KR102366607B1 - 사료의 생균제 종 판별을 위한 프라이머 및 프로브 세트 조성물 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생균제 종(species) 판별할 수 있는 DNA 유전자 마커 특이 실시간 중합효소연쇄반응 조성물 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다. 가축의 장내미생물의 균형을 유지, 개선하고자 사료에 첨가하는 락토바실러스 14종, 바실러스 5종, 비피도박테리움 5종, 엔테로코커스 속 2종, 페디오코커스 2종, 클로스트리튬 브티리쿰(Clostridium butyricum) 1종, 효모(Saccharomyces sp.) 3종을 판별할 수 있는 종 및 균주 특이 DNA 유전자 증폭용 프라이머 및 프로브 세트, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 생균제 종류 판별 방법에 관한 것이며, 고가의 분석 장비를 요하지 않으며, 분석기법이 단순하고, 비용이 저렴하여 현장 적용에 용이한 사료 생균제 미생물 종 및 균주 동정을 위한 프라이머 및 프로브 세트 조성물, 이를 이용한 사료 생균제 미생물 종 및 균주 판별키트 및 이를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응법을 제공할 수 있다.

Description

사료의 생균제 종 판별을 위한 프라이머 및 프로브 세트 조성물 및 이를 포함하는 키트{Primer and probe set composition for identification of probiotic species in feed and kit comprising the same}

본 발명은 사료의 생균제로 사용되는 미생물의 종류를 판별할 수 있는 DNA 유전자 마커 특이 실시간 중합효소연쇄반응 조성물 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다. 구체적으로는 가축의 장내미생물의 균형을 유지, 개선하고자 사료에 첨가하는 락토바실러스 (Lactobacillus sp.) 14종, 바실러스 (Bacillus sp.) 5종, 비피도박테리움 (Bifidobacterium sp.) 5종, 엔테로코커스 (Enterococcus sp.) 2종, 페디오코커스 (Pediococcus sp.) 2종, 클로스트리튬 브티리쿰 (Clostridium butyricum) 1종, 효모 (Saccharomyces sp.) 3종을 판별할 수 있는 DNA 유전자 마커 증폭용 프라이머 및 프로브 세트 조성물, 상기 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 포함하는 키트, 상기 프라이머 및 프로브 세트 조성물 또는 키트를 이용한 사료 생균제 미생물 종류 판별 방법에 관한 것이다.

사료 생균제는 가축의 장내미생물의 균형을 유지, 개선함으로써 숙주동물에게 유익한 효과를 유도하고자 사료에 첨가하는 살아있는 미생물 단독 또는 혼합배양물이다. 생균제는 단일균주 또는 혼합균주의 제품으로, 성분등록 시 등록한 정확한 균주로 생산하고 관리되어야 한다. 생균제의 성분 등록 사항은 주요 균주명 및 생균수 최소량을 표시하여야 한다.

사료에 함유되는 생균제의 표준분석법은 적정 농도로 희석한 시료 일정량을 취하여 균에 적합한 선택배지에 도말하여 균 생장에 적합한 온도로 일정시간 배양하여 발생한 집락수를 계수하여 시료 중에 존재하는 균수를 측정하며, 균 종류 확인을 위해 육안 및 현미경으로 배지상의 형태와 색 등을 관찰한 후 생화학적 분석법을 적용하고 있다. 즉, Catalase (가스생산), 15℃ 발육 여부, 45℃ 발육 여부 등의 간단한 테스트를 한다. 그럼에도 균주가 불명확한 경우에 API kit와 균 동정기기인 VITEK-2 system으로 동정 단계를 거치는데 분석자의 숙련도에 따른 차이가 크거나 부족한 데이터베이스 구성으로 일부의 균주는 동정할 수 없는 문제점이 있다.

균 종류를 좀 더 신속히 확인하기 위해서 DNA 분자 수준에서 각 균의 고유 유전형질을 분석하는 분자유전학 분석법이 개발되어 왔으며, 가장 유용하게 사용되는 기법이 리보좀 유전자 염기서열 비교분석이다. 박테리아의 경우 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하며, 효모 등 진핵 미생의 경우 리보솜 유전자 사이의 염기서열, 즉 Internal transcribed spacer (ITS) 염기서열을 이용한다. 그러나 락토바실러스의 경우 16S rRNA 유전자 염기서열이 매우 유사하여 16S rRNA 유전자 염기서열 비교분석 기법을 이용해서는 일부 락토바실러스를 종 수준까지 동정할 수 없으며, 또한 리보솜 유전자 염기서열 비교분석 기법은 ① PCR (Polymerase chain reaction), ② DNA sequencing 그리고 ③ 데이터베이스 비교분석의 다원화된 절차를 단계적으로 거쳐야 한다. 특히 DNA sequencing은 전문화된 고가의 분석 장비를 사용하기 때문에 일반적인 분석실에서 이를 갖추고 직접 운용하기보다는 전문분석기관에 의뢰하고 있으며, 이로 인해 최종의 분석결과를 얻기까지는 수일의 시간이 소요된다.

상기의 한계점을 개선하고자 생균제 속 및 종 판별용 PNA (Peptide nucleic acids) 프로브를 이용하는 PCR 기반의 균주 동정방법이 개발되었다(등록특허 10-2015976). 그러나 이는 ① 분석대상 시료가 복합균주를 함유하는 경우 정확한 균주 동정이 어려울 수 있으며, ② 주요 소재인 PNA 프로브 물질의 가격이 매우 고가인 점, 그리고 ③ 이원화된 PCR 반응 절차는 잘못된 균주 동정 결과를 야기하는 실험실 오염의 주요인이 될 수 있는 점은 이 분석법을 실용화하기에 또 다른 제한요인이 되고 있는 실정이다.

등록특허 제10-2261713호

상기의 문제점을 해결하고자 본 발명에서는 고가의 분석 장비를 요하지 않으며, 분석기법이 단순하고, 비용이 저렴하여 현장 적용에 용이한 사료 생균제 미생물 종 및 균주 동정을 위한 프라이머 및 프로브 세트 조성물, 이를 이용한 사료 생균제 미생물 종 및 균주 판별키트 및 이를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응법을 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 사료 생균제 미생물 종 및 균주 판별을 위한 프라이머 및 프로브 세트 조성물, 상기 조성물을 포함하는 사료 생균제 미생물 종 및 균주 판별키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 조성물을 이용하여 사료 생균제 미생물의 종류를 판별하는 것을 특징으로 하는 생균제 분자동정용 키트를 제공한다.

본 발명은 사료에 첨가하는 생균제 미생물 종 및 균주를 동정하기 위한 실시간 중합효소연쇄반응법에 사용되는 프라이머 및 프로브 세트, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 생균제 종류 판별 방법에 관한 것이다.

상기 프라이머 및 프로브 세트 조성물은 실시간 중합효소 연쇄반응법으로 사료 생균제 미생물 종류를 판별하는 서열번호 1 내지 93 중 어느 하나 이상의 염기서열의 프라이머 및/또는 프로브를 포함한다.

본 발명은 사료 생균제 미생물 균주 유전자에 특이성을 갖는 서열번호 1 내지 93 중 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.

또한, 본 발명에서의 상기 프라이머 및 프로브 조성물 또는 상기 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 94 내지 96 중 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 대조구 유전자(Internal control)를 증폭시킬 수 있는 내부 대조구를 추가로 더 포함할 수 있고, 상기 내부 대조구는 양말단에 형광물질을 포함하는 프로브를 포함할 수 있다.

상기 프라이머 및 프로브 세트는 락토바실러스 균 14종, 바실러스 균 5종, 비피도박테리움 균 5종, 엔테로코커스 균 2종, 페디오코커스 균 2종, 클로스트리듐 브티리쿰 균 1종, 효모 균류 3종류의 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 “중합효소연쇄반응(Real-time Polymerase Chain Reaction: PCR)”은 중합효소를 사용하여 핵산을 연쇄적으로 합성하여 개시 핵산물질을 기하급수적으로 증폭하는 방법으로 보편적으로 사용되며, 특정 핵산의 존재 유무를 확인하는 정성분석 PCR, 특정 핵산의 양을 측정하는 정량 PCR 및 PCR 과정을 실시간으로 추적하는 정성 및 정량 분석을 가능하게 하는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명에서 용어 “프라이머 및 프로브 세트”는 각각 프라이머와 프로브를 포함한다.

프라이머(Primer)는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 서열을 말하며, 중합효소연쇄반응에 있어서 복제, 증폭되는 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용하며, Forward 프라이머와 Reverse 프라이머로 구분되는데, 본 발명에서의 상기 프라이머는 바람직하게는 Forward 프라이머와 Reverse 프라이머를 모두 포함하는 것일 수 있다.

프로브(Probe)는 프라이머에 의해 복제, 증폭되는 핵산 가닥의 염기서열과 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 중합효소연쇄반응으로 복제되는 핵산의 양을 실시간으로 검출하기 위해 올리뉴클레오타이드 양말단에 형광물질을 포함할 수 있다. 각 프로브의 양말단에 표지되는 형광물질은 각각 리포터(reporter)와 소광제(quencher)로써 역할을 수행한다.

상기 ‘리포터(reporter)’는 특정 파장의 빛을 흡수, 방출하여 형광을 발하는 물질로서, 프로브에 표지하여 표적 핵산과 프로브 사이의 혼성화가 이루어졌는지 확인할 수 있는 물질을 의미하며, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TAMRA, Quasar610, Quasar670, 시아닌(Cyanine) 계열 염료로 구성되는 군에서 선택되는 하나일 수 있다. 바람직하게는, 상기 리포터가 FAM, JOE, Quasar670, TAMRA로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기, ‘소광제(quencher)’는 리포터가 발생시킨 빛을 흡수하여 형광세기를 감소시키는 물질을 의미하며, 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀀처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀀처(Black Hole Quencher, BHQ), 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ 및 IRDye QC-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 소광제는 종류에 따라 형광세기를 감소하는 범위가 다르므로 이를 고려하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 프라이머 및 프로브의 ”특이성”은 목적하는 대상을 검출할 수 있는 능력(Inclusivity) 및 목적하지 않는 대상을 구별할 수 있는 능력(Exclusivity)을 말하며, 모든 프라이머와 프로브의 염기서열에 대해 우선적으로 BLAST 검색을 통해 그 특이성을 확인하고 양성대조구 및 음성대조구를 대상으로 실험적 검증이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 및 프로브 세트 조성물 또는 키트를 이용한 생균제 미생물 종 판별 방법을 제공한다.

상기 생균제 미생물의 종류를 판별하는 방법에 있어서,

(a) 미생물 종류별 특이 유전자 검출용 프라이머 및 프로브를 선발하는 단계;

(b) 상기 (a)의 프라이머 및 프로브를 사용하여 균주 특이 실시간중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 하는 단계;

(c) 상기 (b)의 단계 후 생성된 유전자 증폭산물을 확인하고 균 종류를 특정 하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 생균제 미생물 종류를 판별하는 분자동정 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 프라이머 및 프로브 세트 조성물은 제 1 프라이머 및 프로브 세트 내지 제 31 프라이머 및 프로브 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 포함할 수 있다.

구체적으로, 제 1 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 1의 염기서열 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 2 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 4의 염기서열 및 서열번호 5의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 3 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 7의 염기서열 및 서열번호 8의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 4 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 10의 염기서열 및 서열번호 11의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 5 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 13의 염기서열 및 서열번호 14의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 15의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 6 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 16의 염기서열 및 서열번호 17의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 18의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 7 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 19의 염기서열 및 서열번호 20의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 21의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 8 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 22의 염기서열 및 서열번호 23의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 24의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 9 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 25의 염기서열 및 서열번호 26의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 27의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 10 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 28의 염기서열 및 서열번호 29의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 30의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 11 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 31의 염기서열 및 서열번호 32의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 33의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 12 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 34의 염기서열 및 서열번호 35의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 36의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 13 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 37의 염기서열 및 서열번호 38의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 39의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 14 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 40의 염기서열 및 서열번호 41의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 42의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 15 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 43의 염기서열 및 서열번호 44의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 45의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 16 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 46의 염기서열 및 서열번호 47의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 48의 염기서열로 구구성되는 프로브를 포함하고;

제 17 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 49의 염기서열 및 서열번호 50의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 51의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 18 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 52의 염기서열 및 서열번호 53의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 54의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 19 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 55의 염기서열 및 서열번호 56의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 57의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 20 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 58의 염기서열 및 서열번호 59의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 60의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 21 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 61의 염기서열 및 서열번호 62의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 63의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 22 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 64의 염기서열 및 서열번호 65의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 66의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 23 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 67의 염기서열 및 서열번호 68의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 69의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 24 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 70의 염기서열 및 서열번호 71의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 72의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 25 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 73의 염기서열 및 서열번호 74의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 75의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 26 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 76의 염기서열 및 서열번호 77의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 78의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 27 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 79의 염기서열 및 서열번호 80의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 81의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 28 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 82의 염기서열 및 서열번호 83의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 84의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 29 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 85의 염기서열 및 서열번호 86의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 87의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 30 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 88의 염기서열 및 서열번호 89의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 90의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고;

제 31 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 91의 염기서열 및 서열번호 92의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 93의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하고; 로 이루어진 세트 중에서 하나 이상 선택된 것일 수 있다.

또한, 상기 프라이머 및 프로브 세트 조성물은 내부 대조구 유전자(Internal control)를 증폭시킬 수 있는 서열번호 94의 염기서열 및 서열번호 95의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 96의 염기서열로 구성되는 프로브를 포함하는 프라이머 및 프로브 세트를 추가적으로 더 포함할 수 있다.

상기 프라이머 및 프로브 세트에 포함되는 각각의 프로브는 양 말단에 리포터 또는 소광자 등의 물질을 추가적으로 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사료 생균제에서 판별할 수 있는 미생물은 박테리아 6속 29종류와 효모균류 3종류로 이루어진 군에서 선택되는 1종일 수 있다.

구체적으로, 1) 락토바실러스 속 균종은 락토바실러스 락티스(Lactobaillus delbrueckii subsp. Lactis), 락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobaillus delbrueckii subsp. Bulgaricus), 락토바실러스 브레비스(Levilactobacillus brevis), 락토바실러스 살리바리우스(Ligilactobacillus salivarius), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lacticaseibacillus casei), 락토바실러스 커바투스(Latilactobacillus curvatus), 락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum), 락토바실러스 프람타럼(Lactiplantibacillus plantarum subsp. Plantarum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 페롤로렌스(Schleiferilactobacillus perolens), 락토바실러스 파라카제이(Lacticaseibacillus paracasei subsp. Paracasei), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며,

2) 바실러스 속 균종은 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 코아클란스(Bacillus coagulans), 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며,

3) 비피도박테리아 속 균종은 비피토박테리움 롱검(Bifidobacterium longum subsp. Longum), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 서모필럼(Bifidobacterium thermophyllum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium longum subsp. Infantis), 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum subsp. Pseudolongum)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며,

4) 엔테로코코스 속 균종은 엔테로코커스 락티스(Enterococcus lactis), 엔테로코커스 훼시엄(Enterococcus faecium)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며,

5) 페디오코코스 속 균종은 페디오코커스 에시디락티스(Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며,

6) 클로스트리듐 브틸리쿰 균종은 클로스트리듐 브티리컴(Clostridium butyricum)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며,

7) 효모류 균종은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 잔토필로마이세스 덴드로하우스(Xanthophyllomyces dendrorhous), 피키아 파리노사(Pichia farinosa var. farinosa)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 락티스(Lactobaillus delbrueckii subsp. Lactis) 또는 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobaillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 1 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 2 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 브레비스(Levilactobacillus brevis)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 3 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 살리바리우스(Ligilactobacillus salivarius)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 4 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 5 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 카제이(Lacticaseibacillus casei)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 6 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 커바투스(Latilactobacillus curvatus)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 7 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 8 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum subsp. Plantarum)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 9 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 10 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 페롤렌스(Schleiferilactobacillus perolens)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 11 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 파라카제이(Lacticaseibacillus paracasei subsp. Paracasei)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 12 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 13 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바실러스 렌투스(Bacillus lentus)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 14 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 15 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 16 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바실러스 코아글란스(Bacillus coagulans)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 17 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 18 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 비피토박테리움 롱검(Bifidobacterium longum subsp. Longum)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 19 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 20 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 비피도박테리움 서모필럼(Bifidobacterium thermophyllum)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 21 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium longum subsp. Infantis)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 22 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum subsp. Pseudolongum)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 23 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 엔테로코커스 락티스(Enterococcus lactis) 또는 엔테로코커스 훼시엄(Enterococcus faecium)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 24 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 엔테로코커스 락티스(Enterococcus lactis)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 25 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 페디오코커스 에시디락티스(Pediococcus acidilactici)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 26 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 27 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 클로스트리듐 브티리컴(Clostridium butyricum)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 28 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 29 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 잔토필로마이세스 덴드로하우스(Xanthophyllomyces dendrorhous)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 30 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 피키아 파리노사(Pichia farinosa var. farinosa)의 유전자를 검출하는 프라이머 및 프로브는 제 31 프라이머 및 프로브 세트일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기의 조성물을 이용하여 사료에 함유된 미생물 종류 판별을 위한 키트를 제공한다.

사료 생균제 미생물 종류 판별을 위한 키트는 단일 또는 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하는 것을 특징으로 하는 생균제 분자동정 용도의 키트일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 각 프라이머 및 프로브 세트들은 32종 각각의 균주들에 대한 특이성이 확인된(표 4), 본 발명의 상기 프라이머 및 프로브 세트들은 동일한 검체 튜브에 1종 또는 2종 이상의 복수 개가 포함되는 형태로 구성될 수 있다.

본 발명에서, 용어 “다중 실시간 중합효소연쇄반응”은 복수의 프라이머 및 프로브 세트를 동시에 사용하여 복수의 표적 유전자를 같은 반응액 중에서 증폭하는 방법을 지칭하는 것으로, 동시에 사용되는 프로브들은 각각 다른 파장의 빛을 흡수, 방출하여 형광을 발하는 리포터를 포함할 수 있다. 바람직하게는 “FAM, JOE, TAMRA, Quasar670 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 키트에서 상기 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼(buffer) 등을 포함할 수 있다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

상기 DNA 중합효소의 종류에 따라 Taq DNA polymerase based amplification, klenow fragment-based amplification, Phi29 polymerase-based amplification 또는 Helicase-dependent amplification 등의 핵산증폭이 가능하다.

한편, 본 발명에 따른 키트는 내부 대조구 유전자(Internal control)를 증폭시킬 수 있는 서열번호 94의 염기서열 및 서열번호 95의 염기서열로 구성된 프라이머 그리고 서열번호 96의 염기서열로 구성되는 프라이머 및 프로브 세트 또는 상기 세트를 포함하는 조성물을 포함할 수 있으며, 상기 프라이머 및 프로브 세트는 양말단에 형광물질을 포함할 수 있다. 본 발명에서 내부 대조구는 동일한 검체 튜브에 목표로 하지 않은 염기서열을 넣어서 목표로 하는 염기서열과 동시에 증폭되게 하여 중합효소연쇄반응의 오작동, 시약의 적절성 또는 중합효소의 활성 또는 방해물질에 의한 증폭방해를 동정하기 위한 목적으로 사용된다.

본 발명을 통하여 가축의 장내미생물 균형을 유지, 개선하고자 사료에 첨가하는 미생물 7속 31종을 신속하고 정확하게 구분할 수 있으므로, 생균제 종류 판별에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 이는 미생물제제 보조사료 제품의 정확한 미생물 종류 표시를 위한 제품 생산관리업무에 활용이 가능하다. 또한 생균제의 성분표시 위반, 부정유통 방지 등의 유통 사료 품질관리 업무에 활용이 가능하다.

도 1은 사료 생균제 미생물로 사용되는 락토바실러스의 종류를 판별하기 위한 다중 실시간 중합효소연쇄반응결과 증폭곡선을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

1. 표준 균주 준비

박테리아 균류 6개 속 29종, 효모 균류 3개 속 3종, 총 32종의 생균제 표준 균주를 한국생물자원센터 (KCTC)에서 분양받았다 (표 1).

번호	그룹	균주명	학명	균주번호 (KCTC)
1	락토바실러스	락토바실러스 락티스	Lactobaillus delbrueckii subsp. Lactis	3636
2		락토바실러스 루테리	Limosilactobacillus reuteri	3594
3		락토바실러스 불가리쿠스	Lactobaillus delbrueckii subsp. Bulgaricus	3635
4		락토바실러스 브레비스	Levilactobacillus brevis	3498
5		락토바실러스 살리바리우스	Ligilactobacillus salivarius	43133
6		락토바실러스 애시도필러스	Lactobacillus acidophilus	3164
7		락토바실러스 카제이	Lacticaseibacillus casei	3109
8		락토바실러스 커바투스	Latilactobacillus curvatus	3767
9		락토바실러스 퍼멘텀	Limosilactobacillus fermentum	5049
10		락토바실러스 플란타럼	Lactiplantibacillus plantarum subsp. Plantarum	3108
11		락토바실러스 헬베티쿠스	Lactobacillus helveticus	15060
12		락토바실러스 페롤렌스	Schleiferilactobacillus perolens	13107
13		락토바실러스 파라카제이	Lacticaseibacillus paracasei subsp. Paracasei	3510
14		락토바실러스 크리스파투스	Lactobacillus crispatus	5054
15	바실러스	바실러스 렌투스	Bacillus lentus	3738
16		바실러스 리체니포미스	Bacillus licheniformis	1659
17		바실러스 서브틸리스	Bacillus subtilis	3135
18		바실러스 코아클란스	Bacillus coagulans	3625
19		바실러스 푸밀러스	Bacillus pumilus	3855
20	비피도 박테리움	비피도박테리운 롱검	Bifidobacterium longum subsp. Longum	3128
21		비피도박테리움 비피덤	Bifidobacterium bifidum	3357
22		비피도박테리움 서모필럼	Bifidobacterium thermophyllum	3225
23		비피도박테리움 인판티스	Bifidobacterium longum subsp. Infantis	3249
24		비피도박테리움 슈도롱검	Bifidobacterium pseudolongum subsp. Pseudolongum	3224
25	엔테로 코커스	엔테로코커스 락티스	Enterococcus lactis	21015
26		엔테로코커스 훼시엄	Enterococcus faecium	13225
27	페디오 코커스	페디오코커스 애시디락티시	Pediococcus acidilactici	15064
28		페디오코커스 펜토사세우스	Pediococcus pentosaceus	3507
29	클로스트리듐	클로스트리듐 브티리컴	Clostridium butyricum	1871
30	효모	효모	Saccharomyces cerevisiae	7296
31		잔토필로마이세스 덴드로하우스	Xanthophyllomyces dendrorhous	7704
32		피키아 파리노사	Pichia farinosa var. farinosa	27412

분양 받은 표준 균주는 각각의 선택배지에서 적정 조건으로 배양하였다(표 2).

균종	선택배지	배양조건
Lactobacillus sp.	MRS Agar + 0.002% Bromophenol blue	혐기, 30~37℃, 48~72hrs
Bacillus sp.	Nutrient Agar	호기, 35℃, 18~20hrs
Bifidobacterium sp.	Bifidobacterium Selective Agar	혐기, 36±1℃, 24~48hrs
Enterococcus sp.	KF streptococcus Agar	호기, 36±1℃, 48hrs
Pediococcus sp.	MRS Agar + 0.002% Bromophenol blue	혐기, 36±1℃, 48hrs
Clostridium butyricum	Clostridium Difficile Agar	혐기, 36±1℃, 24~48hrs
효모	Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar	호기, 25℃, 5~7일

2. 표준 균주 DNA 추출

각 표준 균주의 활성 배양체로부터 DNeasy Blood & Tissue Kits (QIAGEN)을 이용하여 DNA를 추출 및 정제하였으며, 세부 방법은 키트 제조사의 프로토콜에 따랐다. 추출 및 정제된 DNA는 DS-11 Spectrophotometer (DeNovix)를 이용하여 농도와 순도를 확인한 후 냉동 보관하면서 실험에 사용하였다.

3. 사료 생균제 미생물 균주 특이 프라이머 및 프로브 세트 설계

유전자 마커 관련 연구문헌 분석을 통해 사료 생균제 미생물의 종 및 균주 특이 유전자를 선발하였다. 이들은 주로 16S rRNA 이거나 16S-23S rRNA 또는 18S-28S rRNA 사이의 염기서열, 또는 유전체 비교분석을 통해 종 특이성이 확인된 유전자들이다.

선발된 유전자의 염기서열 정보는 미국 국립생물정보센터 (NCBI)의 GenBank 데이터베이스에서 대표 염기서열을 임의 선택하여 추출하였으며, 추출된 염기서열은 NCBI의 BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 도구를 이용하여 종 특이성 재확인과 더불어 종 내 변이 위치를 확인하였다.

종 특이 유전자의 염기서열에서 프라이머와 프로브를 설계하기 위하여 NCBI의 Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 도구를 이용하였으며, 종 내 변이 위치와 PCR 증폭 산물의 크기를 고려하여 적합한 프라이머 및 프로브 세트를 선택하였다.

선택된 프라이머와 프로브는 Oligonucleotide Properties Calculator (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html) 도구를 이용하여 특성을 확인하고 필요한 경우 일부 염기를 수정하였으며, NCBI의 BLAST 도구를 이용하여 각 프라이머와 프로브의 종 특이성을 인실리코 검증하였다.

설계 및 검증된 프라이머와 프로브는 ㈜제노텍의 올리고뉴클레오타이드 합성 시스템을 이용하여 제작하였다.

하기 표 3에 설계된 각 균주별 프라이머 및 프로브 세트를 정리하였다. 하기 표 3에서 F는 Forward primer, R은 Revese primer, P는 Probe를 의미한다.

세트번호	서열번호	이름	염기서열(5'-3')	분석 대상 균주명	표적유전자
1	1	Lac.del-F	CATTGCAAAGCGACCGAGAG	락토바실러스락티스 /락토바실러스불가리쿠스	16S-23S
	2	Lac.del-R	CGGAGACCTCCGGATCAAAG
	3	Lac.del-P	FAM-TGCCTTGGCACTGGAAGCC-BHQ1
2	4	Lac.reu-F	AACCCAATCAGCTTAGTCGC	락토바실러스루테리	16S-23S
	5	Lac.reu-R1	TCCTACAACCCCAACAAGCA
	6	Lac.reu-P	FAM-TCCCTTTTCGCTCGCCGCT-BHQ1
3	7	Lac.bre-F	CCGGTGAGATAACCTTCGGG	락토바실러스브레비스	16S-23S
	8	Lac.bre-R	ACGCAGTTGTTTCTCGGTTTAA
	9	Lac.bre-P	FAM-AGTCAGCCGTCTAAGGTGGG-BHQ1
4	10	Lac.sal-F	GGAAACCTAACAGGTTTTACCG	락토바실러스살리바리우스	16S-23S
	11	Lac.sal-R	CTTAGTTTGGGCTCTTCCCG
	12	Lac.sal-P	FAM-CTTAGTTGAAGGTAGACGTGGG-BHQ1
5	13	Lac.aci-F	GTATCGGCGTTTGCATGGAC	락토바실러스애시도필러스	특이유전자
	14	Lac.aci-R	ATCGTCACCGAGCGCTATTT
	15	Lac.aci-P	FAM-TCGTGACACCGCTCCTGG-BHQ1
6	16	Lac.cas-F	GGCCGGATGGTGAAGATCAA	락토바실러스카제이	특이유전자
	17	Lac.cas-R	CGAGATGAACGTCCCACCAA
	18	Lac.cas-P	FAM-TCTGGGCCTTGCTCACCG-BHQ1
7	19	Lac.cur-F	CCTTGTACATTTGCGAAGTCG	락토바실러스커바투스	16S-23S
	20	Lac.cur-R1	ATTTGAGTTTAGCGATATGAA
	21	Lac.cur-P	FAM-AACGCAATGTTTTCTCGGCTTTT-BHQ1
8	22	Lac.fer-F	CTCGTTAATCCCTCCTGGTAA	락토바실러스퍼멘텀	특이유전자
	23	Lac.fer-R	GACTAATCAAGGGTGGACACAA
	24	Lac.fer-P	FAM-ATCGGTTGGCTGGTGGTGCT-BHQ1
9	25	Lac.pla-F1	CGCGCCACAACCGGAACGAC	락토바실러스플란타럼	특이유전자
	26	Lac.pla-R1	GGTTGCTTGATCAGTCCTGGTAA
	27	Lac.pla-P	FAM-CGGTTTAGGTGCAGCGGG-BHQ1
10	28	Lac.hel-F	CGGTGTTGGTGGAGGATCAA	락토바실러스헬베티쿠스	특이유전자
	29	Lac.hel-R	TGGCAGTAATTACCCCTGCAA
	30	Lac.hel-P	FAM-CTACTTTAATGGTTTTAGGTGCCT-BHQ1
11	31	Lac.per-F1	GAGCTGACCACACCGAGAAA	락토바실러스페롤렌스	16S-23S
	32	Lac.per-R1	CTCCTAGTGCCAAGGCATC
	33	Lac.per-P1	FAM-CCGTGCGCCCTTCTTCACT-BHQ1
12	34	Lac.par-F2	ACGGCCTTTACCTGCATGAA	락토바실러스 파라카제이	특이유전자
	35	Lac.par-R2	CCGACAGCCTGAACAATGGT
	36	Lac.par-P	FAM-CTGGCACGGAGCCAATCAG-BHQ1
13	37	Lac.cri-F	AATTGCCTAACGGCAAACGC	락토바실러스 크리스파투스	특이유전자
	38	Lac.cri-R	CGTGTCCAATGCCAATCCTG
	39	Lac.cri-P	FAM-TGGTACTGCATTTCTAAGGTATTG-BHQ1
14	40	Bac.len-F	TGCAAGTCGAGCGAATGGAT	바실러스 렌투스	16S
	41	Bac.len-R	CGTCTTTCAACCTTTCTCCAG
	42	Bac.len-P	FAM-TAGCGGCGGACGGGTGAG-BHQ1
15	43	Bac.lic-F	ATGTCTACATCGCTCAGCCG	바실러스리체니포미스	특이유전자
	44	Bac.lic-R	CGTTTCCCAAAGCTGTGTCG
	45	Bac.lic-P	FAM-ACAATGACCAGCAGCTCGAA-BHQ1
16	46	Bac.sub-F	TGACAGTGATAGGCACTGCG	바실러스 서브틸리스	특이유전자
	47	Bac.sub-R	AGCGCCCAGTAAGAATCGAG
	48	Bac.sub-P	FAM-AGTCGGAATCATGCCGCCG-BHQ1
17	49	Bac.coa-F	AAGAAACGATGGCGCTGGAT	바실러스 코아글란스	특이유전자
	50	Bac.coa-R	CAAAATCGCACATCCGGTAAT
	51	Bac.coa-P	FAM-CATTTATGATCAGGACGGCGT-BHQ1
18	52	Bac.pum-F	TGGAAGTCTCCAGCTTACCG	바실러스 푸밀러스	특이유전자
	53	Bac.pum-R	TCGATAGAATTTTATCTAGTCGC
	54	Bac.pum-P	FAM-ACGTTTAGGATCTTCCCTCTTAA-BHQ1
19	55	Bif.lon-F	CTCAACACCAACCCCGATCA	비피도박테리움 롱검	특이유전자
	56	Bif.lon-R	GCACGTGCATAGTTGGAACC
	57	Bif.lon-P	FAM-CCGGCGTGGTGCTTCCAT-BHQ1
20	58	Bif.bif-F	CACGACCAATTCCGAGACCC	비피도박테리움비피덤	특이유전자
	59	Bif.bif-R	CACATGTCGATCTCGGCGTA
	60	Bif.bif-P	FAM-TCTGCTGCGGTACGCGTTC-BHQ1
21	61	Bif.the-F	AAAGCCGCCCAAGAACTACA	비피도박테리움 서모필럼	특이유전자
	62	Bif.the-R	TTCGGGGTTTTGAGGTCGAG
	63	Bif.the-P	FAM-CAAATGCGCGTCGGCGAAG-BHQ1
22	64	Bif.inf-F	AGACCGYCGACAAGTTGAAT	비피도박테리움 인판티스	특이유전자
	65	Bif.inf-R	TACAACGGGCGATAGGAACG
	66	Bif.inf-P	FAM-TTCCCGAATGCCGCTGCCA-BHQ1
23	67	Bif.pse-F	GTGACATCGTCACCAATGCG	비피도박테리움 슈도롱검	특이유전자
	68	Bif.pse-R	GTCCGGATGGGTGTTTTCCT
	69	Bif.pse-P	FAM-CCGCATGCAGCGCGATCG-BHQ1
24	70	Ent-IPC-F1	CCTTATTGTTAGTTGCCATCATTC	엔테로코코스훼시엄 /엔테로코코스락티스	16S
	71	Ent-IPC-R1	CAGGCGAGTTGCAGCCTG
	72	Ent-IPC-P	FAM-TTAGCCTCGCGACTTCGCAA-BHQ1
25	73	Ent.lac-F	TGCTAAGACGATCGGTTGGT	엔테로코코스락티스	특이유전자
	74	Ent.lac-R	AGAGTAGTAAAGGTTGCCATTTCA
	75	Ent.lac-P	FAM-CCCCAATCATCAACAGCTTCCA-BHQ1
26	76	Ped.aci-F	CATGCGGGAAAACGAAGACC	페디오코커스에시디락티시	특이유전자
	77	Ped.aci-R	CCACTTGTATTCTTCAGGATCCA
	78	Ped.aci-P	FAM-CATTGGCGAATTGATTGGTGGT-BHQ1
27	79	Ped.pen-F	AAAAATCCTTGCCACTCGCTAC	페디오코커스펜토사세우스	특이유전자
	80	Ped.pen-R	AGCCAGAACTTACACCATCATC
	81	Ped.pen-P	FAM-AGGGCGATGGTTGCTCCGT-BHQ1
28	82	Clo.but-F990	ATGGAGGAAGCCACTTCcGT	클로스트리듐브티리컴	16S
	83	Clo.but-R1206	TCTCGCGAGGTTGCATCaCA
	84	Clo.but-P999	FAM-ACAGGTGGTGCATGGTTGTC-BHQ1
29	85	Sac.cer-F	GTTTCTTTCTTGCTATTCCAAtCG	효모	ITS
	86	Sac.cer-R	TGTTTGTTACCTCTGGGgCC
	87	Sac.cer-P	FAM-AGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGA-BHQ1
30	88	Xan.den-F	ATACCGGGGTGTTCTGTCCT	잔토필로마이세스 덴드로하우스	ITS
	89	Xan.den-R	GCGAGAACCAAGAGATCCGT
	90	Xan.den-P	FAM-CGGACGGAGCGCCCTACTCT-BHQ1
31	91	Pic.far-F	ATTTGGACGTAATTCTTCTGGTAT	피키아 파리노사	ITS
	92	Pic.far-R	ATAAATTGAAGTTAGGTTGTCCTC
	93	Pic.far-P	FAM-TTGCGCGGCGAGTGCTATTA-BHQ1
32	94	IC-F	AAGGCAGCTATCAAGTAAGTGT	- (내부 대조구)	GAPDH
	95	IC-R	GTTTCCCCTCAGACTCCTCC
	96	IC-P	Qua670-TTGCCCTTACAGAAAGTGAAGA-BHQ3

4. 단일 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 사료 생균제 미생물 균주 특이 프라이머 및 프로브 세트의 특이성 확인

실시간 중합효소연쇄반응물은 다음과 같은 조건으로 제조하였다; 5X qPCRMix (제노텍, 한국) 4㎕, 10pmol/㎕ 정방향 프라이머 1㎕, 10pmol/㎕ 역방향 프라이머 1㎕, 5pmol/㎕ 프로브 1㎕, 1ng/㎕ DNA 1㎕, 증류수 12㎕를 첨가하여 총량이 20㎕가 되도록 하였다.

실시간 중합효소연쇄반응은 7500 Real-time PCR system (Applied Biosystems, USA) 장비를 사용하였고, 반응조건은 95℃에서 2분간 변성시킨 다음 95℃에서 30초, 55℃에서 40초 반응을 35회 반복 수행하였으며, 반응결과는 7500 software v2.3을 이용하여 확인하였다.

상기의 실시간 중합효소연쇄반응 방법을 이용하여 각 그룹별 1 내지 14 종의 표준균주 DNA를 대상으로 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 사용했을 때, 각 프라이머 및 프로브 세트의 표적 종에만 증폭 곡선이 보이면서 ‘Ct’ 값이 측정되고, 표적 종을 제외한 나머지 종에는 어떤 증폭 곡선도 보이지 않으면서 ‘Ct’ 값 또한 측정되지 않는 것을 모두 확인함으로써 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트가 각 종별로 특이성을 가진다는 사실을 확인하였다(표 4). Ct 값이란, PCR 산물이 측정 가능한 양으로 증폭되기 시작하는 시점의 중합효소연쇄반응 반복횟수를 말하며, 하기 표 4에 나타난 바와 같이, 측정된 Ct 값의 범위는 ‘18~26’임을 확인하였다.

표적 종명

균주번호 (KCTC)

프라이머 및 프로브 세트

#1

#2

#3

#4

#5

#6

#7

#8

#9

#10

#11

#12

#13

#14

#15

#16

#17

#18

#19

#20

#21

#22

#23

#24

#25

#26

#27

#28

#29

#30

#31

락토바실러스 락티스

3636

○ (Ct20.1)

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

락토바실러스 루테리

3594

X

○ (Ct25)

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

락토바실러스 불가리쿠스

3635

○ (Ct23.1)

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

락토바실러스 브레비스

3498

X

X

○ (Ct25)

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

락토바실러스 살리바리우스

43133

X

X

X

○ (Ct25)

X

X

X

X

X

X

X

X

X

락토바실러스 애시도필러스

3164

X

X

X

X

○ (Ct25)

X

X

X

X

X

X

X

X

락토바실러스 카제이

3109

X

X

X

X

X

○ (Ct25)

X

X

X

X

X

X

X

락토바실러스 커바투스

3767

X

X

X

X

X

X

○ (Ct25)

X

X

X

X

X

X

락토바실러스 퍼멘텀

5049

X

X

X

X

X

X

X

○ (Ct25)

X

X

X

X

X

락토바실러스 프란타럼

3108

X

X

X

X

X

X

X

X

○ (Ct25)

X

X

X

X

락토바실러스 헬베티쿠스

15060

X

X

X

X

X

X

X

X

X

○ (Ct25)

X

X

X

락토바실러스 페롤렌스

13107

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

○ (Ct25)

X

X

락토바실러스 파라카제

3510

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

○ (Ct25)

X

락토바실러스 크리스파투스

5054

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

○ (Ct25)

바실러스 렌투스

3738

○ (Ct 25)

X

X

X

X

바실러스 리체니포미스

1659

X

○ (Ct 25)

X

X

X

바실러스 서브틸리스

3135

X

X

○ (Ct 25)

X

X

바실러스 코아클란스

3625

X

X

X

○ (Ct 25)

X

바실러스 푸밀루스

3855

X

X

X

X

○ (Ct 25)

비피도박테리운 롱검

3128

○ (Ct 25)

X

X

X

X

비피도박테리움 비피덤

3357

X

○ (Ct 25)

X

X

X

비피도박테리움 서모필럼

3225

X

X

○ (Ct 25)

X

X

비피도박테리움 인판티스

3249

X

X

X

○ (Ct 25)

X

비피도박테리움 슈도롱검

3224

X

X

X

X

○ (Ct 25)

엔테로코커스 락티스

21015

○ (Ct 25)

X

엔테로코커스 훼시엄

13225

○ (Ct 25)

○ (Ct 25)

페디오코커스 애시디락티시

15064

○ (Ct 25)

X

페디오코커스 펜토사세우스

3507

X

○ (Ct 25)

클로스트리듐 브티리컴

1871

○ (Ct 25)

효모

7296

○ (Ct 25)

X

X

잔토필로마이세스 덴드로하우스

7704

X

○ (Ct 25)

X

피키아 파리노사

27412

X

X

○ (Ct 25)

5. 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 락토바실러스 종 판별 프라이머 및 프로브 세트의 특이성 확인

다중 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 14종류의 락토바실러스를 판별하기 위하여 7 종류의 프라이머 및 프로브 세트 혼합물(이하, 올리고 혼합물)을 준비하였다. 올리고 혼합물은 내부 대조구(IC)와 1 내지 2종의 종 특이 프라이머 및 프로브 세트를 포함하며, 각 올리고 혼합물에 포함되는 프라이머와 프로브의 종류와 농도 그리고 프로브에 표지된 리포터의 종류는 아래와 같다(표 5).

구분	세트번호	서열번호	이름	염기서열(5'-3')	분석대상 종 명	농도 (pmol/ul)	비고
올리고혼합물 #1	#5	13	Lac.aci-F	GTATCGGCGTTTGCATGGAC	락토바실러스애시도필러스	10	빨강색
		14	Lac.aci-R	ATCGTCACCGAGCGCTATTT		10
		15	Lac.aci-P	FAM-TCGTGACACCGCTCCTGG-BHQ1		5
	#4	10	Lac.sal-F	GGAAACCTAACAGGTTTTACCG	락토바실러스살리바리우스	10	파랑색
		11	Lac.sal-R	CTTAGTTTGGGCTCTTCCCG		10
		12	Lac.sal-P	JOE-CTTAGTTGAAGGTAGACGTGGG-BHQ1		5
	#32	94	IC-F	AAGGCAGCTATCAAGTAAGTGT	내부대조구	10	노랑색
		95	IC-R	GTTTCCCCTCAGACTCCTCC		10
		96	IC-P	Qua670-TTGCCCTTACAGAAAGTGAAGA-BHQ3		5
올리고혼합물 #2	#13	37	Lac.cri-F	AATTGCCTAACGGCAAACGC	락토바실러스크리스파투스	10	빨강색
		38	Lac.cri-R	CGTGTCCAATGCCAATCCTG		10
		39	Lac.cri-P	FAM-TGGTACTGCATTTCTAAGGTATTG-BHQ1		5
	#1	1	Lac.del-F	CATTGCAAAGCGACCGAGAG	락토바실러스락티스 /락토바실러스불가리쿠스	10	파랑색
		2	Lac.del-R	CGGAGACCTCCGGATCAAAG		10
		3	Lac.del-P	JOE-TGCCTTGGCACTGGAAGCC-BHQ1		5
	#32	94	IC-F	AAGGCAGCTATCAAGTAAGTGT	내부대조구	10	노랑색
		95	IC-R	GTTTCCCCTCAGACTCCTCC		10
		96	IC-P	Qua670-TTGCCCTTACAGAAAGTGAAGA-BHQ3		5
올리고혼합물 #3	#10	28	Lac.hel-F	CGGTGTTGGTGGAGGATCAA	락토바실러스헬베티쿠스	10	빨강색
		29	Lac.hel-R	TGGCAGTAATTACCCCTGCAA		10
		30	Lac.hel-P	FAM-CTACTTTAATGGTTTTAGGTGCCT-BHQ1		5
	#3	7	Lac.bre-F	CCGGTGAGATAACCTTCGGG	락토바실러스브레비스	10	파랑색
		8	Lac.bre-R	ACGCAGTTGTTTCTCGGTTTAA		10
		9	Lac.bre-P	JOE-AGTCAGCCGTCTAAGGTGGG-BHQ1		5
	#32	94	IC-F	AAGGCAGCTATCAAGTAAGTGT	내부대조구	10	노랑색
		95	IC-R	GTTTCCCCTCAGACTCCTCC		10
		96	IC-P	Qua670-TTGCCCTTACAGAAAGTGAAGA-BHQ3		5
올리고혼합물 #4	#6	16	Lac.cas-F	GGCCGGATGGTGAAGATCAA	락토바실러스카제이	10	빨강색
		17	Lac.cas-R	CGAGATGAACGTCCCACCAA		10
		18	Lac.cas-P	FAM-TCTGGGCCTTGCTCACCG-BHQ1		5
	#7	19	Lac.cur-F	CCTTGTACATTTGCGAAGTCG	락토바실러스커바투스	10	파랑색
		20	Lac.cur-R1	ATTTGAGTTTAGCGATATGAA		10
		21	Lac.cur-P	JOE-AACGCAATGTTTTCTCGGCTTTT-BHQ1		5
	#32	94	IC-F	AAGGCAGCTATCAAGTAAGTGT	내부대조구	10	노랑색
		95	IC-R	GTTTCCCCTCAGACTCCTCC		10
		96	IC-P	Qua670-TTGCCCTTACAGAAAGTGAAGA-BHQ3		5
올리고혼합물 #5	#9	25	Lac.pla-F1	CGCGCCACAACCGGAACGAC	락토바실러스플란타럼	10	빨강색
		26	Lac.pla-R1	GGTTGCTTGATCAGTCCTGGTAA		10
		27	Lac.pla-P	FAM-CGGTTTAGGTGCAGCGGG-BHQ1		5
	#2	4	Lac.reu-F	AACCCAATCAGCTTAGTCGC	락토바실러스루테리	10	파랑색
		5	Lac.reu-R1	TCCTACAACCCCAACAAGCA		10
		6	Lac.reu-P	JOE-TCCCTTTTCGCTCGCCGCT-BHQ1		5
	#32	94	IC-F	AAGGCAGCTATCAAGTAAGTGT	내부대조구	10	노랑색
		95	IC-R	GTTTCCCCTCAGACTCCTCC		10
		96	IC-P	Qua670-TTGCCCTTACAGAAAGTGAAGA-BHQ3		5
올리고혼합물 #6	#8	22	Lac.fer-F	CTCGTTAATCCCTCCTGGTAA	락토바실러스퍼멘텀	10	빨강색
		23	Lac.fer-R	GACTAATCAAGGGTGGACACAA		10
		24	Lac.fer-P	FAM-ATCGGTTGGCTGGTGGTGCT-BHQ1		5
	#11	31	Lac.per-F1	GAGCTGACCACACCGAGAAA	락토바실러스페롤렌스	10	파랑색
		32	Lac.per-R1	CTCCTAGTGCCAAGGCATC		10
		33	Lac.per-P1	JOE-CCGTGCGCCCTTCTTCACT-BHQ1		5
	#32	94	IC-F	AAGGCAGCTATCAAGTAAGTGT	내부대조구	10	노랑색
		95	IC-R	GTTTCCCCTCAGACTCCTCC		10
		96	IC-P	Qua670-TTGCCCTTACAGAAAGTGAAGA-BHQ3		5
올리고혼합물 #7	#12	34	Lac.par-F2	ACGGCCTTTACCTGCATGAA	락토바실러스 파라카제이	10	빨강색
		35	Lac.par-R2	CCGACAGCCTGAACAATGGT		10
		36	Lac.par-P	FAM-CTGGCACGGAGCCAATCAG-BHQ1		5
	#32	94	IC-F	AAGGCAGCTATCAAGTAAGTGT	내부대조구	10	노랑색
		95	IC-R	GTTTCCCCTCAGACTCCTCC		10
		96	IC-P	Qua670-TTGCCCTTACAGAAAGTGAAGA-BHQ3		5

다중 실시간 중합효소연쇄반응물은 다음과 같은 조건으로 제조하였다; 5X qPCRMix (제노텍, 한국) 4㎕, 올리고 혼합물 1㎕, 1ng/㎕ DNA 1㎕, 증류수 14㎕를 첨가하여 총량이 20㎕가 되도록 하였다.

실시간 중합효소연쇄반응은 7500 Real-time PCR system (Applied Biosystems, USA) 장비를 사용하였고, 반응조건은 95℃에서 2분간 변성시킨 다음 95℃에서 30초, 55℃에서 40초 반응을 35회 반복 수행하였으며, 반응결과는 7500 software v2.3을 이용하여 확인하였다.

상기의 다중 실시간 중합효소연쇄반응 방법을 이용하였을 때, 각 프라이머 및 프로브 세트의 표적 종에만 증폭 곡선이 보이면서 ‘Ct’ 값이 측정되고, 표적 종을 제외한 나머지 종에는 어떤 증폭 곡선도 보이지 않으면서 ‘Ct’ 값 또한 측정되지 않는 것을 모두 확인함으로써 다중 PCR 반응에 동시 사용되는 프라이머 및 프로브 세트들 간에 간섭이 없이 단일 반응과 동일한 특이성을 가진다는 것을 확인하였다(표 6, 도 1). 측정된 Ct 값의 범위는 ‘17~25’임을 확인하였다.

표적 종명	균주번호 (KCTC)	올리고 혼합물
		#1	#2	#3	#4	#5	#6	#7
락토바실러스락티스	3636	X	○ (Ct22)	X	X	X	X	X
락토바실러스루테리	3594	X	X	X	X	○ (Ct22)	X	X
락토바실러스불가리쿠스	3635	X	○ (Ct22)	X	X	X	X	X
락토바실러스브레비스	3498	X	X	○ (Ct22)	X	X	X	X
락토바실러스살리바리우스	43133	○ (Ct18)	X	X	X	X	X	X
락토바실러스애시도필러스	3164	○ (Ct21)	X	X	X	X	X	X
락토바실러스카제이	3109	X	X	X	○ (Ct21)	X	X	X
락토바실러스커바투스	3767	X	X	X	○ (Ct17)	X	X	X
락토바실러스퍼멘텀	5049	X	X	X	X	X	○ (Ct20)	X
락토바실러스플란타럼	3108	X	X	X	X	○ (Ct21)	X	X
락토바실러스헬베티쿠스	15060	X	X	○ (Ct22)	X	X	X	X
락토바실러스페롤렌스	13107	X	X	X	X	X	○ (Ct19)	X
락토바실러스파라카제	3510	X	X	X	X	X	X	○ (Ct20)
락토바실러스크리스파투스	5054	X	○ (Ct22)	X	X	X	X	X
내부 대조구		○ (Ct24)	○ (Ct25)	○ (Ct24)	○ (Ct25)	○ (Ct24)	○ (Ct24)	○ (Ct24)

<110> National Agricultural Products Quality Management Service(NAQS) <120> Primer and probe set composition for identification of probiotic species in feed and kit comprising same <130> 21-11986 <160> 96 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.del-F <400> 1 cattgcaaag cgaccgagag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.del-R <400> 2 cggagacctc cggatcaaag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.del-P <400> 3 tgccttggca ctggaagcc 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.reu-F <400> 4 aacccaatca gcttagtcgc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.reu-R1 <400> 5 tcctacaacc ccaacaagca 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.reu-P <400> 6 tcccttttcg ctcgccgct 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.bre-F <400> 7 ccggtgagat aaccttcggg 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.bre-R <400> 8 acgcagttgt ttctcggttt aa 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.bre-P <400> 9 agtcagccgt ctaaggtggg 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.sal-F <400> 10 ggaaacctaa caggttttac cg 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.sal-R <400> 11 cttagtttgg gctcttcccg 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.sal-P <400> 12 cttagttgaa ggtagacgtg gg 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.aci-F <400> 13 gtatcggcgt ttgcatggac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.aci-R <400> 14 atcgtcaccg agcgctattt 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.aci-P <400> 15 tcgtgacacc gctcctgg 18 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.cas-F <400> 16 ggccggatgg tgaagatcaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.cas-R <400> 17 cgagatgaac gtcccaccaa 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.cas-P <400> 18 tctgggcctt gctcaccg 18 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.cur-F <400> 19 ccttgtacat ttgcgaagtc g 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.cur-R1 <400> 20 atttgagttt agcgatatga a 21 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.cur-P <400> 21 aacgcaatgt tttctcggct ttt 23 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.fer-F <400> 22 ctcgttaatc cctcctggta a 21 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.fer-R <400> 23 gactaatcaa gggtggacac aa 22 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.fer-P <400> 24 atcggttggc tggtggtgct 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.pla-F1 <400> 25 cgcgccacaa ccggaacgac 20 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.pla-R1 <400> 26 ggttgcttga tcagtcctgg taa 23 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.pla-P <400> 27 cggtttaggt gcagcggg 18 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.hel-F <400> 28 cggtgttggt ggaggatcaa 20 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.hel-R <400> 29 tggcagtaat tacccctgca a 21 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.hel-P <400> 30 ctactttaat ggttttaggt gcct 24 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.per-F1 <400> 31 gagctgacca caccgagaaa 20 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.per-R1 <400> 32 ctcctagtgc caaggcatc 19 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.per-P1 <400> 33 ccgtgcgccc ttcttcact 19 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.par-F2 <400> 34 acggccttta cctgcatgaa 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.par-R2 <400> 35 ccgacagcct gaacaatggt 20 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.par-P <400> 36 ctggcacgga gccaatcag 19 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.cri-F <400> 37 aattgcctaa cggcaaacgc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.cri-R <400> 38 cgtgtccaat gccaatcctg 20 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac.cri-P <400> 39 tggtactgca tttctaaggt attg 24 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bac.len-F <400> 40 tgcaagtcga gcgaatggat 20 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bac.len-R <400> 41 cgtctttcaa cctttctcca g 21 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bac.len-P <400> 42 tagcggcgga cgggtgag 18 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bac.lic-F <400> 43 atgtctacat cgctcagccg 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bac.lic-R <400> 44 cgtttcccaa agctgtgtcg 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bac.lic-P <400> 45 acaatgacca gcagctcgaa 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bac.sub-F <400> 46 tgacagtgat aggcactgcg 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bac.sub-R <400> 47 agcgcccagt aagaatcgag 20 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bac.sub-P <400> 48 agtcggaatc atgccgccg 19 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bac.coa-F <400> 49 aagaaacgat ggcgctggat 20 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bac.coa-R <400> 50 caaaatcgca catccggtaa t 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bac.coa-P <400> 51 catttatgat caggacggcg t 21 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bac.pum-F <400> 52 tggaagtctc cagcttaccg 20 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bac.pum-R <400> 53 tcgatagaat tttatctagt cgc 23 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bac.pum-P <400> 54 acgtttagga tcttccctct taa 23 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bif.lon-F <400> 55 ctcaacacca accccgatca 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bif.lon-R <400> 56 gcacgtgcat agttggaacc 20 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bif.lon-P <400> 57 ccggcgtggt gcttccat 18 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bif.bif-F <400> 58 cacgaccaat tccgagaccc 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bif.bif-R <400> 59 cacatgtcga tctcggcgta 20 <210> 60 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bif.bif-P <400> 60 tctgctgcgg tacgcgttc 19 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bif.the-F <400> 61 aaagccgccc aagaactaca 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bif.the-R <400> 62 ttcggggttt tgaggtcgag 20 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bif.the-P <400> 63 caaatgcgcg tcggcgaag 19 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bif.inf-F <400> 64 agaccgycga caagttgaat 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bif.inf-R <400> 65 tacaacgggc gataggaacg 20 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bif.inf-P <400> 66 ttcccgaatg ccgctgcca 19 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bif.pse-F <400> 67 gtgacatcgt caccaatgcg 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bif.pse-R <400> 68 gtccggatgg gtgttttcct 20 <210> 69 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bif.pse-P <400> 69 ccgcatgcag cgcgatcg 18 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ent-IPC-F1 <400> 70 ccttattgtt agttgccatc attc 24 <210> 71 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ent-IPC-R1 <400> 71 caggcgagtt gcagcctg 18 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ent-IPC-P <400> 72 ttagcctcgc gacttcgcaa 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ent.lac-F <400> 73 tgctaagacg atcggttggt 20 <210> 74 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ent.lac-R <400> 74 agagtagtaa aggttgccat ttca 24 <210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ent.lac-P <400> 75 ccccaatcat caacagcttc ca 22 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ped.aci-F <400> 76 catgcgggaa aacgaagacc 20 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ped.aci-R <400> 77 ccacttgtat tcttcaggat cca 23 <210> 78 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ped.aci-P <400> 78 cattggcgaa ttgattggtg gt 22 <210> 79 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ped.pen-F <400> 79 aaaaatcctt gccactcgct ac 22 <210> 80 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ped.pen-R <400> 80 agccagaact tacaccatca tc 22 <210> 81 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ped.pen-P <400> 81 agggcgatgg ttgctccgt 19 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clo.but-F990 <400> 82 atggaggaag ccacttccgt 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clo.but-R1206 <400> 83 tctcgcgagg ttgcatcaca 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clo.but-P999 <400> 84 acaggtggtg catggttgtc 20 <210> 85 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sac.cer-F <400> 85 gtttctttct tgctattcca atcg 24 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sac.cer-R <400> 86 tgtttgttac ctctggggcc 20 <210> 87 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sac.cer-P <400> 87 agatttctgt gcttttgtta tagga 25 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Xan.den-F <400> 88 ataccggggt gttctgtcct 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Xan.den-R <400> 89 gcgagaacca agagatccgt 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Xan.den-P <400> 90 cggacggagc gccctactct 20 <210> 91 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pic.far-F <400> 91 atttggacgt aattcttctg gtat 24 <210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pic.far-R <400> 92 ataaattgaa gttaggttgt cctc 24 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pic.far-P <400> 93 ttgcgcggcg agtgctatta 20 <210> 94 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC-F <400> 94 aaggcagcta tcaagtaagt gt 22 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC-R <400> 95 gtttcccctc agactcctcc 20 <210> 96 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IC-P <400> 96 ttgcccttac agaaagtgaa ga 22

Claims (7)

1. 서열번호 1 내지 3; 서열번호 4 내지 6; 서열번호 7 내지 9; 서열번호 10 내지 12; 서열번호 13 내지 15; 서열번호 16 내지 18; 서열번호 19 내지 21; 서열번호 22 내지 24; 서열번호 25 내지 27; 서열번호 28 내지 30; 서열번호 31 내지 33; 서열번호 34 내지 36; 서열번호 37 내지 39; 서열번호 40 내지 42; 서열번호 43 내지 45; 서열번호 46 내지 48; 서열번호 49 내지 51; 서열번호 52 내지 54; 서열번호 55 내지 57; 서열번호 58 내지 60; 서열번호 61 내지 63; 서열번호 64 내지 66; 서열번호 67 내지 69; 서열번호 70 내지 72; 서열번호 73 내지 75; 서열번호 76 내지 78; 서열번호 79 내지 81; 서열번호 82 내지 84; 서열번호 85 내지 87; 서열번호 88 내지 90; 및 서열번호 91 내지 93; 의 서열을 갖는 프라미어 및 프로브 세트를 모두 포함하는 사료 생균제 종 판별용 프라이머 및 프로브 세트 조성물로서,
   서열번호 1 내지 3은 락토바실러스 락티스(Lactobaillus delbrueckii subsp. Lactis) 또는 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobaillus delbrueckii subsp. Bulgaricus),
   서열번호 4 내지 6은 락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri),
   서열번호 7 내지 9는 락토바실러스 브레비스(Levilactobacillus brevis),
   서열번호 10 내지 12는 락토바실러스 살리바리우스(Ligilactobacillus salivarius),
   서열번호 13 내지 15는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus),
   서열번호 16 내지 18은 락토바실러스 카제이(Lacticaseibacillus casei),
   서열번호 19 내지 21은 락토바실러스 커바투스(Latilactobacillus curvatus),
   서열번호 22 내지 24는 락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum),
   서열번호 25 내지 27은 락토바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum subsp. Plantarum),
   서열번호 28 내지 30은 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus),
   서열번호 31 내지 33은 락토바실러스 페롤렌스(Schleiferilactobacillus perolens),
   서열번호 34 내지 36은 락토바실러스 파라카제이(Lacticaseibacillus paracasei subsp. Paracasei),
   서열번호 37 내지 39는 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus),
   서열번호 40 내지 42는 바실러스 렌투스(Bacillus lentus),
   서열번호 43 내지 45는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis),
   서열번호 46 내지 48은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis),
   서열번호 49 내지 51은 바실러스 코아글란스(Bacillus coagulans),
   서열번호 52 내지 54는 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus),
   서열번호 55 내지 57은 비피토박테리움 롱검(Bifidobacterium longum subsp. Longum),
   서열번호 58 내지 60은 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum),
   서열번호 61 내지 63은 비피도박테리움 서모필럼(Bifidobacterium thermophyllum),
   서열번호 64 내지 66은 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium longum subsp. Infantis),
   서열번호 67 내지 69는 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum subsp. Pseudolongum),
   서열번호 70 내지 72는 엔테로코커스 락티스(Enterococcus lactis) 또는 엔테로코커스 훼시엄(Enterococcus faecium),
   서열번호 73 내지 75는 엔테로코커스 락티스(Enterococcus lactis),
   서열번호 76 내지 78은 페디오코커스 에시디락티스(Pediococcus acidilactici),
   서열번호 79 내지 81은 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus),
   서열번호 82 내지 84는 클로스트리듐 브티리컴(Clostridium butyricum),
   서열번호 85 내지 87은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae),
   서열번호 88 내지 90은 잔토필로마이세스 덴드로하우스(Xanthophyllomyces dendrorhous),
   서열번호 91 내지 93은 피키아 파리노사(Pichia farinosa var. farinosa)를 판별하는 것을 특징으로 하는 사료 생균제 종 판별용 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 및 프로브 세트 조성물은 서열번호 94 내지 96을 포함하는 대조구 프라이머 및 프로브 세트를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 생균제 종 판별용 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 및 프로브 세트 조성물은 단일 또는 다중 실시간 중합효소연쇄반응에서 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 사료 생균제 종 판별용 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
6. 제1항, 제4항 또는 제5항의 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 포함하는 사료 생균제 종 판별용 키트.
7. 제1항, 제4항 또는 제5항의 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 이용하여 사료 생균제 종을 판별하는 방법.

Images