CN104109711B - 一种用于检测腐败酵母菌核苷酸片段的引物、探针及检测方法和试剂盒 - Google Patents
一种用于检测腐败酵母菌核苷酸片段的引物、探针及检测方法和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104109711B CN104109711B CN201410201044.0A CN201410201044A CN104109711B CN 104109711 B CN104109711 B CN 104109711B CN 201410201044 A CN201410201044 A CN 201410201044A CN 104109711 B CN104109711 B CN 104109711B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- yeast
- probe
- pcr
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 62
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 48
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 241001558929 Sclerotium <basidiomycota> Species 0.000 title claims abstract description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 50
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 8
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 7
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 7
- 241000222173 Candida parapsilosis Species 0.000 claims description 6
- 229940055022 candida parapsilosis Drugs 0.000 claims description 6
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 6
- 241000235036 Debaryomyces hansenii Species 0.000 claims description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 4
- 241001514654 Cystobasidium pallidum Species 0.000 claims description 3
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 2
- 229940081969 saccharomyces cerevisiae Drugs 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 abstract description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 28
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 241000722885 Brettanomyces Species 0.000 description 6
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000159512 Geotrichum Species 0.000 description 4
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 4
- 241000235017 Zygosaccharomyces Species 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 241001333951 Escherichia coli O157 Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 241001237431 Anomala Species 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241000228232 Aspergillus tubingensis Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 241001530515 Candida sake Species 0.000 description 2
- 244000286779 Hansenula anomala Species 0.000 description 2
- 235000014683 Hansenula anomala Nutrition 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 2
- 244000253911 Saccharomyces fragilis Species 0.000 description 2
- 235000018368 Saccharomyces fragilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000370151 Wickerhamomyces Species 0.000 description 2
- 241000222295 [Candida] zeylanoides Species 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 229940031154 kluyveromyces marxianus Drugs 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000005452 food preservative Substances 0.000 description 1
- 235000019249 food preservative Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 235000001497 healthy food Nutrition 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012803 optimization experiment Methods 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005554 pickling Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000007859 qualitative PCR Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000013580 sausages Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000008983 soft cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种用于检测腐败酵母菌核苷酸片段的引物、探针及检测方法和试剂盒，所述的引物由上游引物Yeast？F1和下游引物Fungus？R1组成，所述的上游引物Yeast？F1的碱基序列为GAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAA，下游引物Fungus？R1的碱基序列为TCCTTCCCTTTCAACAATTTCAC。所述探针的碱基序列为TGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCC。本发明提供的引物和探针具有良好的灵敏度和特异性。本发明整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于同时检测常见腐败酵母菌的核苷酸片段的引物和探针序列及检测方法和试剂盒。
背景技术
大量酵母的存在可引起食品风味下降或变质，由酵母引起的食品腐败越来越受到重视。酵母不仅在低湿度、低pH值或高盐高糖的食品中抵抗力较强，同时对防腐剂、冷冻、电离辐射照射的抵抗力强，随着食品防腐剂及电离辐射照射等相关技术的应用，普通致病性或腐败性细菌被有效杀灭，酵母则成为引起食品变质的优势菌酵。在常见的发酵食品、海产食品、腌制食品等食品中很容易发生酵母引起的腐败，腐败酸奶中可分离出汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytaca)；在半软和软奶酪中，假丝酵母属、蔷薇酵母属和隐球酵母等会引起臭味、软化、产气、变色和涨袋；诞沫假丝酵母(Candidazeylanoides)、逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)、清酒假丝酵母(Candidasake)等酵母都能引起火腿、香肠等肉制品感官品质的改变引起腐败。食品中常见腐败酵母如表1所示，酵母引起的食品变质和腐败给食品工业造成巨大的安全风险，因此寻找一个快速简便、能同时检测多种食品种腐败性和致病性酵母的检测方法意义重大。
目前检测酵母菌的方法有传统的培养法、抗体抗原免疫法、聚合酶链式反应(PCR)技术等。传统的培养法方便、成本低，但所需时间至少要5天，无法适应现代高通量快速检测的需求；抗体抗原免疫法具有较高的灵敏度和特异性，但存在成本较高、筛选抗体困难和不能同时检测多种抗原的能力，无法满足食品中多种食品种腐败性和致病性酵母同时检测的要求。传统PCR特异性强、灵敏度高、快速、简便，但有易受到污染，需要使用有毒试剂EB等缺点，实时荧光定量PCR是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，不但具备传统PCR的优点，而且克服了易受到污染，需要使用有毒试剂EB等缺点，该检测方法具有快速、简便、直观、定量准确等优势，已被成功应用于临床疾病诊断、动物疾病检测、食品安全、科学研究等多种领域的研究检测。
表1食品中常见腐败型酵母
| 编号 | 属名 |
| 1 | 假丝酵母属(Candida) |
| 2 | 隐球酵母属(Cryptococcus) |
| 3 | 地丝菌属(Geotrichum) |
| 4 | 蔷薇酵母属(Rhodotorula) |
| 5 | 接合酵母属(Zygosaccharomyces) |
| 6 | 德克/酒香酵母(Dekkera/Brettanomyces) |
| 7 | 裂殖酵母属(Schizosaccharomyces) |
| 8 | 异常毕赤酵母(Wickerhamomyces(Pichia)anomala) |
发明内容
本发明的目的是提供一种用于同时检测食品中常见腐败酵母菌的核苷酸片段的引物和探针序列。
基于上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于检测腐败酵母菌核苷酸片段的引物，由上游引物YeastF1和下游引物FungusR1组成，所述的上游引物YeastF1的碱基序列为GAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAA，下游引物FungusR1的碱基序列为TCCTTCCCTTTCAACAATTTCAC。
一种用于检测腐败酵母菌核苷酸片段的探针，探针为YeastPb1，其碱基序列为TGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCC。
一种腐败酵母菌核苷酸片段的检测试剂盒，包括以下组分：
优选地，所述的检测试剂盒，包括以下组分：
一种腐败酵母菌核苷酸片段的检测方法，包括如下步骤：
(1)按照权利要求1和2的序列设计引物和探针；
(2)按照DNA提取试剂盒提取待测样品中酵母基因组DNA作为模板；
(3)建立反应体系
利用上述引物和探针进行反应体系的建立，确定采用的荧光PCR反应体系，以20μl体系计，所需各组分及相应浓度如下：
(4)选择仪器的检测通道
在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致；
(5)上机检测
将上述20μl的反应体系进行荧光PCR检测；经检测，若待测样品中含有腐败酵母则显示阳性扩增曲线；若待检培养液中不含有酵母菌则无扩增信号。
所述PCR条件选择如下：
95℃1min，1个循环；
95℃5sec，60℃40sec，40个循环。
优选地，所述荧光PCR反应体系如下，以20μl体系计：
所述腐败酵母菌为假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、地丝菌属(Geotrichum)、蔷薇酵母属(Rhodotorula)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德克/酒香酵母(Dekkera/Brettanomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或异常毕赤酵母(Wickerhamomyces(Pichia)anomala)。
优选地，所述腐败酵母菌为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、斯巴达毕赤酵母(PichiaSparta)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)或浅红酵母(RhodotorulapallidaLodder)。
本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、四种核苷酸单体(dNTP)等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR扩增过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达100个拷贝/ml，说明其具有良好的灵敏度。
(2)本发明提供的引物和探针对于不含腐败酵母的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。
(3)由于本发明采用表1中8种类型酵母的26SrRNA基因的保守区设计引物探针，避免了假阴性结果的产生。
(4)由于本发明采用荧光PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法如PCR－电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。
附图说明
图1为实施例1利用YeastF1/FungusR1引物扩增不同酵母DNA的荧光变化图谱。
图2为实施例2酿酒酵母梯度稀释荧光PCR扩增结果图。
图3为实施例3大肠杆菌O157、曲霉扩增曲线图。
图4为实施例5样品添加腐败菌后的扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
实施例1
一种常见腐败酵母菌核苷酸片段的检测方法，包括如下步骤：
1、引物和探针设计：通过分别对常见腐败酵母菌基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物、探针序列组合如下：
上游引物YeastF1:GAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAA
下游引物FungusR1:TCCTTCCCTTTCAACAATTTCAC
探针YeastPb1:TGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCC。
2、反应体系的建立和优化：反应体系的建立和优化中所采用的靶区域模板以如下方法获得：分别取酿酒酵母、近平滑假丝酵母、斯巴达毕赤酵母、汉逊德巴利酵母、浅红酵母等菌株复苏后培养48小时，取培养液1ml进行10倍梯度稀释，选取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6共6个稀释度作为系列阳性模板，分别提取基因组核酸，再分别用上述检测序列区域中的最长的扩增片段的引物和探针进行PCR扩增，并取其中Ct值24-27之间者作为以后反应体系优化时的模板。
2.1引物浓度的优化在反应体系中，将酵母通用型的引物浓度分别从0.1μmol/L至0.8μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.5μmol/L。
2.2探针浓度的优化在反应体系中，将酵母通用型的探针浓度分别从0.05μmol/L至0.5μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.25μmol/L。
2.3镁离子浓度的优化在反应体系中其它条件不变的前提下，将MgCl2的浓度从1mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L递增，经过多次重复实验选定2.5mmol/L为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。
2.4TaqDNA聚合酶(Taq酶)用量的优化通过比较Taq酶用量(以单位Unit计)的优化实验结果，选定2U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。
2.5dNTPs浓度的优化通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评估后选0.2mmol/L作为试剂盒反应体系中dNTPs的使用量。
利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光PCR18μl检测试剂盒和2μlDNA模板组成20μl的PCR反应体系，检测试剂盒所需各组分及相应浓度见表2。
表2优化后的PCR检测试剂盒
| 组分 | 终浓度 |
| 10×PCR反应缓冲液 | 1× |
| Mg2+浓度 | 2.5mmol/L |
| dNTPs(含dUTP) | 0.2mmol/L |
| Taq酶 | 2U |
| 引物(上游) | 0.5μmol/L |
| 引物(下游) | 0.5μmol/L |
| 探针 | 0.25μmol/L |
| 补水至 | 18μl |
注：a.在荧光PCR反应体积不同时，各试剂应按比例调整。
b.本发明使用的仪器是ABI7500RealTimePCRSystem，若使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。
3、仪器检测通道的选择：在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。
4、PCR条件选择如下：
95℃1min，1个循环；
95℃5sec，60℃40sec，40个循环。
5、上机进行荧光PCR检测：
经检测，待检食品原料中含有腐败酵母的显示阳性扩增曲线(见图1)。
实施例2
1、选取引物对YeastF1/FungusR1引物和探针YeastPb1，取酿酒酵母(CICC1001，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)标准菌株于选择性培养基中培养一定时间，测其OD值，估计其菌数，然后按如下梯度稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，研究该引物与探针系统的灵敏度问题，取10-3，10-4，10-5，10-6，10-7涂板计数，涂板的菌液量为50ul/平板。并将10-3，10-4，10-5，10-6，10-7五个梯度菌液用Takara酵母提取试剂盒抽提基因组DNA，具体步骤参考该试剂盒说明书。
2、在18μl检测试剂盒，分别加入以上提取的各个梯度酵母基因组DNA2μl，并取2μlDEPC水为阴性对照，根据前述PCR反应条件进行荧光PCR检测。
3、荧光PCR检测和平板计数结果见表2和图2。经检测，荧光PCR方法一直稀释到10-6时还可以检出，检出限在760cfu/ml。提示上述引物对和探针具有良好的灵敏度。
表2灵敏度实验结果
实施例3
1、选取引物对YeastF1/FungusR1引物和探针YeastPb1，用细菌大肠杆菌O157(NCTC12900，珠海出入境检验检疫局提供)和霉菌曲霉菌(HGAO1，珠海出入境检验检疫局提供)研究该引物与探针系统的特异性问题。
大肠杆菌O157用酚－氯仿法抽提基因组DNA，具体步骤如下：
(1)分别将待检的9种致病菌增菌液(约1mL)加入1.5mL的离心管中，12000rpm离心5分钟，去上清；
(2)加入DNA裂解液700μL，充分混匀重悬，水浴煮沸5分钟；
(3)加入等体积的酚－氯仿(V/V＝1:1)溶液，充分混匀后离心，13000rpm离心5分钟；
(4)将上清液移入另一个1.5mL的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，13000rpm离心5分钟；
(5)将上清液移入另一个1.5mL的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心5分钟；
(6)弃上清后用70％(体积百分含量)乙醇冲洗，13000rpm离心5分钟，小心吸弃上清，倒置晾干；
(7)在干燥后的离心管中加入50μlDNA溶解液充分混匀，作为DNA模板待用。
曲霉菌提取基因组DNA，具体操作步骤为：
(1)取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。
(2)加入4mL提取液，快速振荡混匀。
(3)加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min。
(4)1000rpm，4℃，5min。
(5)上清用氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm，4℃离心5min)。6)取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。
(6)用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75％乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ulTE中。
(7)加入1μlRNaseA(10mg/mL)，37℃处理1h。
(8)用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm，4℃离心5min)。
(9)取上清，1/10V3MNaAc，2.5V体积的无水乙醇，-70℃沉淀30min以上
(10)沉淀用75％乙醇漂洗，风干，溶于200ulTE中，-20℃保存备用。
2、在18μl检测试剂盒中，分别加入以上提取的O157和曲霉基因组DNA各2μl，并取2μl酿酒酵母DNA作为阳性对照。根据前述PCR反应条件进行荧光PCR检测，经检测，除酿酒酵母外，待检测液均无扩增信号(见图3)，说明提示上述引物对和探针对常见的酵母菌具有良好的特异性。
实施例4
1、选取引物对YeastF1/FungusR1引物和探针YeastPb1，用毕赤酵母研究该引物与探针系统的稳定性问题。
2、取毕赤酵母标准菌株(CICC1716，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)于选择性培养基中培养一定时间，测其OD值，估计其菌数，然后按如下梯度稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，取10-3，10-4，10-5，10-6用Takara酵母提取试剂盒抽提取DNA。
3、在18μl检测试剂盒中，分别加入以上提取的各个梯度酵母基因组DNA2μl，分别进行组内和组间稳定性测试，根据前述PCR反应条件进行荧光PCR检测。组内试验一次做4个重复，同时上机，计算CT值的标准差与CV值。组间试验不设重复，在不同的时间内分别做4次，计算CT值的标准差与CV值。
4、检测结果如表3所示，从表3可以看出，组内实验CV在0.99-1.61％之间波动，而组间实验在0.72-1.46％之间波动，可见本方法稳定性良好。
表3组内与组间实验CV值
注：变异系数(％CV)＝标准差/平均CT值
实施例5
1、对食物样品进行人工加菌污染后，检测食品样品中的酵母菌。
2、分别吸取100μL近平滑假丝酵母菌(ACCC20221，购自中国农业微生物菌种保藏中心)和酿酒酵母(CICC1001，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心)含量为100CFU/mL的菌悬液均匀混在25mg无污染的保健食品原料粉末中，静置10min以模拟自然状态下的污染。
3、用增菌液对污染的食品样品进行增菌培养，分别在培养12h时按实施例2中的方法提取增菌液中的DNA，并用实施例1中的引物对BacF1a/BacR1和探针BacPb1，在18μl检测试剂盒中，分别加入以上提取的酵母基因组DNA2μl，并取2μlDEPC水为阴性对照，根据前述PCR反应条件进行荧光PCR检测。
4、经检测，待检食品原料中含有腐败酵母的显示阳性扩增曲线(见图4)。
Claims (6)
1.一种用于检测腐败酵母菌核苷酸片段的探针，其特征在于，所述探针的碱基序列为TGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCC，所述腐败酵母菌为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、斯巴达毕赤酵母(PichiaSparta)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)或浅红酵母(RhodotorulapallidaLodder)。
2.一种腐败酵母菌核苷酸片段的检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
所述的上游引物的碱基序列为GAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAA，下游引物的碱基序列为TCCTTCCCTTTCAACAATTTCAC。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
4.一种腐败酵母菌核苷酸片段的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)按照权利要求1和2的序列设计探针和引物；
(2)按照DNA提取试剂盒提取待测样品中酵母基因组DNA作为模板；
(3)建立反应体系
利用上述引物和探针进行反应体系的建立，确定采用的荧光PCR反应体系，以20μl体系计，所需各组分及相应浓度如下：
(4)选择仪器的检测通道
在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致；
(5)上机检测
将上述20μl的反应体系进行荧光PCR检测；经检测，若待测样品中含有腐败酵母则显示阳性扩增曲线；若待检培养液中不含有酵母菌则无扩增信号。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述PCR条件选择如下：95℃1min，1个循环；
95℃5sec，60℃40sec，40个循环。
6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，所述荧光PCR反应体系如下，以20μl体系计：
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410201044.0A CN104109711B (zh) | 2014-05-13 | 2014-05-13 | 一种用于检测腐败酵母菌核苷酸片段的引物、探针及检测方法和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410201044.0A CN104109711B (zh) | 2014-05-13 | 2014-05-13 | 一种用于检测腐败酵母菌核苷酸片段的引物、探针及检测方法和试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104109711A CN104109711A (zh) | 2014-10-22 |
| CN104109711B true CN104109711B (zh) | 2016-03-02 |
Family
ID=51706699
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410201044.0A Expired - Fee Related CN104109711B (zh) | 2014-05-13 | 2014-05-13 | 一种用于检测腐败酵母菌核苷酸片段的引物、探针及检测方法和试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104109711B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105603118A (zh) * | 2016-04-05 | 2016-05-25 | 秦皇岛出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 拜氏接合酵母检测用引物和探针及其检测方法 |
| CN106755305A (zh) * | 2016-11-18 | 2017-05-31 | 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心 | 一种葡萄酒中腐败酵母菌的检测引物及数字pcr检测方法 |
| KR101886379B1 (ko) * | 2017-06-07 | 2018-08-08 | 롯데칠성음료주식회사 | 탄산 조건에서 생장 가능한 효모의 신속한 검출방법 및 검출키트 |
| CN114381541A (zh) * | 2021-12-08 | 2022-04-22 | 大连民族大学 | 一种检测粮食储存环境气溶胶中的霉菌监测粮食霉变的新方法及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101240347A (zh) * | 2008-03-11 | 2008-08-13 | 浙江大学 | 检测芯片的制备方法及利用该芯片检测病原体的方法 |
| CN101260423A (zh) * | 2008-04-28 | 2008-09-10 | 东北农业大学 | 一种检测单核细胞增生李斯特活菌的方法 |
-
2014
- 2014-05-13 CN CN201410201044.0A patent/CN104109711B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101240347A (zh) * | 2008-03-11 | 2008-08-13 | 浙江大学 | 检测芯片的制备方法及利用该芯片检测病原体的方法 |
| CN101260423A (zh) * | 2008-04-28 | 2008-09-10 | 东北农业大学 | 一种检测单核细胞增生李斯特活菌的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 核糖体RNA 基因在酵母分类鉴定中的应用;刘宁等;《中国农业科学》;20101231;第43卷(第22期);正文第4702页右栏第4-11行 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104109711A (zh) | 2014-10-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104109711B (zh) | 一种用于检测腐败酵母菌核苷酸片段的引物、探针及检测方法和试剂盒 | |
| CN101712987B (zh) | 益生菌乳制品中植物乳杆菌的快速定性、定量测定方法 | |
| CN105331714B (zh) | 一种荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速检测方法 | |
| Park et al. | Application of quantitative real-time PCR for enumeration of total bacterial, archaeal, and yeast populations in kimchi | |
| CN102994644B (zh) | 一种植物乳杆菌定量检测方法及其检测试剂盒和应用 | |
| Panek et al. | Development of a qPCR assay for the detection of heat-resistant Talaromyces flavus | |
| CN101712989A (zh) | 益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定性、定量测定方法 | |
| CN106755339B (zh) | 黄瓜炭疽病菌lamp检测引物及其应用 | |
| CN101712986B (zh) | 益生菌乳制品中嗜酸乳杆菌的快速定性、定量测定方法 | |
| Kodama et al. | Qualitative PCR method for Roundup Ready® soybean: Interlaboratory study | |
| Leal et al. | Development of two reverse transcription‐PCR methods to detect living pinewood nematode, B ursaphelenchus xylophilus, in wood | |
| CN106636378B (zh) | 用于检测番茄晚疫病菌的lamp引物组合物和应用 | |
| CN105063226A (zh) | 菜用大豆炭疽病菌特异性pcr检测引物及其检测方法 | |
| CN102329864A (zh) | 一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光pcr试剂盒 | |
| CN107828912A (zh) | 一种黄瓜黑星病菌lamp检测引物及检测方法 | |
| Roumani et al. | Development of a real-time PCR assay with an internal amplification control for the detection of spoilage fungi in fruit preparations | |
| CN100395346C (zh) | 一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌核苷酸片段的引物和探针序列 | |
| CN100395348C (zh) | 一种用于检测大肠杆菌o157：h7核苷酸片段的引物和探针序列 | |
| CN102925568B (zh) | 瓜类果斑病菌检测用引物探针及其检测方法 | |
| CN101712990B (zh) | 益生菌乳制品中鼠李糖乳杆菌的快速定性、定量测定方法 | |
| CN101712988A (zh) | 益生菌乳制品中双岐杆菌的快速定性、定量测定方法 | |
| CN101649352A (zh) | 益生菌乳制品中发酵乳杆菌的快速定性、定量测定方法 | |
| CN105039560A (zh) | 一种荔枝炭疽菌lamp引物及其快速检测方法和应用 | |
| CN100402667C (zh) | 一种用于检测志贺氏菌核苷酸片段的引物和探针序列 | |
| Loiseau | European interlaboratory comparison of detection methods for “flavescence dorée” phytoplasma: preliminary results |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160302 |