberculosis로부터 얻어진 genomic DNA를 주형 DNA로 하여 표 9의 실시간 PCR 반응 조성액을 제조하여 실시간 PCR을 수행한 결과로, MTC DNA 검출용 프라이머에 의한 증폭과 M. tuberculosis 검출용 프라이머에 의한 증폭이 모두 일어남을 알 수 있다.
도 9는 M. bovis의 DNA를 주형 DNA로 하여 DNA 농도별로 포함하는 표 5의 실시간 PCR 반응 조성액을 제조하여 수행한 실시간 PCR 증폭결과로, 본 발명에 따른 MTC DNA 검출용 프라이머/프로브에 의한 DNA의 최소 검출 농도는 10.0 fg/uL 임을 알 수 있다.
도 10는 M. bovis의 DNA를 주형 DNA로 하여 DNA 농도별로 포함하는 표 6의 실시간 PCR 반응 조성액을 제조하여 수행한 실시간 PCR 증폭결과로, 본 발명에 따른 M. bovis DNA 검출용 프라이머/프로브에 의한 DNA의 최소 검출 농도는 10.0 fg/uL 임을 알 수 있다.
도 11은 우결핵 감염으로 판정된 소의 가검물에 대한 MTC 및 M. bovis 검출용 프라이머/프로브를 사용한 실시간 PCR 증폭결과로, 양성 대조군으로 사용된 M. bovis 의 DNA 에 대한 실시간 PCR 증폭결과와 동일하게 MTC 및 M. bovis 검출용 프라이머/프로브에 의해 특이적 증폭산물이 수득됨을 알 수 있다. 도 11에서 양성대조군, 폐와 림프절의 가검물에 대한 실시간 PCR 증폭은 각각 동일한 조성을 갖는 2개의 반응액에서 수행한 것이다.
[실시예 3] 본 발명에 따른 프라이머/프로브의 교차반응성
MTC, M. bovis 또는 M. tuberculosis 검출용 프라이머/프로브를 사용하여 하기 표 11에 나타낸 균종들에 대하여 표 5 내지 7 의 실시간 PCR 반응 조성물을 제조하여, 실시간 PCR을 수행하였으며, 각각의 증폭결과에 대한 Ct (cycle threshhold) 값은 표 11에서 보는 바와 같다. 표 11를 살펴보면, 본 발명에 따른 각각의 프라이머/프로브는 해당 유전자에 대해서만 교차반응성 없이 증폭결과를 생성함을 알 수 있다.
균종 M
tuberculosis complex 프라이머 프로브 세트		 M. bovis
프라이머 프로브 세트		 M
tuberculosis
프라이머 프로브 세트
마이코박테리움 보비스(M. bovis) 19.35 21.86 불검출
마이코박테리움 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) 22.00 불검출 25.4
마이코박테리움 에비움(M. avium) 불검출 불검출 불검출
마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellulare) 불검출 불검출 불검출
마이코박테리움 포튜튬(M. fortuitum) 불검출 불검출 불검출
마이코박테리움 펠라이(M. phlei) 불검출 불검출 불검출
마이코박테리움 페레그리늄(M. peregrinum) 불검출 불검출 불검출
마이코박테리움 스크로풀레슘(M. scrofulaceum) 불검출 불검출 불검출
마이코박테리움 세메그마티스(M. smegmatis) 불검출 불검출 불검출
마이코박테리움 칸사시(M. kansasii) 불검출 불검출 불검출
대장균(Escherichia coli) 불검출 불검출 불검출
살모넬라균종(Samonella spp.) 불검출 불검출 불검출
포도상구균(Staphylococcus aureus) 불검출 불검출 불검출
클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringnes) 불검출 불검출 불검출
리스테리아 모노시토제네스(Listeria monocytogenes) 불검출 불검출 불검출
리스테리아 이노규아(L. innocua) 불검출 불검출 불검출
캠필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 불검출 불검출 불검출
캠필로박터 제주니(C. jejuni) 불검출 불검출 불검출
엔테로박터 페시움(Enterobacter faecium) 불검출 불검출 불검출
엔테로박터 피칼리스(E. facalis) 불검출 불검출 불검출
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 마이코박테리움 보비스의 검출을 통해 우결핵을 진단하기 위한 키트에 있어서,
    서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis) 검출용 PCR 조성물; 및
    서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 마이코박테리움 튜버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 검출용 PCR 조성물;을 포함하는 것을 특징으로 하는 우결핵 진단용 키트.
  5. 제 4 항에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 마이코박테리아 튜버쿨로시스 복합체 (Mycobacterium tuberculosis complex) 구분 검출용 PCR 조성물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 우결핵 진단용 키트.
  6. 삭제
  7. 제 5 항에 있어서, 마이코박테리움 보비스 검출용 PCR 조성물은 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프로브를 더 포함하고; 마이코박테리움 튜버쿨로시스 검출용 PCR 조성물은 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프로브를 더 포함하고; 마이코박테리아 튜버쿨로시스 복합체 구분용 PCR 조성물은 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 프로브를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 우결핵진단용 키트.
  8. 우결핵 유발 결핵균인 마이코박테리움 보비스를 검출하는 우결핵 진단방법에 있어서, 제 4 항, 제 5 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 우결핵 진단용 키트를 이용하여 PCR 또는 실시간 PCR을 수행하여 마이코박테리움 보비스를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 우결핵 진단방법.
KR1020110094898A 2011-09-20 2011-09-20 우결핵균 검출용 ｐｃｒ 조성물, 이를 포함하는 우결핵 진단용 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법 KR101323857B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110094898A KR101323857B1 (ko) 2011-09-20 2011-09-20 우결핵균 검출용 ｐｃｒ 조성물, 이를 포함하는 우결핵 진단용 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110094898A KR101323857B1 (ko) 2011-09-20 2011-09-20 우결핵균 검출용 ｐｃｒ 조성물, 이를 포함하는 우결핵 진단용 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130031146A KR20130031146A (ko) 2013-03-28
KR101323857B1 true KR101323857B1 (ko) 2013-10-31

Family

ID=48180505

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110094898A KR101323857B1 (ko) 2011-09-20 2011-09-20 우결핵균 검출용 ｐｃｒ 조성물, 이를 포함하는 우결핵 진단용 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101323857B1 (ko)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BMC Infectious Diseases, Vol. 10, No. 118, pp. 1-7 (2010.05.15.) *
Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 11, No. 5, pp. 430-438 (2009.09.30.) *
NCBI, GenBank Accession No. BX248339.1 (2005.04.17.) *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130031146A (ko) 2013-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. PCR-based methodologies for detection and characterization of Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii in foods and environmental sources
Schonenbrucher et al. New triplex real-time PCR assay for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in bovine feces
Haddad et al. Molecular differentiation of Mycobacterium bovis isolates. Review of main techniques and applications
Bölske et al. Diagnosis of paratuberculosis by PCR.
CN101023170A (zh) 结核菌检测用的引物和探针以及使用它们检测人型结核菌的方法
US20230287520A1 (en) Methods of detecting and typing pathogenic strains of francisella tularensis
CN102149822A (zh) 用于检测结核分枝杆菌复合群或分枝杆菌属的组合物和使用所述组合物通过多重实时pcr来同时检测结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌属的方法
Xin et al. Rapid detection and differentiating of the predominant Salmonella serovars in chicken farm by TaqMan multiplex real-time PCR assay
Osek et al. Listeria monocytogenes in foods—From culture identification to whole‐genome characteristics
Haigh et al. A novel clinical syndrome and detection of Anaplasma ovis in Mongolian reindeer (Rangifer tarandus)
CN114891902A (zh) 一种基于液滴数字pcr快速检测五种烈性病原菌的引物探针组合及其应用方法
KR101425149B1 (ko) 원-튜브 네스티드 실시간 피시알을 이용한 개선된 결핵균 진단방법
JP2017136019A (ja) 病原性大腸菌検出用担体、病原性大腸菌検出用キット、及び病原性大腸菌の検出方法
KR102366607B1 (ko) 사료의 생균제 종 판별을 위한 프라이머 및 프로브 세트 조성물 및 이를 포함하는 키트
KR101863458B1 (ko) 리얼타임 pcr을 이용한 살모넬라 감염증 원인균 검사 키트 및 방법
KR101323857B1 (ko) 우결핵균 검출용 ｐｃｒ 조성물, 이를 포함하는 우결핵 진단용 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법
KR101299627B1 (ko) 식중독 세균 동시 검출용 프라이머 및 이의 용도
KR101149875B1 (ko) 가금티푸스균 감별 동정용 유전자 진단법
WO2019221219A1 (ja) 細菌の検査方法、細菌の検査用マイクロアレイ、細菌の検査用キット、細菌の検査用プローブセット、及び細菌の検査用プライマーセット
JP2009268413A (ja) プライマーおよび該プライマーを用いたバチルス属細菌の検出方法
JP5243814B2 (ja) 細菌属特異的プライマーおよび該プライマーを用いた細菌の検出方法
JP2016000015A (ja) 食中毒菌検出用担体、及び食中毒菌検出用キット
JP6873903B2 (ja) 強毒型クロストリジウムディフィシル株の存在を検出するための方法
Best et al. Specific detection of Campylobacter jejuni from faeces using single nucleotide polymorphisms
KR20200059766A (ko) ceuE 타겟 유전자를 통해 캠필로박터 콜리를 신속검출할 수 있는 Singleplex Real-Time PCR 키트의 개발

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160825

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171023

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181120

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191014

Year of fee payment: 7