CN101240347A - 检测芯片的制备方法及利用该芯片检测病原体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测芯片的制备方法，包括以下步骤：1)设计细菌的寡核苷酸探针；2)芯片制备。本发明还同时公开了利用上述检测芯片检测多个食品样本中病原体的方法，包括以下步骤：1)设计引物；2)待测样品中DNA的提取，得提取液；3)靶基因的多重PCR扩增；4)芯片杂交检测；5)杂交结果的检测与分析。本发明的检测方法步骤简洁、易于操作，且检测结果正确率高。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测技术，尤其是乳与乳制品中病原微生物的核酸检测技术；特别是涉及一种可同时检测12个食品样本中病原体的方法及所用芯片。
背景技术
食源性病原菌常造成群发性的伤害，给人们的身体健康及生命财产造成了一定的危害。据世界卫生组织(WHO)不完全统计报告，2000年全球有210万人死于腹泻，大部分归因于食物和饮用水中致病菌的污染。据国家卫生部统计，2000年共收到重大食物报告达150起，导致6237人中毒、135人死亡；2001年共发生重大食物中毒事件185起，导致15715人中毒，146人死亡。
判断是否为细菌性食源性疾病的依据主要包括流行病学调查、病人的潜伏期和特有的中毒表现以及实验室诊断，而实验室诊断能最终能确定食源性疾病的病因；所以针对食品中病原微生物进行快速检测，能用于解决控制食品质量以及保证食品安全等这些当今的主要问题。随着社会生产力的发展和人类社会的不断进步，食品中病原微生物的检测出现了一些新的问题和挑战，各国和各地区政府以及相关的国际机构都出台了相应的食品检测控制模式，随之出现了很多与之相对应的食品安全检测新技术和新方法。病原体检测技术一直是国内和国际上研究的热点，也是食品安全监管体系的重要组成部分。
传统的乳与乳制品的微生物检测采用国家标准规定的检测方法，就是将含病原菌的乳制品涂平板，然后用培养基培养到一定程度后，在电镜、显微镜下观察，根据菌落的颜色、形态等生化指标进行分辨。该方法优点是成本低，曾一度被认为是微生物检测的经典方法，是后来各种检测方法的基础平台，在各个国家均被认可，但缺点也很明显，首先时间上需要很长时间，一般为2-7天；对一些表型特征变异的菌株，用传统的形态学经验很难辨别，受主观的经验影响较大。
免疫学方法中最常用的是Elisa、免疫沉淀和抗体印迹等方法，其优点是可以通过酶联的方法将信号放大，从而检测到微量的病原体。然而免疫法依赖抗原抗体的特异性反应来检测目的样本中的病原体，因此，实验的灵敏度很大程度上依赖于抗体的好坏：一方面，制作抗体是一个耗时耗力的工作，而且即使抗体制作的再好，也会由于抗原表面决定簇类似的原因，使结果出现交叉反应；另一方面，有些病原变异极快，如禽流感病毒，存在很多的亚型，并且经常变异，从而使抗体失效，不能检测新的抗原。由于免疫法是基于抗原抗体反应的，因而，在前期样品处理过程也较为麻烦，为了检测不同的病原菌，需要用不同的处理方法，而且不同pH值、不同浓度、不同状态的样本都会对结果产生较大的影响。在灵敏度方面也存在一个极限，一旦低于这个极限，免疫法就难以检测。
自从PCR技术于1985年发明以来，由于其高度敏感性、特异性等特点使其在食品微生物检测中得到了广泛应用，而且由此衍生出了多种方法进行检测。现在经常应用的有实时荧光定量PCR、免疫PCR、反转录PCR和多重PCR等，它们都是针对食品中病原菌的特异性靶基因(通常是致病基因)进行检测，而集保守性和可变性于一体的23S rRNA基因几乎存在于所有细菌中，真细菌的16S rRNA和23S rRNA保守性非常强，被称之为“细菌进化的活化石”。但这种保守性也是相对的，也就是说在16S rRNA和23S rRNA序列上存在着每种细菌特异性片段，这也为细菌的检测提供了理论依据；另外16S～23S区间序列的扩增也可以鉴别出16S不能鉴别的、非常接近的菌种和种内细菌之间的鉴别。如近期由中国检验检疫科学研究院研究成功的《猪链球菌多重PCR检测方法》在北京通过了专家鉴定。该方法将检测猪链球菌的时间从过去的4天减少到了4小时。并首次建立了具有自主知识产权的猪链球菌16S核糖体、荚膜多糖(CPS)的特异性引物。然而由于PCR反应非常灵敏，容易因污染而导致假阳性结果。并且，每次PCR或real time PCR只能对1种基因成分进行检测，效率低，周期长。
基因芯片具有高通量检测的优点，仅靠一个实验就能检测出大量的未知菌，所以基因芯片技术在微生物研究领域的成功经验为其应用于食品微生物特别是致病菌的检测打下了基础。目前也已经有部分用于食品检测的芯片，然而，这些芯片也有以下一些缺点和不足：1、虽然能做到高通量检测病原，但一般一张芯片只能检测一种样本的所有病原体；2、荧光标记目前一般有两种，一种是在扩增的同时加入Cy-dCTP，但由于Cy是一个大分子，空间位阻较大，因此在链延伸过程中不容易结合上去；另一种方法是先合成带荧光基团的引物，这种方法也具有较大的缺点：首先，带荧光的引物不易保存，放久了就会发生荧光淬灭；其次，合成带荧光的引物价格较贵，而且扩增不同的基因就需要不同的引物，就需要合成许多带荧光的引物；最后，由于引物带有荧光，一旦纯化，或洗涤步骤未做好，则结果中会出现假阳性，或者背景信号局部很高等情况。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测芯片的制备方法及利用该芯片检测病原体的方法，该检测方法步骤简洁、易于操作，且检测结果正确率高。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)、设计细菌的寡核苷酸探针：
每种细菌至少含两条探针，各探针利用常规软件进行设计，每条探针均必须符合以下条件：长度为50～60mer，Tm值差异在5度之内，各探针内部发夹结构≤5个、GC含量为40％～55％、重复的单一碱基的连续≤5个，分子最稳定的二级结构配对碱基长度少于6bp；
2)、芯片制备：
将步骤1)所得的探针与Corning print buffer等体积比混合后，利用点样仪点制芯片；将所得的芯片在预杂交液进行预杂交，再清洗、干燥后；得检测芯片。
作为本发明的检测芯片的制备方法的改进：大肠菌群的探针为SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：4中的任意一种；乳酸菌的探针为SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：8中的任意一种；沙门氏菌的探针为SEQ ID NO：9～SEQ ID NO：13中的任意一种；志贺氏菌的探针为SEQ IDNO：14～SEQ ID NO：15中的任意一种；金黄色葡萄球菌的探针为SEQ ID NO：16～SEQID NO：20中的任意一种；霉菌的探针为SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：24中的任意一种；酵母的探针为SEQ ID NO：25～SEQ ID NO：28中的任意一种。
作为本发明的检测芯片的制备方法的进一步改进：步骤2)中的预杂交液由20×SSC100ml、10％SDS 4ml、10％BSA 40ml和dd H2O 276ml组成。
本发明还同时提供了利用上述方法制备的芯片检测多个食品样本中病原体的方法，包括以下步骤：
1)、设计引物：
从数据库中获得上述每种细菌的基因组序列，然后利用常规软件设计对应每种细菌的引物；每对引物均需符合以下条件：使扩增产物在200bp左右，引物与引物之间配对碱基长度少于6bp；CG含量为40～55％；Tm差异在5℃之内；
2)、待测样品中DNA的提取，得提取液；
3)、靶基因的多重PCR扩增：
将步骤2)的提取液做为PCR模板，分别利用步骤1)所得的引物进行多重PCR扩增；得扩增产物；
4)、芯片杂交检测：
先利用荧光染料标记扩增产物；再将上述标记后的扩增产物与芯片杂交；
5)、杂交结果的检测与分析：
用扫描仪扫描上述杂交后的芯片，利用常规软件对结果进行分析。
作为本发明的检测多个食品样本中病原体的方法的改进：大肠杆菌的引物对为SEQ IDNO：29～SEQ ID NO：36这4对引物中的任意一对；乳酸菌的引物对为SEQ ID NO：37～SEQ ID NO：44这4对引物中的任意一对；沙门氏菌的引物对为SEQ ID NO：45～SEQ IDNO：54这5对引物中的任意一对；志贺氏菌的引物对为SEQ ID NO：55～SEQ ID NO：58这2对引物中的任意一对；金黄色葡萄球菌的引物对为SEQ ID NO：59～SEQ ID NO：68这5对引物中的任意一对；霉菌的引物对为SEQ ID NO：69～SEQ ID NO：76这4对引物中的任意一对；酵母的引物对为SEQ ID NO：77～SEQ ID NO：84这4对引物中的任意一对。
在本发明的检测芯片的制备方法中，利用Arraydesigner4.2软件进行设计所得的各探针序列具体如表1所示：
表1、探针序列
| 大肠菌群 | |
| coli1(SEQ ID NO：1) | 5-CACGCTGATATGTAGGTGAAGTGATTTACTCATGGAGCTGAAATCAGTCGAAGATACCA-3 |
| coli3(SEQ ID NO：2) | 5-CTTTGGTTTCGCTCAATACTACATCTTTACTCACTGTAGCCTGATAAGTAATCCCACCA-3 |
| coli4(SEQ ID NO：3) | 5-CCGTAATGATGCGATAATAGCCCGTTGTTTACAGACTATTTCCCAGTTAATTCCACTAA-3 |
| coli5(SEQ ID NO：4) | 5-TGGTCCAGTATTCTTTCCCGTCAACCTTCACTGTAAATGTGTCATCCTCATTATACTTG-3 |
| 乳酸菌 | |
| lac1(SEQ ID NO：5) | 5-CGGCAATTTAAAACAATTAATACAATGATATCCAGTTTTCAAAGAACAAAGTCGCACCC-3 |
| lac2(SEQ ID NO：6) | 5-TTAAGTGAATACATAGCTTAAGGAGGGAACACGCAGTGAACTGAAACATCTAAGTAGCT-3 |
| lac3(SEQ ID NO：7) | 5-TAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTT-3 |
| lac4(SEQ ID NO：8) | 5-TCAAAACTGGCTATCATTGTTTAATTGCTGCCTTGAACTTAACGTACTTGTCATCGAAA-3 |
| 沙门氏菌 | |
| sal1(SEQ ID NO：9) | 5-TTTGATTTGATGCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGTCGTGTCCTTTGGTATTAATCC-3 |
| sal2(SEQ ID NO：10) | 5-GAGAGCTGAAACAAAGACTCTTTATACGGAAGAATGGCACTCTTATCCCAACCGAATTT-3 |
| sal3(SEQ ID NO：11) | 5-GGATTTAGTGCTAACGGCACAGGCTGCATAAACCAGTTTACCTTCGAAATGAATAGTAC-3 |
| sal4(SEQ ID NO：12) | 5-ATTATTATCTATACGCTGTTCACTTTCCAGAAATTCTCTTATCGTCGGTAAGGCACGCT-3 |
| sal5(SEQ ID NO：13) | 5-TTACGCATAATTACGATGGCTCCTCATTCATACTGCATATCGAAATACATGACCGCCGT-3 |
| 志贺氏菌 | |
| Shigella1(SEQ IDNO：14) | 5-GTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTATCTCATCCACAAAATGGAGAGTTCTGACTTTATC-3 |
| Shigella(SEQ ID NO：15) | 5-CTCAGTCTGTTATCGCTGGCTTTAAGTACAGTTAAGGACGGAGGGAGTTCTGGCAGAGA-3 |
| 金黄色葡萄球菌 | |
| sa1(SEQ ID NO：16) | 5-ACTATATACTGTTGGATCTTCAGAACCACTTCTATTTACGCCGTTATCTGTTTGTGATG-3 |
| sa2(SEQ ID NO：17) | 5-ACCACCAGCATAATAAACAACTTCAAATGGATTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAGATAG-3 |
| sa3(SEQ ID NO：18) | 5-ATACTCAGTTGTAAAGCCATGATGCTCGTAACCATGTGATTTAAACAAGTTTACTAGGG-3 |
| sa4(SEQ ID NO：19) | 5-TACCCGAACAGTAATACTTCTATATTTATCTAATTGGTTTCCATTATGCTCAGTTACAC-3 |
| sa5(SEQ ID NO：20) | 5-ATGACCAGCTTCGGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCTTTTACATACAGAACACAAT-3 |
| 霉菌 | |
| mold1(SEQ ID NO：21) | 5-GGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTT-3 |
| mold2(SEQ ID NO：22) | 5-TTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAATAAGGATTGACAGAT-3 |
| mold3(SEQ ID NO：23) | 5-CGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACG-3 |
| mold4(SEQ ID NO：24) | 5-GTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCT-3 |
| 酵母 | |
| Yeast1(SEQ ID NO：25) | 5-GCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTGCTAATTGGCATAC-3 |
| Yeast2(SEQ ID NO：26) | 5-CAGAGGTGAAATTCTTAGATTTACTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGA-3 |
| Yeast3(SEQ ID NO：27) | 5-GTAAGGAACCAAACAGATCTATCAACCCAGATGAAGCTGTTGCTTACGGTGCTGCTGTT-3 |
| Yeast4(SEQ ID NO：28) | 5-CTGAAGTTTCCGATGTCGGTAACGCTATCTTGGATGGTGCTGACTGTGTTATGTTGTCT-3 |
本发明的检测芯片的制备方法，是利用BLAST软件对所设计的探针进行序列比对，排除与非目的序列比对分值超过40的探针，并经过预实验，再次排除出现假阳性假阴性的探针；最终得到了上述表1所示的探针序列。
本发明的利用芯片检测病原体的方法，各类菌的上下游序列如表2所示：
表2、引物序列
(1).Coliform bacteria大肠菌群
| Sense Primer | Anti-sense Primer | ProductLength | |
| ACACAGGTGGTCAGGTAGAG | CGTCCACTTTCGTGTTTGC | 204 | (SEQ ID NO：29～30) |
| TGCGACAACCTCTCCAGTAG | GTCACAGAGCCGTTATCCTTG | 270 | (SEQ ID NO：31～32) |
| GCCGTAATGATGCGATAATAGC | GGTGTTCTGGTGGCTAAAGTG | 209 | (SEQ ID NO：33～34) |
| TGTTTATGGCGGTTTTATTTGC | AGGTACTGGATTTGATTGTGAC | 213 | (SEQ ID NO：35～36) |
(2).Lactobacillus乳酸菌
| Sense Primer | Anti-sense Primer | ProductLength |
| ATCACCCTCAAGCACCCTAAC | CGTCCTTCATCGGCTCCTAG | 211 | (SEQ ID NO：37～38) |
| ACTGGAAGCCGATGAAGGAC | TTCGCTCGCCGCTACTTG | 219 | (SEQ ID NO：39～40) |
| AAGTCGGAATCGCTAGTAATCG | ATCCAGCCGCAGGTTCTC | 204 | (SEQ ID NO：41～42) |
| AGTAAGAGCGCGAAGTGG | CTCTCAAAACTGGCTATCATTG | 180 | (SEQ ID NO：43～44) |
(3).Salmonella沙门氏菌
| Sense Primer | Anti-sense Primer | ProductLength | |
| CAACTTGCGGAGCGTCTAC | TGCTACCTTGCTGATGGATTG | 229 | (SEQ ID NO：45～46) |
| TCCTTCAGTATCGCAACATCAG | TACCCGTAGGTCCGATTTCC | 211 | (SEQ ID NO：47～48) |
| GGTTGCGGCTGATCCTACTC | GTGTTGGTGTTATCTGCCTGAC | 261 | (SEQ ID NO：49～50) |
| CGATGAATTACGCTCACAACAC | GGGCAACCAGCACTAACG | 272 | (SEQ ID NO：51～52) |
| CCGACTCGGTGGTCTATC | CGATGCCGTACAGGATAT | 177 | (SEQ ID NO：53～54) |
(4).Shigella志贺氏菌
| Sense Primer | Anti-sense Primer | ProductLength | |
| CGAAATTCTGGAGGACATTGC | TCATTCTCTTCACGGCTTCTG | 209 | (SEQ ID NO：55～56) |
| CCCGCACATACAAGAACTTAAC | GCAAGGAAGATGGAAGAGAAGG | 194 | (SEQ ID NO：57～58) |
(5).Staphylococcus aureus金黄色葡萄球菌
| Sense Primer | Anti-sense Primer | ProductLength | |
| AAAGGGCAATACGCAAAGAGG | TAACCGTATCACCATCAATCGC | 223 | (SEQ ID NO：59～60) |
| AGCACATAACAAGCGAGATAAC | CGGTCAATGCCATGATTTAATG | 246 | (SEQ ID NO：61～62) |
| TCGAATCGTGGTCCAGTAATG | AGGTTTAATACGCCCATCCATC | 278 | (SEQ ID NO：63～64) |
| GGTGGTGTAACTGAGCATAATG | CCGTTTCATAAGGCGAGTTG | 208 | (SEQ ID NO：65～66) |
| GGTACACGATATTCTTCACGAC | TCTGGGGATAATGAAGGGAAAC | 248 | (SEQ ID NO：67～68) |
(6).Mold霉菌
| Sense Primer | Anti-sense Primer | ProductLength | |
| GGGGAACCAGGACTTTTACTG | GAAAACATCCTTGGCGAATGC | 233 | (SEQ ID NO：69～70) |
| TATGGTCGCAAGGCTGAAAC | TCGTTCGTTATCGCAATTAAGC | 215 | (SEQ ID NO：71～72) |
| GTCCGTGCCCGTGTAAAG | GCTTCCCTTTCAACAATTTCAC | 187 | (SEQ ID NO：73～74) |
| GCCAATCCTACAGAGCATGTG | GATGAAGAACGCAGCGAAATG | 254 | (SEQ ID NO：75～76) |
(7).Yeast酵母
| Sense Primer | Anti-sense Primer | ProductLength |
| CGGGGAAACTGCGAATGG | AGGGCAGAAATTTGAATGAACC | 222 | (SEQ ID NO：77～78) |
| GGTCCTTGTCTATGTTCCTTGG | TCACTGTACTTGTTCGCTATCG | 186 | (SEQ ID NO：79～80) |
| GGCATCAGTATTCAGTTGTCAG | TTCAGCCTTGCGACCATAC | 255 | (SEQ ID NO：81～82) |
| GTCTTGGTCGGTGGTTCTAC | GAGCGACATCCAACAACAATAG | 190 | (SEQ ID NO：83～84) |
上述引物序列是通过从NCBI数据库中获得各菌的基因组序列，然后利用primer5.5软件进行设计而获得的。
采用本发明方法制备的芯片具有高密度的特点，每平方厘米超过4000点，因此利用围栏将芯片隔成12个独立的亚矩阵，每个亚矩阵能点制至少30×30的点阵，以每个点两个重复计算，则我们的芯片，就能同时检测12个样本，每个亚矩阵能检测每个样本中450种不同病原体，从而大大降低了检测成本。
本发明的利用芯片检测病原体的方法，使用了间接荧光标记技术，即引进了胺酰dUTP的间接标记技术，直到杂交前，才将荧光染料标记上去。这样，只需合成普通的引物，在普通的条件下完成扩增，等样品量到达一定量后，一起染色，杂交，鉴定。而利用荧光染料标记引物的方法，由于引物、扩增产物由于带有荧光标记，因此各操作步骤都需尽量在避光条件下进行，且产物需要尽快杂交、检测以防荧光淬灭，因此不易存放。同时，荧光信号强度比其他标记方法也大大增强了，因为，在两个引物上各加一个荧光标记的方法，这样的PCR产物，最多只带有两个荧光基团(上下游引物各一个)；另一种方法是在dNTP中掺入一定比例的Cy-dNTP，但由于空间位阻的关系，分子较小的dNTP会竞争性的优先加到聚合链上，导致PCR产物中真正含荧光基团的分子非常少，而我们先将小分子胺酰dUTP掺入到dNTP中，就会大大增加dUTP被加到聚合链上的概率，然后再将荧光染料标记上去，这样一个200bp的PCR产物，带有的荧光基团，是前两种方法的5-10倍。因此，大大增加了产物的信号，从而也间接增强了检测的灵敏度。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是一张多样本检测芯片的示意图；此芯片被分隔为12个亚矩阵，每个亚矩阵点制8×8的点，每个亚矩阵能检测一种样本的所有病原体；
图2是图1中的其中一个亚矩阵的示意图，共8×8个点，右上角为阴性探针，其余三个角为阳性探针，其他为28条特异性病原体检测探针。三个角的阳性探针，用于质量控制以及肉眼观察芯片扫描后的图片时的定位作用。
具体实施方式
参照上述附图，对本发明的具体实施方式进行详细说明。
实施例1、一种检测芯片的制备方法，依次进行以下步骤：
1)、设计细菌的寡核苷酸探针：
从NCBI数据库中获得大肠杆菌、乳酸菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母这7种菌的基因组序列，然后利用Arraydesigner4.2软件进行设计，所得的探针序列具体如表1所示。
每种细菌选用如表1所示的全部探针，即大肠杆菌选用SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示的这4条探针，其余细菌以此类推。
2)、芯片制备：
选用表1所示的28条探针，以及1条阴性(序列为：
5-CTCAATCCTTTGGGTGTATGGGTCGTAGCGAACTGAGAAGGGCCGAGGTATTGTGGCA-3)，1条阳性探针(GAPDH：
5-GTCCAGTTAATTTCTGACCTTTACTCCTGCCCTTTGAGTTTGATGATGCTGAGTGTAC-3)，共计30条探针。每条探针重复点样两次。阴性探针两个点，点在右上角，阳性探针，分别点在另外的三个角，每张芯片点12个亚矩阵，每个亚矩阵为8×8个点阵。
浓度67mM的探针与Corning print buffer按照1∶1体积(即各取2.5μl)混合后进行点样。用OmniGrid Accent高通量芯片点样仪点制芯片(点间距250um，点直径100um)。保持50％的湿度过夜，然后将芯片在于42度预热的预杂交液中(20×SSC 100ml，10％(V/V)SDS 4ml，10％(V/V)BSA40ml，dd H2O 276ml，Total 420ml)预杂交40min，再立即用水洗2min，异丙醇清洗2min，再用玻片离心机800rpm甩干，得检测芯片，备用。
实施例2、一种检测多个食品样本中病原体的方法，选用实施例1所得的检测芯片，依次进行以下步骤：
1)、设计引物：
从NCBI数据库中获得大肠杆菌、乳酸菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母这7种菌的基因组序列，然后利用primer5.5软件进行设计，上述每种细菌所对应的引物序列具体如表2所示。
2)、待测样品中DNA的提取，以12种乳液或液体状的乳制品作为待测样品，每种待测样品分别依次进行以下步骤：
①、取50ml样品，4℃，1000-2000rpm离心20min，弃上层悬浮物；
②、加10ml PBS，轻轻震荡将沉淀重新悬浮，4℃，1000-2000rpm离心20min，弃上层悬浮物；
③、重复2)以除去乳脂和乳蛋白；
④、待乳脂和乳蛋白除干净后，5000×g离心10min，弃上清；
⑤、加入22μl的TEN(1mL 1M Tris，pH 7.2；0.2mL 0.5M EDTA.pH 8.0；0.5844g NaCl；加水至100mL)和3μl 1N NaOH，剧烈振荡，直到沉淀完全悬浮，如果不融，可按22∶3的比例加入TEN和NaOH，直到完全悬浮为止。
⑥、将1.5mL的离心管置于95℃的水浴锅中加热8min，然后放入冰盒中冷却。
⑦、检测DNA浓度。
3)、靶基因的多重PCR扩增：
将步骤2)所得的每种待测样品DNA的提取液分别利用步骤1)所得每种菌的所有引物进行多重PCR扩增；具体步骤如下：
25μl PCR反应体系中，含有10×PCR缓冲液(含15mM Mg离子)2.5μl，aadUTP/dNTP(10mM，含2mM胺酰标记的dUTP)2.0μl，Taq DNA聚合酶(2U/ml)0.5μl，引物(20pmol/μl)各0.5μl，待测样品的DNA提取液1μl，加不含核酸酶的水补足到25μl)。PCR循环参数：94℃预变性5min；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸25秒，共35个循环。得扩增产物。
因此，每种待测样品DNA的提取液能对应得到7种扩增产物。
4)、芯片杂交检测：
①、荧光染料标记扩增产物：
将粉末状染料每包(1mg)用72μl DMSO溶解，然后分装，-20℃暗处存放。
对每种待测样品分别进行如下工作：
将上述步骤3)所得的7种扩增产物的每种中各取10μl进行混合，然后按2μl染料/每10μl产物的量加入荧光染料混匀，在黑暗室温环境下放置1小时。并进行纯化、洗脱，并浓缩至7μl；得杂交探针。
因此，一共得到12种探针。
②、样品与芯片杂交：
将上述步骤①所得的每种待测样品的杂交探针分别进行如下处理：
先将盖片盖到芯片上，再将得到的杂交探针与2×F杂交液(250μl 20×SSC；250μl去离子甲酰胺；10μl 10％SDS)混合，在98℃变性2分钟，然后迅速置于冰上。5min后取出，稍稍离心，然后用移液枪吸取，从盖片上的小孔加入液体，液体会随着张力，扩散到探针阵列区域。每个样品加到一个亚矩阵，在58度杂交2h。然后分别用洗脱液1(2×SSC，0.1％SDS，需42℃预热)、洗脱液2(0.5×SSC，0.01％SDS，需42℃预热)、洗脱液3(0.06×SSC)各洗5min。再用玻片离心机800rpm甩干。
5)、杂交结果的检测与分析：
用Agilent G2505B扫描仪扫描上述杂交后的芯片，利用genepix软件对结果进行分析。具体结果如下表3所示：
表3
| 样品8(FY08) | 原奶，取自富阳市某奶场 | 2条E.coli探针阳性 |
| 样品9(TL01) | 原奶，取自桐卢市某奶场 | 无 |
| 样品10(TL02) | 原奶，取自桐卢市某奶场 | 无 |
| 样品11(TL03) | 原奶，取自桐卢市某奶场 | 无 |
| 样品12 | 纯奶，经121度高温20分钟 | 无 |
为了充分证明本发明方法的正确性，发明人将实施例2所用的12种样品根据国标要求涂平板培养。具体结果如表4所示：
表4
| 样品4(FY06) | 原奶，取自富阳市某奶场 | 25ml牛奶中未检出 |
| 样品4(FY07) | 原奶，取自富阳市某奶场 | 25ml牛奶中未检出 |
| 样品4(FY08) | 原奶，取自富阳市某奶场 | 只检出大肠杆菌30MPN/100ml |
| 样品9(TL01) | 原奶，取自桐卢市某奶场 | 25ml牛奶中未检出 |
| 样品10(TL02) | 原奶，取自桐卢市某奶场 | 25ml牛奶中未检出 |
| 样品11(TL03) | 原奶，取自桐卢市某奶场 | 25ml牛奶中未检出 |
| 样品12 | 纯奶，经121度高温20分钟 | 25ml牛奶中未检出 |
两种方法显示，志贺菌、霉菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均为阴性结果，而大肠杆菌的检测结果也基本符合。然而用本实验方法检出的乳酸菌，用传统的平板法则都未能检出，其原因有可能是核酸法比平板法更为灵敏，也有可能是原奶的生产场地，运用了抗生素，而导致传统的平板法不能正常培养细菌，而产生阴性结果。但从整体上计算，本实验的最终检测结果与涂平板法一致性达95％以上。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
Claims (5)
1、一种检测芯片的制备方法，其特征是包括以下步骤：
1)、设计细菌的寡核苷酸探针：
每种细菌至少含两条探针，各探针利用常规软件进行设计，每条探针均必须符合以下条件：长度为50～60mer，Tm值差异在5度之内，各探针内部发夹结构≤5个、GC含量为40％～55％、重复的单一碱基的连续≤5个，分子最稳定的二级结构配对碱基长度少于6bp；
2)、芯片制备：
将步骤1)所得的探针与Corning print buffer等体积比混合后，利用点样仪点制芯片；将所得的芯片在预杂交液进行预杂交，再清洗、干燥后；得检测芯片。
2、根据权利要求1所述的检测芯片的制备方法，其特征是：所述大肠菌群的探针为SEQ IDNO：1～SEQ ID NO：4中的任意一种；所述乳酸菌的探针为SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：8中的任意一种；所述沙门氏菌的探针为SEQ ID NO：9～SEQ ID NO：13中的任意一种；所述志贺氏菌的探针为SEQ ID NO：14～SEQ ID NO：15中的任意一种；所述金黄色葡萄球菌的探针为SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：20中的任意一种；所述霉菌的探针为SEQ ID NO：21～SEQID NO：24中的任意一种；所述酵母的探针为SEQ ID NO：25～SEQ ID NO：28中的任意一种。
3、根据权利要求1或2所述的检测芯片的制备方法，其特征是：所述步骤2)中的预杂交液由20×SSC 100ml、10％SDS 4ml、10％BSA 40ml和dd H2O 276ml组成。
4、利用权利要求1～3中任意一种方法制备的检测芯片检测多个食品样本中病原体的方法，其特征是包括以下步骤：
1)、设计引物：
从数据库中获得上述每种细菌的基因组序列，然后利用常规软件设计对应每种细菌的引物；每对引物均需符合以下条件：使扩增产物在200bp左右，引物与引物之间配对碱基长度少于6bp；CG含量为40～55％；Tm差异在5度之内；
2)、待测样品中DNA的提取，得提取液；
3)、靶基因的多重PCR扩增：
将步骤2)的提取液作为PCR模板，分别利用步骤1)所得的引物进行多重PCR扩增；得扩增产物；
4)、芯片杂交检测：
先利用荧光染料标记扩增产物；再将上述标记后的扩增产物与芯片杂交；
5)、杂交结果的检测与分析：
用扫描仪扫描上述杂交后的芯片，利用常规软件对结果进行分析。
5、根据权利要求4所述的检测多个食品样本中病原体的方法，其特征是：所述大肠杆菌的引物对为SEQ ID NO：29～SEQ ID NO：36这4对引物中的任意一对；所述乳酸菌的引物对为SEQ ID NO：37～SEQ ID NO：44这4对引物中的任意一对；所述沙门氏菌的引物对为SEQ IDNO：45～SEQ ID NO：54这5对引物中的任意一对；所述志贺氏菌的引物对为SEQ ID NO：55～SEQ ID NO：58这2对引物中的任意一对；所述金黄色葡萄球菌的引物对为SEQ ID NO：59～SEQ ID NO：68这5对引物中的任意一对；所述霉菌的引物对为SEQ ID NO：69～SEQ ID NO：76这4对引物中的任意一对；所述酵母的引物对为SEQ ID NO：77～SEQ ID NO：84这4对引物中的任意一对。
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