CN103421906B - 检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物和方法。特别地，本发明还涉及在多重PCR扩增后，利用DHPLC对多重PCR扩增产物进行检测的方法。使用本发明，能够简便、快速、灵敏度高且特异性强地测定金黄色葡萄球菌耐药性。

Description

检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物和方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物、使用该组合物进行的检测方法及该组合物在实际样品检测中的应用。

背景技术

葡萄球菌属(Staphylococcus)至少包括有20个种，其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人类的一种重要病原菌，引起许多严重感染。典型的金黄色葡萄球菌为球形，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。

金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长pH7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10%-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。在干燥环境中存活数月；空气中存在，但不繁殖。耐热性强，70℃加热1h，80℃加热30min不被杀死；耐低温，在冷冻食品中不易死亡；耐高渗，在含有50%-66%蔗糖或15%以上食盐食品中才可被抑制，能在15%NaCl和40%胆汁中生长。

金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因此，食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。

金黄色葡萄球菌是院内感染的常见病原菌之一，在自然界中分布广泛，可引起全身性感染及食物中毒。随着抗菌药物的广泛使用，耐药菌株的检出率逐年增高，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现，其多重耐药性增加了抗感染治疗的难度，在世界范围内引起广泛关注。有研究报道，金黄色葡萄球菌产生的耐药性主要是由细菌的耐药基因导致的。耐药基因的传播是耐药菌株产生的重要原因。对金黄色葡萄球菌的耐药基因进行检测，对控制感染性疾病的发生，指导临床合理使用抗菌药物具有重要意义。

面对日趋严重的细菌耐药问题，为了维护人们的正常生活及控制金黄色葡萄球菌引起的疾病，国内外许多学者采用了多种手段对金黄色葡萄球菌耐药基因进行研究，常用的方法有药敏试验、PCR、荧光PCR、K-B法等。由于金黄色葡萄球菌中含有的耐药基因易受种及来源等因素的影响，成分相对复杂；尤其是近年来随着抗菌药物的广泛应用，使许多单一检测耐药基因的传统方法不再快速、有效。

现代生物技术以其方便、准确、迅速、简洁的特点，从基因水平分析菌株的耐药性和耐药机制，灵敏度更高、特异性更强，其结果为证明菌株的耐药性提供了真实、可靠的依据，给菌种鉴别、菌种耐药性研究等菌株相关研究注入了新鲜血液，已成为近年来世界各国的许多机构和学者致力的研究方向。

聚合酶链式反应(PCR)是通过扩增待测样品的DNA，使其能够从最初的微小数量增至足以达到检测限量的巨大数量。PCR方法已用于多种多样的基因检测中。近几年，在分子生物学研究中，利用定量PCR对基因表达结果进行检测，获得了应用。由于其大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性、并能有效地减少实验过程中产生污染的危险，目前已广泛应用于各个领域。

多重PCR(multiplex PCR)是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR反应相同。其特点有：①高效性，在同一PCR反应管内同时检测多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体。②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测。③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支。

变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquidchromatography，DHPLC)具有高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等优点。与传统的SSCP(单链构象多态性)分析、DGGE(变性梯度凝胶电泳)等方法相比，DHPLC有较多的优点。SSCP的结果受血样质量、提取方法等因素的影响，并且需要跑胶、电泳；DGGE则需要标记引物，存在放射性污染，这两种方法都比较费时费力。而DHPLC则高度自动化，可以自动取样，检测每个样品只需要8分钟左右。

目前，国内外少见报道能快速、简单、特异且灵敏地检测金黄色葡萄球菌对抗生素耐药性的方法。

因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的金黄色葡萄球菌耐药性检测方法，进行金黄色葡萄球菌耐药性的检测。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物。

本发明的另一个目的在于，提供检测金黄色葡萄球菌耐药性的检测方法。

针对上述目的，本发明提供了以下技术方案。

一方面，本发明提供了用于检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物，所述组合物包含金黄色葡萄球菌热稳定核酶基因nuc(heat stable nuelease)的特异性引物对以及针对以下六种耐药基因中一种或多种的特异性引物对：甲氧西林耐药基因mecA、氨基糖苷类耐药基因aacA-aphD、红霉素耐药基因ermA和ermC、四环素耐药基因tetK和tetM。

在一个实施方式中，金黄色葡萄球菌特异性nuc基因的特异性引物对为：

nuc-F：GGT CCT ACT TTT TCC CTA CTA GTT G(SEQ ID No.1)、

nuc-R：AAG ATC TTC AGA ACC ACT TCT ATT A(SEQ ID No.2)，

扩增产物为122bp；

氨基糖苷类耐药基因aacA-aphD的特异性引物对为：

aacA-aphD-F：TAT TGC ATG AGC AAT AAG GGC(SEQ ID No.3)、

aacA-aphD-R：CGG ACA CTA TCA TAA CCA CTA(SEQ ID No.4)，

扩增产物为227bp；

红霉素耐药基因ermA的特异性引物对为：

ermA-F：ACG CGG TAA ACC GCT CTG A(SEQ ID No.5)、

ermA-R：TCC GCA AAT CCC ATC TCA AC(SEQ ID No.6)，

扩增产物为190bp；

红霉素耐药基因ermC的特异性引物对为：

ermC-F：GGT CGT CTA TTC CTG CAT GT(SEQ ID No.7)、

ermC-R：TCC TCG TCG AAT ACG GGT TTG(SEQ ID No.8)，

扩增产物为299bp；

四环素耐药基因tetK的特异性引物对为：

tetK-F：TA GGCG ACA ATA GGTGCT AGT(SEQ ID No.9)、

tetK-R：GCTGTG ACA ATA AAC CTC CTA(SEQ ID No.10)，

扩增产物为360bp；

四环素耐药基因tetM的特异性引物对为：

tetM-F：GAT AGA GCG ATT ACA GAC(SEQ ID No.11)、

tetM-R：GTA ATC TCC TGG CGT GTC TG(SEQ ID No.12)，

扩增产物为158bp；

甲氧西林耐药基因mecA的特异性引物对为：

mecA-F：GGACCCTCAAACAGGTGAAT(SEQ ID No.13)、

mecA-R：TTGCTTGTAACCACCCCAAG(SEQ ID No.14)，

扩增产物为280bp。

一方面，本发明提供了通过多重PCR方法检测金黄色葡萄球菌耐药性的试剂盒，所述试剂盒包括本发明用于检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物。

再一方面，本发明提供了检测金黄色葡萄球菌耐药性的方法，所述方法包括使用本发明用于检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物或试剂盒进行多重PCR扩增的步骤。

在一个实施方式中，多重PCR反应25μL体系包含：10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)10μL；dNTPs终浓度为400μmol/L；Taq DNA聚合酶1U；DNA模板2μL；SEQ ID No.1-14引物终浓度均为20pmol/L，余量以去离子水补足。

在一个实施方式中，多重PCR扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；循环完成后72℃充分延伸10min。扩增产物可以于4℃保存。

在本发明的一个实施方式中，所述检测方法包括在多重PCR扩增步骤之后，通过DHPLC对扩增产物进行检测的步骤。

在本发明的一个实施方式中，所述多重PCR扩增产物通过DHPLC检测。所使用的仪器可以为，例如Transgenomic公司的DNA-99-3510色谱柱，检测器为紫外检测器。

将多重PCR产物放进DHPLC进样室，检测条件为：设置双链DNA多片段分析模式，检测范围为100-700bp，检测起始时间为0.5min，检测结束时间为15min，流动相：A液(0.1mol/L TEAA，即三乙基胺醋酸盐)为60％，B液(含25％乙腈的0.0mol/L TEAA)为40％，柱温为60℃，上样量为5μL，流速为0.9ml/min。

通过DHPLC检测方法对PCR扩增产物进行检测是一种新型的基因检测技术，利用样品分子通过固定相亲和力的差异，在用流动相进行洗脱时，不同大小或不同序列的核酸片段在固定相上的移动速率不同达到分离的目的。可以代替传统的凝胶电泳分析，检测结果直观可以根据峰图直接判定检测结果而不需要使用溴化乙锭，并且比凝胶电泳检测的灵敏度高，一次可以同时自动化分析几百个样品，实现金黄色葡萄球耐药性的高通量检测。

再一方面，本发明提供了本发明用于检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物或试剂盒在检测金黄色葡萄球菌耐药性中的应用。

本发明的多重PCR检测方法采用一管同时检测，无需多步PCR处理，节省了时间。本发明的方法巧妙地运用了多重PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性强的特点及DHPLC检测技术的快速、简便、高通量的特点。具有操作简单、省时省力和结果可靠等优点。使用本发明的多重PCR和DHPLC检测方法，其简单、快速且高通量的特点适合用于金黄色葡萄球菌耐药性的检测。

附图说明

图1是金黄色葡萄球菌特异基因nuc的PCR扩增产物凝胶电泳检测结果，其中，1和2均为金黄色葡萄球22011和22015的PCR产物，3-10依次为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)22036、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaparophytics)22007，伤寒沙门菌(Salmonella typhi)10593、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)22203、大肠杆菌O157(E.coli)10102、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)12310、志贺菌(Shigella)11307、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)10908的PCR产物，C为空白对照，M为50bp标记。

图2是金黄色葡萄球菌特异基因和耐药基因的多重PCR产物凝胶电泳检测结果，其中，1和2均为tetK、ermC、mecA、aac-aphD、ermA、tetM、nuc基因7重PCR产物，C为空白对照，M为50bp标记。

图3是金黄色葡萄球菌特异基因及耐药基因的多重PCR产物用DHPLC方法的检测结果，其中1：nuc，2：tetM，3：ermA，4：acca-aphD，5：mecA，6：ermC，7：tetK。

图4是金黄色葡萄球菌耐药基因的7重PCR-DHPLC灵敏度检测结果，a是DNA浓度为2ⅹ10¹μg/μL，b：2μg/μL，c：2ⅹ10^-1μg/μL，d：2ⅹ10^-2μg/μL，e：2ⅹ10^-3μg/μL。

图5为20株金黄色葡萄球菌食品分离菌株的检测结果，其中1是nuc基因，2为tetM基因，3是aacA-aphD基因。

具体实施方式

通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不局限于以下实施例。

实施例1

本实施例选取金黄色葡萄球菌22011、22015，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)22036、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaparophytics)22007，伤寒沙门菌(Salmonella typhi)10593、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)22203、大肠杆菌O157(E.coli)10102、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)12310、志贺菌(Shigella)11307、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)10908食品中常见的病原菌的基因组DNA扩增，验证nuc引物的特异性。本实施例中使用的菌株菌来自中国检科院食品安全微生物菌种保藏管理中心。本实施例中所使用的用于检测金黄色葡萄球菌特异性基因nuc的引物序列为：

nuc-F：GGTCCT A CT TTT TCC CTA CTA GTT G(SEQ ID No.1)

nuc-R：AAG ATC TTC AGA ACC ACT TCT ATT A(SEQ ID No.2)

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

所使用的主要检测仪器：微量移液器(10μL、100μL、1000μL，Eppendorf)，PCR仪(ABI VERITI96Well Applied Biosystems，USA)，高速台式离心机(Pico17Thermo)等。

检测步骤为：

1)DNA提取

按照Wizard Genomic DNA纯化试剂盒(Promega，美国)的操作说明提取上述菌株的基因组DNA，并将各DNA终浓度调整为20μg/μL。

2)PCR扩增

利用宝生物的PCR扩增试剂盒(TaKaRa,日本)进行PCR扩增。PCR反应体系50μL：10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)10μL；dNTPs终浓度400μmol/L；TaqDNA聚合酶1U；步骤1)获得的基因组DNA2μL作为模板；引物SEQ IDNos.1和2的终浓度均为20pmol/L，余量为去离子水。

SEQ No.s1和2扩增nuc基因。

扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；循环完成后72℃充分延伸10min。扩增产物4℃保存。

3)电泳检测

将PCR扩增产物用3％凝胶电泳进行检测，检测结果如图1所示。在122bp处只有金黄色葡萄球菌的DNA模板扩增出清晰明亮的目的条带，其余菌株未扩增出目的条带，且空白对照无污染，说明引物SEQ No.s1和2对金黄色葡萄球菌具有特异性。

实施例2

本实施例为通过GenBank获得金黄色葡萄球菌基因nuc、甲氧西林耐药基因mecA、氨基糖苷类耐药基因aacA-aphD、红霉素耐药基因ermA和ermC、四环素耐药基因tetK和tetM序列，设计了针对各个基因的引物序列，建立了金黄色葡萄球菌特异基因及耐药基因的多重PCR检测方法。

本实施例中所使用的用于检测金黄色葡萄球菌特异性及耐药基因的引物序列为：

nuc-F：GGT CCT ACT TTT TCC CTA CTA GTT G(SEQ ID No.1)

nuc-R：AAG ATC TTC AGA ACC ACT TCT ATT A(SEQ ID No.2)

aacA-aphD-F：TAT TGC ATG AGC AAT AAG GGC(SEQ ID No.3)

aacA-aphD-R：CGG ACA CTA TCA TAA CCA CTA(SEQ ID No.4)

ermA-F：ACG CGG TAA ACC GCT CTG A(SEQ ID No.5)

ermA-R：TCC GCA AAT CCC ATC TCA AC(SEQ ID No.6)

ermC-F：GGT CGT CTA TTC CTG CAT GT(SEQ ID No.7)

ermC-R：TCC TCG TCG AAT ACG GGT TTG(SEQ ID No.8)

tetK-F：TA GGCG ACA ATA GGTGCT AGT(SEQ ID No.9)

tetK-R：GCTGTG ACA ATA AAC CTC CTA(SEQ ID No.10)

tetM-F：GAT AGA GCG ATT ACA GAC(SEQ ID No.11)

tetM-R：GTA ATC TCC TGG CGT GTC TG(SEQ ID No.12)

mecA-F：GGACCCTCAAACAGGTGAAT(SEQ ID No.13)

mecA-R：TTGCTTGTAACCACCCCAAG(SEQ ID No.14)。

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

所使用的主要检测仪器：微量移液器(10μL、100μL、1000μL，Eppendorf)，PCR仪(ABI VERITI96Well Applied Biosystems，USA)，高速台式离心机(Pico17Thermo)，变性高效液相色谱仪(DHPLC-4500)等。

检测步骤为：

1)DNA提取

实验使用的金黄色葡萄球菌菌株均来自中国检科院食品安全微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为：22011(用于扩增nuc基因)，22012(用于扩增ermC基因)，22015(用于扩增accA-aphD基因)，22024(用于扩增tetK基因)，22039(用于扩增tetM基因)，22044(用于扩增mecA基因)，22069(用于扩增ermA基因)。按照Wizard Genomic DNA纯化试剂盒(Promega，美国)的操作说明提取上述金黄色葡萄球菌菌株的基因组DNA，并将各DNA终浓度调整为20μg/μL。

2)PCR扩增

利用宝生物的PCR扩增试剂盒(TaKaRa,日本)进行PCR扩增。PCR反应体系50μL：10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)10μL；dNTPs终浓度400μmol/L；TaqDNA聚合酶1U；步骤1)获得的基因组DNA2μL作为模板；引物终浓度均为20pmol/L，余量为去离子水。

其中，用22011基因组DNA、SEQ No.s1和2扩增nuc基因；用22012基因组DNA、SEQ No.s7和8扩增ermC基因；用22015基因组DNA、SEQNo.s3和4扩增accA-aphD基因；用22024基因组DNA、SEQ No.s9和10扩增tetK基因；用22039基因组DNA、SEQ No.s11和12扩增tetM基因；用22044基因组DNA、SEQ No.s13和14扩增mecA基因；用22069基因组DNA、SEQ No.s5和6扩增ermA基因。

扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；循环完成后72℃充分延伸10min。扩增产物4℃保存。

3)PCR产物纯化及多重PCR扩增

按照Wizard Gel Extraction试剂盒(Promega，美国)的操作说明对上述PCR产物进行纯化、回收。按TaKaRa pMD19-T Vector试剂盒(TaKaRa，日本)的说明书将回收的纯化产物与pMD19-T Vector连接，连接体系10μL：pMD19-TVector1μL、PCR产物2μL、ddH₂O2μL、Solution I5μL，同时设置阳性和阴性对照。将连接体系置于室温(22-37℃)反应30min，反应结束后，立即置于冰上。加连接产物(10μL)于50μL TOP感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃准确热激90s，立即置于冰上2min，然后加入800μL已灭过菌的脑心浸液(北京陆桥技术有限责任公司)，37℃、200r/min振荡培养1h。5000r/min低速离心1min，弃600μL上清，将沉淀混匀，取200μL混合液涂于Amp+、X-Gal和IPTG处理的营养琼脂平板上，37℃过夜培养后置于4℃冰箱中4h。挑取单菌落白斑，在含有终浓度200μg/mL的Amp的脑心浸液中在37℃、200r/min振荡过夜培养。

阳性克隆鉴定：挑取单个白色克隆，利用宝生物的PCR扩增试剂盒(TaKaRa,日本)进行菌落PCR反应，体系为25μL：反应10×缓冲液(含Mg²⁺)2.5μL、dNTPs1μL、上下游引物各0.5μL、Taq酶0.2μL，挑取单菌落作为模板，加去离子水补至25μL。扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，退火温度为55℃30s，72℃延伸45s，30个循环；循环完成后72℃，10min充分延伸。扩增产物进行凝胶电泳验证对应的菌株是否为阳性。

质粒DNA提取：将鉴定为阳性的菌液用天根生化科技的质粒DNA提取试剂盒进行质粒DNA的提取，获得分别含有nuc、aacA-aphD、ermA、ermC、tetK、tetM和mecA扩增片段的阳性质粒DNA。

将将以上获得的阳性质粒DNA按1:1:1:1:1:1:1制备成混合模板备用。

多重PCR扩增：采用25μL扩增体系：10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)10μL；dNTPs终浓度400μmol/L；Taq DNA聚合酶1U；质粒DNA混合模板2μL；SEQ ID Nos.1-14引物终浓度均为20pmol；余量为去离子水。扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃，10min充分延伸。

4)电泳检测

将多重PCR扩增产物用3％凝胶电泳进行检测，检测结果如图2所示。在360bp，299bp，280bp，227bp，190bp，158bp和122bp扩增出清晰明亮的目的条带，这说明多重PCR可以同时扩增出金黄色葡萄球菌热稳定核酶基因nuc、甲氧西林耐药基因mecA、氨基糖苷类耐药基因aacA-aphD、红霉素耐药基因ermA和ermC、四环素耐药基因tetK和tetM序列，空白对照无污染。

实施例3：利用DHPLC检测多重PCR扩增产物

DHPLC检测使用Transgenomic公司的变性高效液相色谱仪(DHPLC-4500)，色谱柱为DNA-99-3510，检测器为紫外检测器。

将实施例2的多重PCR产物放进DHPLC进样室，检测条件为：设置双链DNA多片段分析模式，检测范围为100-700bp，检测起始时间为0.5min，检测结束时间为15min，流动相：A液(0.1mol/L TEAA，即三乙基胺醋酸盐为60％，B液(含25％乙腈的0.0mol/L TEAA)为40％，柱温为60℃，上样量为5μL，流速为0.9ml/min。

如图3所示，7对引物分别在特定位置出现阳性吸收峰，而空白对照仅出现洗脱峰。

实施例4

本实施例为通过如下试验对金黄色葡萄球菌多重PCR-DHPLC方法进行了灵敏度验证。

检测金黄色葡萄球菌特异基因及耐药基因多重PCR-DHPLC灵敏度的反应体系为(25μL)：10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)10μL；dNTPs终浓度400μmol/L；Taq DNA聚合酶1U；DNA模板2μL，SEQ ID Nos.1-14引物终浓度均为20pmol；余量为去离子水。

注：每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)。

扩增条件为：95℃预变性10min，95℃变性30s，退火温度为55℃30s，72℃延伸45s、30个循环、循环完成后72℃，10min充分延伸。

注：不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。

为更加快速且灵敏的测定金黄色葡萄球菌特异基因及耐药基因多重PCR的绝对检测限，将实施例2中步骤3)制备的混合DNA模板用无菌水分别稀释为20ng/μL、2ng/μL、200pg/μL、20pg/μL、2pg/μL的浓度作为模板，分别按上述条件进行多重PCR扩增。

然后，将扩增产物放入进样室，自动进样，上样量5μL，柱温50℃，流动相流速0.9mL/min；根据扩增产物碱基长度，设置双链DNA多片段分析模式，检测范围为100-700bp，清洗模式采用active。

如图4所示。金黄色葡萄球菌DNA浓度为20ng/μL、2ng/μL、200pg/μL、20pg/μL时有7个信号峰，而浓度降至2pg/μL以下时，少于7个信号峰。实验结果表明建立的多重PCR-DHPLC检测方法能够检出金黄色葡萄球菌特异性及耐药基因的含量为2pg/μL，而空白对照仅出现洗脱峰，说明PCR反应体系未污染。

实施例5

本发明的发明人通过如下试验对分离菌株进行了检测验证。

选取20株金黄色葡萄球菌分离菌株，表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌，伤寒沙门菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157各2株按照上述多重PCR体系和条件进行实时多重PCR-DHPLC检测，以确定所建立的多重PCR-DHPLC方法是否具有可行性。

结果如图5所示，20株金黄色葡萄球菌分离菌株均能检出nuc基因，2株菌检出tetM基因，2株菌检出aacA-aphD基因；表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌，伤寒沙门菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157不能检出nuc基因，这些菌株中也未能检测出耐药相关基因。表明该方法能有效检测出金黄色葡萄球菌的特异基因和耐药基因。

Claims (4)

1.利用多重PCR方法检测金黄色葡萄球菌耐药性的组合物，所述组合物包含：

nuc特异性引物对：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；以及

以下耐药基因特异性引物对中的一对或多对：

aacA-aphD特异性引物对：SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；

ermA特异性引物对：SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；

ermC特异性引物对：SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；

tetK特异性引物对：SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；

tetM特异性引物对：SEQ ID No.11和SEQ ID No.12；和

mecA特异性引物对：SEQ ID No.13和SEQ ID No.14。

2.用于通过多重PCR方法检测金黄色葡萄球菌耐药性的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的组合物。

3.权利要求1的组合物在制备用于通过多重PCR检测金黄色葡萄球菌耐药性的试剂盒中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述试剂盒还包括用于在多重PCR扩增步骤之后，通过DHPLC对扩增产物进行检测的物质。