CN114381541A - 一种检测粮食储存环境气溶胶中的霉菌监测粮食霉变的新方法及应用 - Google Patents

一种检测粮食储存环境气溶胶中的霉菌监测粮食霉变的新方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测粮食储存环境气溶胶中的霉菌监测粮食霉变的新方法及应用，特别涉及一种在粮食储藏与生产加工场所中收集环境气溶胶中的霉菌，研究霉菌活动与粮食霉变的关系，进行粮食霉变早期预警及监测。应用生物气溶胶监测仪，采集储藏粮食由于霉变在环境空气中所产生的气溶胶中霉菌，进行气溶胶中霉菌计数，同时快速分析粮食霉变产生气溶胶中的霉菌种类，建立霉菌分子生物学快速鉴定方法。提出并建立了一种通过收集监测粮食储存场所的环境气溶胶中霉菌，进行粮食霉变早期预警及监测的新思路和新方法。本发明对于粮食霉变早期监测及预警具有准确、快速、灵敏的特点。

Description

一种检测粮食储存环境气溶胶中的霉菌监测粮食霉变的新方 法及应用
技术领域
本发明涉及一种食品检测技术领域，特别涉及一种收集检测粮食储存场所环境气溶胶中的霉菌，进行粮食霉变早期预警及监测。
背景技术
我国人口众多，粮食的短缺问题比较严重，解决粮食的安全储藏问题是关于国计民生的大问题。霉菌污染是食品和粮食储藏过程中重要的危害原因，会使食品和粮食质量下降，降低口感、营养等食用价值；而且霉菌产生的毒素会损害人类和动物的健康，具有致癌性。当储藏时间过长时，霉菌很容易就会迅速生长繁殖，据有关调查统计显示，因霉菌及其产生的毒素对储藏粮食的危害，每年所造成浪费的粮食就约占世界总产的8％。
粮食在发生霉变初期，其品质没有发生明显变化，也没有霉菌毒素的产生。只要能够采取一定的措施，如通风等快速将粮仓中的水分含量降低直至安全水分以下，就能控制大范围的霉变产生，抑制真菌毒素的产生。如果在粮食发生霉变的初期，没有发现并采取有效的措施，等到粮仓出现很明显的发热现象时，表明粮食已经出现了严重霉变，粮食中很可能已经产生大量霉菌毒素。因此对粮仓进行早期监测和预警是十分有必要的，有实际的重要意义。
目前对于霉菌检测仍以传统的霉菌培养和形态学、生化鉴定为主。SN/T 1035-2002出口食品中主要产毒真菌检验方法和GB 4789.16-2016食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定，这些标准和方法都是根据黄曲霉的菌体形态和显微镜下特征进行分类与鉴定，霉菌培养时间长，培养鉴定需要10-20天，工作量繁琐；极易因近缘种间的形态相似性而导致真菌鉴定结果的误判，需要检测人员具有丰富的鉴定经验。霉菌孢子容易扩散，极易发生实验室污染；霉菌检测对实验室的要求很高，需要独立的霉菌实验室，避免霉菌污染其它致病菌；而一般实验室和基层实验室不具备单独建立霉菌实验室的条件，无法开展霉菌检测。需要研发快速、灵敏、准确的产毒真菌检测方法。
目前国内外，在粮谷霉变和真菌毒素早期监测领域，未见应用气溶胶进行粮谷霉变早期监测的相关研究报道。当粮粒刚开始受到霉菌侵入时，感官评价还不能进行判断。微生物活性监测技术利用检测微生物生长过程产生的酶及其代谢酶的特性，应用检测微生酶活性进而直接实现对储粮细菌霉变的间接活性监测的；蔡静平等首次明确提出了有关与储粮有关微生物活性的科学概念，预防储粮的粮食霉变早期。也有学者通过电子鼻技术、机器视觉技术等开展了粮食霉变早期预警检测研究，但电子鼻技术和机器视觉技术等新技术目前仅处于实验室试验阶段，应用于早期监测粮食霉变还不成熟。有学者建立了储粮安全风险预警模型，结合粮堆温度、湿度、水分和CO2等因素，监测粮食霉变，不过模型的建立和演变到最终得出结论需要一个时间过程，无法进行粮食霉变的实时检测和早期预警。程树峰等在我国稻谷和小麦粮仓中应用便携CO2检测仪对谷物浓度水平变化情况进行了实时检测；CO2的检测法主要适用于粮仓密闭性和环境较好的粮堆情况进行实时监测；CO2气体监测检测技术的最大缺点是不适用于粮食的运输、中转等复杂过程。唐芳等曾利用真菌孢子计数法对储藏稻谷中真菌活动进行检测，得到不同水分稻谷储藏期间主要的霉菌生长的特点；该方法操作简单，基本上可以反映出霉菌生长的情况，但结果的重复性不高，由于早期霉菌污染分布不均匀，不容易取到霉菌样品；而且容易受到实验人员能力和经验等主观因素的影响，这种方法显然并不适用于粮食霉变的早期监控。
实际工作中这些检测方法均受采样量的限制，霉变不均匀，不容易每次都采集到霉变样品。不能全面检测、评判储备粮仓各部位或吨位级进出口粮谷真实的污染情况。因此对粮谷霉变情况进行监控，研发早期风险预测技术，实现粮食安全风险爆发前早预测、扩散前早发现、危害前早处置对确保粮食质量安全具有重要意义。现行粮食霉变监测方法周期长、时效性差，已经远远不能满足高速发展的食品和粮食监管和检测需求。因此需要准确性高、快速灵敏的粮食霉变早期预警检测方法。
气溶胶(aerosol)是指一种固态或液态的各种微粒状化学物质及其悬浮在各种气体化学介质中所形成的分散体系。生物气溶胶指空气中含有微生物粒子的气溶胶，常见的生物气溶胶主要包括细菌、霉菌孢子、寄生虫卵、各种原生菌类毒素和细胞碎片及分泌物等，生物气溶胶在预防各种传染病、致敏病、食品安全、大气环境、生态环境、生物反恐、疾病检测等方面均有重要的应用。据报道，人类传播性疾病感染途径占首位的致病细菌和微生物就是经由气溶胶直接传播的。现阶段生物气溶胶的采集方法分为自然沉降采样法、撞击式沉降采样法和生物气溶胶检测仪等，但目前国内外未见检测气溶胶的生物浓度预测粮食的霉变情况的相关报道。
在研究中发现，现有的粮食霉变监测方法并不能满足早期预警的需要，当检测出粮谷样品中有超过限量的CO2或者真菌毒素时，粮食已经发生比较严重的霉变，霉菌及其毒素已经污染了大部分粮食；亟需一种新技术来解决上述问题。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明提供了一种收集检测粮食储存场所的环境气溶胶中的霉菌，进行粮食霉变早期预警及监测的新方法。为了实现粮食霉变早期风险预警，将空气气溶胶中霉菌采集与霉菌分子生物学快速检测技术相结合，主要研究粮食霉变产生的气溶胶中的霉菌浓度及霉菌快速检测方法，对霉变环境中的气溶胶进行收集检测，研究不同条件下的霉菌活动及其产生气溶胶与粮食霉变的关系。所建立的粮食霉变模型显示，随着霉变发生发展，环境中气溶胶浓度增加，气溶胶浓度与霉变程度呈正相关。
本发明第一方面提供了一种收集检测粮食储存场所的环境气溶胶中的霉菌，进行粮食霉变早期预警及监测的新方法。利用生物气溶胶自动监测仪采集待检环境空气中生物气溶胶，将气溶胶中的霉菌收集到采集液中；采用霉菌培养计数法计算气溶胶中霉菌浓度的同时，利用实时荧光PCR技术特异性检测气溶胶中是否存在霉菌，并检测霉菌种类，验证霉菌活动与粮食霉变的关系，建立了玉米霉变模型，在粮食霉变早期整体评判粮谷及制品受霉菌污染的风险，快速、灵敏、准确地早期识别霉变发生，提高粮食制品预防霉变和霉菌毒素污染发生发展的监测水平，为大规模粮食储藏过程中的早期霉变活动监测提供有效的监测技术手段，有效的控制霉变和霉菌毒素产生和发展。
优选的，用采样器采集粮谷储存和生产加工场所的气溶胶，将微生物收集至采集液中。生物气溶胶采集液经过优化，选定为沙氏液体培养基，更适用于霉菌生长。
本发明为了验证霉菌活动与粮食霉变的关系，建立了玉米霉变模型，收集了玉米霉变产生的霉菌气溶胶，采用计数法计算气溶胶中霉菌浓度，建立了几种主要霉菌的分子生物学快速检测方法，特异性检测霉变气溶胶中的黄曲霉、烟曲霉、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、赭曲霉等霉菌。克服了现有霉变监测技术存在的检测周期长、检测成本高、无法全面整体预测等主要问题，为粮食霉变早期预测提供新思路。
本发明所述方法收集粮食霉变产生的霉菌气溶胶，参照GB/T4789.16—2016方法进行粮食霉变气溶胶中霉菌种类形态学鉴定。建立粮食霉变模型，分析发现储藏粮食场所霉变气溶胶中产毒素霉菌主要是黄曲霉、烟曲霉、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、赭曲霉。针对霉菌种属鉴定基因设计实时荧光PCR引物探针，建立了可以特异性检测粮食中黄曲霉、烟曲霉、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、赭曲霉的实时荧光PCR法。
本发明的目的是提供一种对于粮食霉变，应用气溶胶中霉菌进行早期监测的方法。应用本发明建立的实时荧光PCR检测方法，快速检测粮食储藏环境气溶胶中是否有霉菌，同时进行霉菌浓度测定及种类鉴别，实现粮食霉变早期监测的目的。本发明具有快速灵敏等优点，满足了粮食霉变迅速准确预警的需求。
本发明发现，霉菌活动及其产生气溶胶的量与粮食霉变具有正相关性，气溶胶中的霉菌浓度增加可以反映霉变程度。基于上述原因，本发明创新性提出监测粮食环境中气溶胶中的霉菌，在粮食发生霉变早期，即可检测出气溶胶中霉菌数量增加，为霉变早期预警提供依据。
进一步的，本发明建立了环境空气气溶胶中霉菌采样和收集方法；并且优化了微生物气溶胶采集液，选定沙氏液体培养基作为霉菌采集液，保证气溶胶中的霉菌在采集过程中受到的损伤最小，霉菌生长状态更好，更能反映样品中霉菌的真实生长状态。
更为优选地，本发明提供了一种粮食霉变气溶胶中霉菌实时荧光PCR快速检测方法，精准鉴定气溶胶中霉菌种类，精准评判粮谷及制品中受霉菌及其毒素污染的风险。
综上，本发明建立了粮食储藏和生产加工场所，应用监测环境气溶胶中霉菌数量与种类，进行粮食霉菌污染早期监测预警的新方法。验证试验结果表明，本发明建立的应用气溶胶早期预警粮食霉变的方法，预测平均准确率为95％以上，准确率高，灵敏稳定性好，明显优于传统的粮谷中真菌培养鉴定检测方法及电子鼻、CO2监测等方法，实现粮食霉变的早期预警检测。本发明所述方法尤其适用于在粮食储存或者装卸、出仓、入仓、中转、加工等容易产生大量微生物气溶胶的场所。
本发明的具体技术方案如下：
一种收集检测粮食储存场所的环境气溶胶中的霉菌，进行粮食霉变早期预警及监测的新方法。其包括如下步骤：采集粮食环境中的生物气溶胶：分别取采样器中收集到的气溶胶采集液及同一环境下的霉变样品，按照霉菌计数标准进行霉菌计数，利用实时荧光PCR技术检测气溶胶中是否存在霉菌，并检测霉菌种类；比较气溶胶和霉变样品中的霉菌计数浓度的一致性；根据实时荧光PCR技术检测结果判断粮谷及制品中霉菌污染情况。
进一步优选的，所述采集粮食环境中的生物气溶胶是通过生物气溶胶自动监测仪采集。且采用GB/T4789.15-2016和GB/T4789.16-2016方法进行霉菌计数和种类鉴定。
进一步优选的，气溶胶中霉菌计数与粮食霉变程度具有相关性，收集气溶胶进行霉菌培养计数，气溶胶中霉菌计数结果与霉变粮食样品中的霉菌计数呈正相关。
进一步优选的，所述霉变样品同一环境中气溶胶中产毒素霉菌主要包括黄曲霉、烟曲霉、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、赭曲霉。
进一步优选的，所述利用实时荧光PCR技术检测气溶胶中霉菌的方法还包括如下步骤：将收集到的气溶胶采集液置于30℃培养过夜，用0.45μm的无菌滤膜过滤，将微生物富集到无菌滤膜上；采用CTAB法或真菌DNA提取试剂盒提取滤膜上真菌总DNA作为检测模板。
进一步优选的，所述荧光PCR方法采用的引物和荧光探针如SEQ ID NO.1-15所述。采用实时荧光PCR方法，对气溶胶中的霉菌进行检测，精准鉴定霉菌的种类，精准评判粮谷及制品中受霉菌污染的风险；
进一步优选的，所述实时荧光PCR反应体系，每25μL反应体系中包含：2×PremixExTaqTM 12.5μL，10μmol/L正向引物0.5μL，10μmol/L的反向引物0.5μL，5μmol/L荧光探针1μL，RoxPeference DyeⅡ0.5μL，100μg/mL模板DNA 2μL，灭菌双蒸水8μL。
进一步优选的，所述实时荧光PCR反应条件：95℃预变性10s(1个循环)；95℃变性5s，60℃退火/延伸34s(40个循环)，荧光阈值为设备默认值。
本发明另一方面保护所述方法在检测粮谷及制品中霉菌污染的应用。
进一步优选的，所述的应用，其包括对粮谷及制品中霉菌污染的早期预警，预防控制粮谷及制品中霉菌及其毒素的危害。
进一步优选的，所述的应用，其包括应用于粮食储存或者装卸、出仓、入仓、中转、加工等关键场所，进行粮食霉变早期监测预警。
有益效果
1.本发明提供了一种粮食储藏和生产加工场所，应用监测环境气溶胶中霉菌数量与种类，进行粮食霉变早期监测预警的新思路和新方法。
2.本发明所述的生物气溶胶采集方法，采用霉菌计数分析，发现气溶胶中霉菌浓度与粮食霉变样品中霉菌浓度相一致，气溶胶中霉菌浓度与霉变程度呈正相关。
3.本发明采用实时荧光PCR方法，进一步对气溶胶中霉菌种类进行检测，精准鉴定粮食霉变时产生的霉菌种类，精准评判粮谷及制品中受霉菌污染的风险及污染程度。
4.本发明所述的粮谷气溶胶中霉菌的收集及检测技术，应用于粮谷储存和生产加工场所，尤其在装卸、中转、加工等关键环节，可在粮谷发生霉变早期，整体评判粮谷及制品受霉菌污染的风险，实现粮谷中霉菌污染发生前的早期预警，便于相关部门采取干预措施及时有效地防控霉菌危害的产生。
附图说明
图1是根据本发明的气溶胶中5种主要霉菌实时PCR扩增结果；试验结果表明，粮食霉变样品及霉变环境气溶胶中主要霉菌成分检测，主要包括5种霉菌，黄曲霉、烟曲霉、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、赭曲霉。
图2是根据本发明的粮食霉变模拟场所气溶胶中霉菌实时PCR监测结果；试验结果表明，采样器采集的气溶胶中，生物粒子主要都是霉菌，进行霉菌计数；经过实时荧光PCR快速检测，发现玉米储藏场所气溶胶中检出的霉菌种类与霉变粮食样品中检出的霉菌种类一致。10个粮食仓储场所建立的粮食霉变模型中，从霉变粮食储藏环境气溶胶中分离检测出56株霉菌，从霉变粮食中也分离检测出54株霉菌，经实时荧光PCR方法验证，两种样品中检测出的霉菌种类高度相似。
图3是根据本发明的粮食霉变模拟场所气溶胶中黄曲霉菌实时PCR鉴定结果；试验结果表明，在粮食霉变模拟场所气溶胶中分离得到的霉菌中鉴定出有17株黄曲霉菌。
图4是根据本发明的粮食霉变模拟场所霉变粮食样品中黄曲霉菌实时PCR鉴定结果；试验结果表明，在粮食霉变模拟场所霉变粮食样品中分离得到的霉菌中鉴定出来有15株黄曲霉菌。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明中，除非另有其他明确说明，否则百分比、百分含量均以质量计。如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。
实施例1玉米霉变模型建立及霉菌数量测定
1.1建立霉菌模拟污染玉米模型，建立500g粮食的模拟试验仓，玉米霉变模拟仓，向粮食表面喷洒无菌水，充分润湿后用塑料薄膜密封，5天后进行检测。
1.2每天参照GB/T4789.15-2016方法，称取500g玉米样品进行霉菌计数，参照GB/T4789.16-2016方法进行霉菌种类鉴定。
1.3使用气溶胶自动监测仪在密闭空间中采集霉变样品气溶胶，气溶胶样品经过30℃培养，同样参照GB/T4789.15-2016和GB/T4789.16-2016方法进行霉菌计数和种类鉴定。
研究发现，霉变初期，霉菌的生理作用非常微弱，可检测的气溶胶气体浓度相对较低；随着时间的不断上升，霉菌也进入快速生长时期，此时气溶胶浓度也快速升高；当粮食中霉菌生长过程进入后期时，环境中气溶胶浓度逐渐趋于稳定；说明霉变数量越多，霉菌的生长也越旺盛，气溶胶浓度与霉变程度呈正相关。
实施例2粮食霉变程度与气溶胶中霉菌浓度的相关性试验
取25克霉变样品进行霉菌计数，同时进行霉变粮食气溶胶中霉菌收集和培养计数。用10mL沙氏液体培养基采集粮食霉变环境气溶胶中霉菌，用孟加拉红琼脂培养基培养，30℃培养5天并计数。记录每天霉变样品中的霉菌数量，同时记录霉变气溶胶样品中的霉菌数量。
表1霉变样品和气溶胶样品中霉菌数量变化
Figure BDA0003397426770000071
本发明提供一种粮食霉变监测的霉菌计数方法，同时对气溶胶中收集到的霉菌和霉变样品中的霉菌进行计数，判断气溶胶中霉菌浓度与霉变样品中的霉菌浓度是否相同，进而判断气溶胶中霉菌检测是否可以真实反映样品的霉变程度。
分析表1中数据，霉变发生早期，霉菌的生理作用非常微弱，生长比较缓慢，霉变样品和环境气溶胶中的霉菌数量，气溶胶气体浓度都比较低。随着温度和湿度的增加，随着时间的不断增加，霉菌也进入快速生长期，样品和气溶胶中霉菌浓度同步升高，两者浓度呈正相关。当粮食中霉菌生长过程进入后期时，环境中气溶胶浓度逐渐趋于稳定；说明霉变数量越多，霉菌的生长也越旺盛，气溶胶浓度与霉变程度呈正相关，气溶胶中霉菌计数结果与霉变粮食样品中的霉菌计数呈正相关，两组数据进行t检验，P值为0.526(P值>0.05)，说明两组数据没有显著性差异。试验结果证明气溶胶中的霉菌浓度增加可以反映霉变程度。分析所得到的监测数据支持本发明提出的通过收集监测粮食储存场所的气溶胶中霉菌，进行粮食霉变早期预警及监测的新思路和新方法。
实施例3气溶胶及粮食霉变样品中主要霉菌实时荧光PCR检测方法建立
3.1引物和探针设计
根据粮食霉变中主要霉菌，黄曲霉、烟曲霉、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、赭曲霉的特异性种属鉴定基因设计引物和探针，在GenBank上进行blast比对确定引物和探针的特异性，引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。引物与探针序列见表2。
表2实时荧光PCR引物和探针序列
Figure BDA0003397426770000081
3.2提取霉菌基因组DNA
取50μL微生物裂解缓冲液加到灭菌EP管中。挑取孟加拉红琼脂上的霉菌单菌落，放入EP管中搅拌混匀。80℃，15min，2000r/min低速离心，吸取5μL上清液作为反应模板。
3.3霉菌实时荧光PCR检测
3.3.1实时荧光PCR反应体系
25μL反应体系：PremixExTaqTM(2×)12.5μL，正向引物(10μmol/L)0.5μL，反向引物(10μmol/L)0.5μL，探针(5μmol/L)1μL，RoxPeferenceDyeⅡ0.5μL，模板DNA(100μg/mL)2μL，灭菌双蒸水8μL。
3.3.2实时荧光PCR反应条件：
95℃预变性10s(1个循环)；95℃变性5s，60℃退火/延伸34s(40个循环)，荧光阈值为设备默认值。
3.4气溶胶中主要霉菌实时荧光PCR检测结果
按照3.3.1反应体系和3.3.2反应条件，进行粮食霉变样品及霉变环境气溶胶中主要霉菌成分检测，发现粮食霉变气溶胶中主要有5种霉菌，黄曲霉、烟曲霉、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、赭曲霉的实时荧光PCR检测结果如图1所示。
实施例4不同粮食储藏场所模拟粮食霉变监测气溶胶验证结果
本发明分别在大连市10个粮食储藏及生产加工场所，建立了10个粮食霉变模拟仓。按照实施例1的方法，分别建立霉菌模拟污染玉米、大米、小麦、杂粮等粮食霉变模型。按照实施例2的方法，进行粮食霉变程度与气溶胶中霉菌浓度的相关性试验。按照实施例3的方法，进行粮食霉变气溶胶中霉菌计数和实时荧光PCR检测，分析粮食霉变程度及主要霉菌种类。同时检测霉变样品中的主要霉菌类型。分析监测结果，10个粮食霉变模拟场所环境气溶胶中分离出来主要霉菌数量较多，粮食霉变模拟场所环境气溶胶霉菌监测结果如图2所示。验证结果表明，10个粮食仓储场所建立的粮食霉变模型中，从霉变粮食储藏环境气溶胶中分离检测出56株霉菌，从霉变粮食中也分离检测出54株霉菌，检测结果如图2所示。本发明用实时荧光PCR方法对检测出的霉菌进行种类鉴定，种类鉴定试验结果表明，在霉变粮食储藏环境气溶胶中分离得到的霉菌中鉴定出有黄曲霉17株、烟曲霉9株、禾谷镰刀菌11株、轮枝镰刀菌12株、赭曲霉7株，其中17株黄曲霉菌鉴定结果如图3所示；在霉变粮食样品中分离得到的霉菌中鉴定出来有黄曲霉15株、烟曲霉9株、禾谷镰刀菌11株、轮枝镰刀菌12株、赭曲霉7株，其中15株菌黄曲霉菌鉴定结果如图4所示。经实时荧光PCR方法验证，两种样品中检测出的霉菌种类高度相似。
总之，分析上述4个实施例的检测数据表明，本发明提出的一种收集检测粮食储存场所的环境气溶胶中的霉菌，进行粮食霉变早期预警及监测的新方法。在粮食储藏与生产加工场所中收集环境气溶胶中的霉菌，研究霉菌活动与粮食霉变的关系，进行粮食霉变早期预警及监测的新思路和新方法，对于粮食霉变早期监测及预警具有准确、快速、灵敏的特点。具体方法涉及应用生物气溶胶监测仪，采集储藏粮食由于霉变在环境空气中所产生的气溶胶中霉菌，进行气溶胶中霉菌计数，同时快速分析粮食霉变产生气溶胶中的霉菌种类，建立霉菌分子生物学快速鉴定方法，通过收集监测粮食储存场所的环境气溶胶中霉菌，进行粮食霉变早期预警及监测。本发明建立的应用气溶胶早期预警粮食霉变的方法，准确率高，灵敏稳定性好，明显优于传统的粮谷中真菌培养鉴定检测方法及电子鼻、CO2监测等方法，实现粮食霉变的早期预警检测。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Figure BDA0003397426770000111
Figure BDA0003397426770000121
Figure BDA0003397426770000131
Figure BDA0003397426770000141
Figure BDA0003397426770000151
序列表
<110> 大连民族大学
大连海关技术中心
<120> 一种检测粮食储存环境气溶胶中的霉菌监测粮食霉变的新方法及应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 霉菌(mould)
<400> 1
gccgcggaga aggtagttca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 霉菌(mould)
<400> 2
tcgcatttca gctgggttcc 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 霉菌(mould)
<400> 3
acggcaccga cgctatcgca atcca 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 霉菌(mould)
<400> 4
cattaacttc gccgtcgcct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 霉菌(mould)
<400> 5
ctcggggaac aagagggcta 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 霉菌(mould)
<400> 6
tcagcaagta gccatcctgc gcgca 25
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 霉菌(mould)
<400> 7
ttgcagcaga cgaaaggcaa 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 霉菌(mould)
<400> 8
gcataccatg ccagcacctt 20
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 霉菌(mould)
<400> 9
acctccgagt tggaatgtgc cttcgcc 27
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 霉菌(mould)
<400> 10
gtggtatcac catcgata 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 霉菌(mould)
<400> 11
gtggtatcac catcgata 18
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 霉菌(mould)
<400> 12
actcctcgct actatgtcac cg 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 霉菌(mould)
<400> 13
gtggtatcac cattgatatc 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 霉菌(mould)
<400> 14
agtcgtgtta gtatgagaa 19
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 霉菌(mould)
<400> 15
ctcctcgcta ctatgtcacc gtc 23

Claims (10)

1.一种检测粮食储存环境气溶胶中的霉菌监测粮食霉变的新方法，其特征在于，包括如下步骤：在验证了粮食储存环境的气溶胶中霉菌组分与同一环境下的已污染霉菌的粮食参考样品中的霉菌数量和种类具有正相关性基础上；通过采集粮食环境中的微生物气溶胶，根据气溶胶中霉菌培养计数结果和实时荧光PCR方法检测结果，判断粮谷及其制品中霉菌污染情况。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述采集粮食环境中的生物气溶胶是通过生物气溶胶自动监测仪采集；且采用GB/T4789.15-2016和GB/T4789.16-2016方法进行霉菌计数和种类鉴定。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述利用检测气溶胶中霉菌监测粮食霉变的方法还包括如下步骤：将收集到的气溶胶采集液，采用霉菌琼脂培养基30℃培养5d，进行霉菌计数。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述霉变样品同一环境中气溶胶中产毒素霉菌主要包括黄曲霉、烟曲霉、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、赭曲霉。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述利用实时荧光PCR技术检测气溶胶中霉菌的方法还包括如下步骤：将收集到的气溶胶采集液置于30℃培养过夜，用0.45μm的无菌滤膜过滤，将微生物富集到无菌滤膜上；采用CTAB法或霉菌DNA提取试剂盒提取滤膜上霉菌总DNA作为检测模板。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述荧光PCR方法采用的引物和荧光探针如SEQ ID NO.1-15所述。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述实时荧光PCR反应体系，每25μL反应体系中包含：2×PremixExTaqTM 12.5μL，10μmol/L正向引物0.5μL，10μmol/L的反向引物0.5μL，5μmol/L荧光探针1μL，RoxPeference DyeⅡ0.5μL，100μg/mL模板DNA 2μL，灭菌双蒸水8μL。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：实时荧光PCR反应条件：95℃预变性10s，1个循环；95℃变性5s，60℃退火/延伸34s；40个循环，荧光阈值为设备默认值。
9.如权利要求1所述方法在检测粮谷及制品中霉菌污染的应用，其特征在于：包括对粮谷及制品中霉菌污染的早期预警，预防控制粮谷及制品中霉菌及其毒素的危害。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：包括应用于粮食储存或者装卸、出仓、入仓、中转、加工场所。
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