CN104878116A - 一种食品中致病菌定量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品中致病菌定量检测方法，所述方法是将非特异性扩增培养、多点实时定量采样及特异性实时定量PCR鉴定技术结合起来，并根据PCR结果进行Ct值的测定，然后根据具体的Ct值进行数据分析，该方法能够精确地在短时间内判断出食品中致病菌的污染程度、活菌和死菌情况、致病菌活性状况及污染历史，为进一步毒素测定提供指导作用；此外还可同时测定同一样品中共存的多种致病菌，实现了高通量化；本发明还提供了根据上述方法获得的检测试剂盒，为生产中的实际应用提供了极大方便。

Description

一种食品中致病菌定量检测方法
技术领域
本发明涉及食品微生物检测领域，具体涉及一种食品微生物的快速检测方法，尤其涉及一种食品中致病菌的定量检测方法。
背景技术
食品安全是一个世界性的影响人类健康的重大问题，其与人类生存环境和社会稳定息息相关。其中细菌性食物中毒的危害最为严重，感染者轻可造成发热、头痛、腹痛、腹泻和呕吐，重则会出现肌肉痉挛，甚至休克直至死亡，因此微生物的检验成为食品检测必不可少的重要组成部分，是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。通过食品微生物检验，还可以判断食品加工卫生环境，能够对食品被细菌污染的程度做出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人畜食物中毒的防治措施。
据统计，目前导致细菌性食物中毒的细菌种类中，最常见的主要是沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠杆菌等等。针对这些细菌及其他易危害人体健康的食品微生物，现有的检测方法主要依赖于微生物富集培养-选择性分离-生化鉴定方法，该方法存在手工操作繁琐费时、检测灵敏度低、易出现假阴性等缺陷，且卫生指导反馈慢，给商品生产和流通带来一定的影响。此外还有常用的免疫学方法和基因探针法，前者虽能弥补传统方法的一些不足，但也有误差大、周期长的局限性；而后者也存在检测费用昂贵、实验步骤多且费时的缺点。因此研究食品微生物快速、准确、经济的检测方法以预防和控制食品安全事件的发生，具有重要的现实意义。
针对上述问题，近年来微生物学专家和工程技术人员密切合作，采用了各种物理化学及生物技术对如何快速准确经济的鉴定微生物进行了研究分析，如采用了光散射技术、发光技术、色谱技术、电气电子技术、免疫技术及放射技术等，并基于上述分析技术发明了许多定性或定量鉴定微生物的分析方法。常见的有：(1)检测某些细菌的专有酶及代谢产物进行快速鉴定；(2)应用免疫学方法检测微生物抗原或抗体，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CIA)、生物发光免疫分析(BIA)等；(3)细菌毒素的快速检测；(4)细菌对抗菌药物的敏感性试验的快速检测；(5)分子生物学技术在检测微生物中的应用，如核酸探针(Nuclear acid probe)、聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)、基因芯片技术(microarray)等；(6)快速检测细菌生化反应及成套鉴定系统；(7)病原微生物的自动化系统，其中最有代表性的是AMS微生物自动分析系统。
目前应用最多的是采用多重PCR方法来进行食品中微生物的检测，例如杨国兴在多重PCR检测肉及肉制品中四种食源性致病菌的研究中，根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、沙门氏菌的侵染性质粒抗原B基因ipaB、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH、单核增生李斯特氏菌的内化素A基因inlA设计了四对特异性引物，进行多重PCR反应，可同时实现对四种食源性致病菌的检测；试验过程中对多重PCR反应体系中引物添加量、镁离子浓度、dNTP混合物添加量及退火温度和循环数等影响要素进行优化，确定了适宜的多重PCR反应体系和扩增程序(参见杨国兴，“多重PCR检测肉及肉制品中四种食源性致病菌的研究”，中国优秀硕士学位论文数据库，2008年6月10日)；另外，苏裕心在建立几种食源性致病菌荧光定量PCR的检测方法时，采用通过lambda噬菌体DNA标准物质候选物的制备研究，进行金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌、沙门氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌DNA基因组定量标准物质的制备研究；并利用SmartCycler系统建立一种高敏、特异、简便、快速的qPCR检测金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌、沙门氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌的方法，并在LightCycler2.0，ABI 7300仪器上对所建立的体系进行评估(参见苏裕心，“几种食源性致病菌荧光定量PCR检测方法的建立”，中国优秀硕士学位论文数据库，2010年5月26日)。从目前的研究来看，对于食品微生物进行多重PCR检测时，主要集中在对PCR程序的改进上，其存在微观、不易操作的缺陷，并对设备和实验室的要求比较高，而且容易出现假阳性和假阴性样本。
目前也有一些研究证实，通过调整混合培养基可以有效增殖致病菌，从而有助于定量检测食品中的微生物，例如杨军等研究了多重PCR法对食品中3种致病菌的同时快速检测，其通过调整混合培养基的配比摸索了食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的快速共增菌条件，使得3种致病菌在37℃摇床培养后浓度达到106/mL(参见杨军等，“多重PCR法对食品中3种致病菌的同时快速检测”，中国乳品工业，第38卷第4期，2010年4月25日)。然而，由于该研究只针对上述3种致病菌的检测，其存在一定的局限性，而对于食品中的其它致病菌是否能够进行同时快速检测尚未知否。
上述各种方法与传统检测方法相比，在高效快速方面虽已具有较大的进步，但仍不能适应日益严格的食品质量检测方面的高要求。而且，上述各方法中PCR鉴定方法基本上具备了食品微生物检验新要求的各种条件，但在实际操作中仍会存在假阳性和无法判断微生物活性状态等问题，因此如何寻找一种灵敏度高、特异性好，经济、简便的食品尤其是食品中致病菌的定量检测方法是目前亟待解决的问题。
CN103388031A中公开了一种结合非特异性扩增和多点RTQ-PCR的食品微生物检测方法，虽然其公开了将非特异性扩增培养、多点实时定量采样及特异性实时定量PCR鉴定技术结合起来，并根据PCR结果进行数据分析来检测食品微生物的方法，然而，其所用的非特异性扩增培养基为缓冲蛋白胨水，其对于沙门氏菌的扩增效果较好，但对于其它微生物的扩增效果却有限，因此，有必要寻找一种适合同时扩增多种食品微生物并使其均达到良好扩增效率的非特异性扩增培养基；另外，该方法中对于最优的非零时刻的选取并不明确，其分别在3h、6h、9h和24h进行了检测，在表1中列举了6h、8h、10h和12h所对应的Ct值，尽管从表1中可以看出Ct值成下降趋势，然而，其首先并未明确在哪个非零时刻的选取可以同时使各种微生物的扩增实现最大效率，另外，更没有明确Ct值选取何值时可以判定食品中含有致病菌，甚至致病菌中活菌和死菌的情况，因此，如何明确上述问题也是目前急需解决的一个问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种食品中致病菌的定量检测方法，特别提供了一种在短时间内判断出食品中致病菌的污染程度、活菌比例、致病菌活性状况及污染历史的定量检测方法，通过该方法可以由目前使用的7天的细菌培养方法缩短至24小时；准确度由目前的生理生化标准提高至分子水平；灵敏度可以达到单个菌；准确度和特异性都可以在99％以上。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种食品中致病菌定量检测方法，其包括以下步骤：
(1)扩增步骤：将疑似含有目标致病菌的样品通过非特异性培养进行致病菌的扩增；
(2)实时定量取样步骤：在步骤(1)所述扩增过程中取样两次，第一次取样是在培养阶段的零时刻进行，第二次取样是在培养阶段的第8-24h时进行；并将取样所得样品中的致病菌迅速灭活或冻存；
(3)特异性实时定量PCR鉴定步骤：对步骤(2)中实时定量取样所得样品进行直接特异性实时定量PCR或DNA提取后，对提取出的DNA进行特异性实时定量PCR鉴定分析；和
(4)根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值进行数据处理并分析结果的步骤。
本发明的上述步骤缺一不可。其中，步骤(1)的非特异性培养基可高效培养并保证扩增所有污染菌，可用于多种菌的同时检测；步骤(2)的定量取样可以同时鉴定和区别活菌和死菌污染，这是本发明的重点之一；步骤(3)的PCR方法是最灵敏和特异的检测方法，采用PCR鉴定，可以不用特异培养，省时，而且同时测定多种致病菌；步骤(4)的所得Ct值可以有效判断出食品中致病菌的污染程度、活菌比例、致病菌活性状况及污染历史，经过对Ct值的精确选取，使得整个检测方法具有简单、直观，准确性和特异性高等优点，灵敏度可以达到单个菌。同时利用探针法的荧光定量PCR可以对多种致病菌同时检测，满足食品致病菌的国家检测标准要求。
本发明中，由于采用的是广谱培养，如果培养时间过长，杂菌大量扩增会影响待测菌的生长，因此，需要将培养时间控制在一定范围内。本发明采用在扩增过程中只取样两次，并且第二次取样选取在培养阶段的第8-24h时进行，尤其是在18h时进行第二次取样，该时段取样所得到的目标致病菌不仅可以实现扩增最大值，避免了菌与菌之间的生长相互干扰，同时还实现了对食品中致病菌的污染程度、活菌比例、致病菌活性状况及污染历史的精确检测；另外，只采取两次取样，大大简化了检测步骤，降低了成本。
本发明中，所述非特异性培养通过改良的非特异性培养基实现，该非特异性培养基是对致病菌营养成分齐全，无抑制成分，因此可在短期内有效修复并扩增所有污染致病菌，使所有活性污染微生物在此培养基存在的培养条件下迅速恢复活力并可以按一定速度扩增。该非特异性培养基可以是但不限于目前致病菌培养中通用的培养基；例如可以为巯基乙酸盐培养基、LB液体培养基或月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤中的任意一种；但优选的非特异性培养基组成为：蛋白胨、牛肉浸粉和氯化钠；其中优选地，所述蛋白胨浓度为5-20g/L，所述牛肉浸粉浓度为2-5g/L，所述氯化钠浓度为5-20g/L。与其它非特异性培养基尤其是与缓冲蛋白胨水(BPW)相比，由蛋白胨、牛肉浸粉和氯化钠组成的非特异性培养基可以有效实现多种致病菌的同时扩增，并且可以有效避免菌与菌之间的生长相互干扰，使各致病菌的扩增达到最大效率。
本发明所述非特异性培养基中，其中，所述蛋白胨的浓度为5-20g/L，例如可以是5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、1g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L，优选为5-18g/L，进一步优选为5g/L；所述牛肉浸粉浓度为2-5g/L，例如可以是2g/L、2.2g/L、2.5g/L、2.8g/L、3g/L、3.2g/L、3.5g/L、3.8g/L、4g/L、4.5g/L、5g/L，优选为3-5g/L，进一步优选为5g/L；所述氯化钠浓度为5-20g/L，例如可以是5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、1g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L，优选为5-18g/L，进一步优选为5g/L。
本发明进一步优选的非特异性培养基组成为：每升培养基中含有5-18g蛋白胨、3-5g牛肉浸粉和5-18g氯化钠；最优选的非特异性培养基组成为：每升培养基中含有5g蛋白胨、5g牛肉浸粉和5g氯化钠。
本发明中，对步骤(1)所述目标致病菌不作特别限定，例如可以为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌或粪便链球菌中的任意一种或至少两种的组合，也可以是本领域常见的其它食品中的致病菌。
本发明中，步骤(2)所述第二次取样在培养阶段的第8-24h时进行，例如可以是在第8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h时进行取样，优选为第15-20h时进行，进一步优选为第18h时进行第二次定量取样。
本发明优选18小时取样也考虑到既有充分时间使致病菌扩增但又不能因为时间过长导致菌与菌之间的生长相互干扰。
本发明所述的取样方式中，由于取样时间点包括培养阶段的零时刻及致病菌增长阶段内的至少一个非零时刻，取样代表了样品最初致病菌污染情况和其中活菌的生长情况。其中零时刻取样的样品中包括活性致病菌、死亡致病菌和DNA片段，这些成分在下一步的PCR测试中均可无区别的测得，因此一般PCR无法对上述成分进行判别。而本发明所述方法中由于还在微生物致病菌增长阶段内的一个非零时刻进行了取样，这些取样中不仅含有前述零时刻取样中含有的各原始成分，还包括培养过程中新生长(扩增)的致病菌。因此从后续的实时定量PCR中对零时刻及非零时刻所得取样中目标致病菌的定量分析可以测定出活性致病菌的生长情况，同时对比初始致病菌含量可以得到死亡致病菌和活性致病菌在原始致病菌中所占的比例，这些数据均对后续的毒素测定具有非常重要的指导意义。
在进行结果分析时，若整个培养过程中没有量的增加则可以说明没有活性致病菌存在；若虽没有量的增加，但培养过程中始终存在有高含量的DNA成分，则说明样品中曾经有大量的目标微生物存在且已经死亡，此时应考虑进行毒素测定并鉴定目标微生物与毒素之间的吻合度；若培养过程中自始至终检测到的量均为零，则说明样品中既无活性致病菌也没有死亡致病菌，这种情况可以考虑不做毒素测定。因此本发明所述方法中的定时定量采样步骤中取样时间点的分布中，几个时间点的致病菌的增长量将反映出活性致病菌的生长情况，同时对比初始致病菌含量可得到死亡致病菌和活性致病菌的比例，这些数据均对后续的毒素测定具有指导意义。
本发明中，步骤(3)所述Ct值的测定采用荧光染料法或探针法进行，本发明对该测定方法不作特别限制。
本发明中，所述Ct值有两个，分别为培养阶段的零时刻所对应的Ct1值和培养阶段的第8-24h所对应的Ct2值。
本发明中，所述Ct值用来分析样品中某种活性目标致病菌的初始浓度及扩增过程的状态；和/或，所述Ct值用来分析样品中某种目标致病菌初始浓度中死亡致病菌和活性致病菌的比例，还可同时测定同一样品中共存的多种致病菌，实现了高通量化。
在进行检测时，当所述Ct2值>35时为阴性，表示未检出所述致病菌；当所述Ct2值<32时为阳性，表示检出所述致病菌；当所述Ct2值<32并且所述Ct2值和Ct1值之差△Ct大于4个Ct值(△Ct>4)时，表示检出所述致病菌为活性菌；当所述Ct2值在32-35之间，或所述Ct2值和Ct1值之差△Ct大于1并且小于3个Ct值(1<△Ct<3)时，则需要重复所述步骤(1)的扩增。
本发明通过采用具体的Ct值来进行结果分析，使得结果分析更加方便和直观，而且，通过本发明所设定的Ct标准，可以有效避免检测结果中假阳性和假阴性结果的出现，保证了检测结果的高准确性。
本发明中可以选用不同的特异性引物和特异荧光标记探针实现同时定量检测多种致病菌。
本发明中所述食品为乳制品、肉制品、豆制品或罐头食品中的任意一种，不作特别限制。
作为本发明优选的技术方案，所述检测方法具体包括以下步骤：
(1)扩增步骤：将疑似含有目标致病菌的样品通过非特异性培养进行致病菌的扩增；
(2)实时定量取样步骤：在步骤(1)所述扩增过程中取样两次，第一次取样是在培养阶段的零时刻进行，第二次取样是在培养阶段的第8-24h时进行；并将取样所得样品中的致病菌迅速灭活或冻存；
(3)特异性实时定量PCR鉴定步骤：对步骤(2)中实时定量取样所得样品进行直接特异性实时定量PCR或DNA提取后，对提取出的DNA进行特异性实时定量PCR鉴定分析；和
(4)根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值进行数据处理并分析结果的步骤；所述Ct值用来分析样品中某种活性目标致病菌的初始浓度及扩增过程的状态；和/或，所述Ct值用来分析样品中某种目标致病菌初始浓度中死亡致病菌和活性致病菌的比例；其中，所述Ct值有两个，分别为培养阶段的零时刻所对应的Ct1值和培养阶段的第8-24h所对应的Ct2值。
当所述Ct2值>35时为阴性，表示未检出所述致病菌；当所述Ct2值<32时为阳性，表示检出所述致病菌。
当所述Ct2值<32并且所述Ct2值和Ct1值之差△Ct大于4个Ct值时，表示检出所述致病菌为活性菌。
当所述Ct2值在32-35之间，或所述Ct2值和Ct1值之差△Ct大于1并且小于3个Ct值时，则需要重复所述步骤(1)的扩增。
本发明所述检测方法可用于具体分析样品中某种目标致病菌初始浓度中死亡致病菌和活性致病菌的情况。具体方法为：对于Ct2值<32的阳性样品，还需进行以下检测：(1)测定其零时刻的Ct1值；如果零时刻的Ct1值>35，则说明该致病菌为活菌；(2)如果其零时刻的Ct1值也<35，说明该致病菌中有死菌污染；(3)对于含有死菌污染样品的Ct2值，如果Ct2值和零时刻的Ct1值之差△Ct大于4时，说明同时也有活菌污染；(4)对于含有死菌污染样品的Ct2值，如果Ct2值和零时刻的Ct1值之差△Ct不大于4时，要做2次增菌比较；如果2次增菌样品8-24h时刻的Ct2值比2次增菌前Ct1值降低4个Ct值，表明有活菌污染。
第二方面，本发明还提供了一种用于第一方面所述方法的试剂盒，其包括：非特异性培养基；目标致病菌的DNA提取试剂；能够与目标致病菌DNA相结合的特异性引物对；能够与目标致病菌DNA扩增产物相结合的特异性荧光标记探针；和实时定量PCR鉴定试验用试剂；
其中，所述非特异性培养基为巯基乙酸盐培养基、LB液体培养基或月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤中的任意一种，所述非特异性培养基的组成优选为：蛋白胨、牛肉浸粉和氯化钠；其中所述蛋白胨浓度为5-20g/L，所述牛肉浸粉浓度为2-5g/L，所述氯化钠浓度为5-20g/L；所述目标致病菌为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌或粪便链球菌中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明通过精确选取2个实时定量取样时刻并与特异性实时定量PCR结合，通过所得Ct值可以测定出致病菌初始浓度及增长过程，并提供活性致病菌与死亡致病菌在初始样品中的比例，因此能够精确高效的在短时间内判断出食品污染程度、活菌比例、污染微生物的活性状况及污染历史，其准确度和特异性都在99％以上，为进一步的毒素测定提供指导作用；
(2)本发明是以实际的待测食品为样本，有效针对致病菌为下列但不限定为下列致病菌，包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌或粪便链球菌等，实现了对其中一种甚至一种以上的致病菌的同时检测，实现了高通量化，准确度由目前的生理生化标准提高至分子水平；灵敏度可以达到单个菌；
(3)本发明的检测方法可由目前的7天的细菌培养方法缩短至24小时，该检测方法简单、快速，成本低，可以用于工业化生产。
附图说明
图1为实施例1中的沙门氏菌培养时间和PCR的Ct值的相关曲线。
图2为实施例1中根据致病菌培养到达特定Ct值的时间和食品中含有的致病菌的初始浓度所制定的食品中致病菌最初浓度的标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明所述食品中致病菌定量检测方法中，所述Ct值有两个，分别为培养阶段的零时刻所对应的Ct1值和培养阶段的第8-24h所对应的Ct2值。
当所述Ct2值>35时为阴性，表示未检出所述致病菌；当所述Ct2值<32时为阳性，表示检出所述致病菌。
当所述Ct2值<32并且所述Ct2值和Ct1值之差△Ct大于4个Ct值时，表示检出所述致病菌为活性菌。
当所述Ct2值在32-35之间，或所述Ct2值和Ct1值之差△Ct大于1并且小于3个Ct值时，则需要重复所述步骤(1)的扩增。
对于Ct2值<32的阳性样品，还需进行以下检测：(1)测定其零时刻的Ct1值；如果零时刻的Ct1值>35，则说明该致病菌为活菌；(2)如果其零时刻的Ct1值也<35，说明该致病菌中有死菌污染；(3)对于含有死菌污染样品的Ct2值，如果Ct2值和零时刻的Ct1值之差△Ct大于4时，说明同时也有活菌污染；(4)对于含有死菌污染样品的Ct2值，如果Ct2值和零时刻的Ct1值之差△Ct不大于4时，要做2次增菌比较；如果2次增菌样品8-24h时刻的Ct2值比2次增菌前Ct1值降低4个Ct值，表明有活菌污染。
实施例1
通过非特异性扩增培养、多点实时定量采样及特异性实时定量PCR鉴定技术测定沙门氏菌的生长情况及其初始浓度下活菌和死菌的比例，其具体步骤如下所示：
分别取25mL含沙门氏菌3cfu、33cuf和333cfu/25mL的样品放入分别盛有225mL的非特异培养基中，每升非特异培养基的组成为：5g蛋白胨，5g牛肉浸粉，5g氯化钠，进行均质2min，用1mol/mL无菌NaOH溶液调pH至6.8。无菌操作条件下将上述处理好样品转至500mL锥形瓶中，同时取1mL留样A(即为培养0h时的留样)，并将锥形瓶置于36℃下培养24h，并在培养过程中分别在3h、6h、8h、10h、12h、16h时各留样1mL为B、C、D、E、F和G。将上述样品均以10000r/min离心5min后移去上清液，对所得沉淀中的DNA采用DNA提取试剂盒进行DNA提取(BTA公司生产的试剂盒)，具体提取方法参见该DNA提取试剂盒的使用说明。将提取出的DNA各取1μL进行实时定量PCR分析，该PCR分析中采用沙门氏菌的特异性引物，现有的常用扩增引物即可。反应完成后进行数据处理，可根据Ct值计算细菌的存在和增长情况，其中数据处理过程为本领域技术人员熟知的处理方法。不同浓度以及不同测试时间下所获得的Ct值结果如表1所示，可见随培养时间的增加，菌落数呈增加趋势，PCR的Ct值呈下降趋势。
表1
测试时间 3cfu/25ml 33cfu/25ml 333cfu/25ml
3h 无 无 无
6h 无 无 32.94
8h 无 32.35 28.85
10h 33.41 28.82 25.56
12h 30.72 25.8 23.23
16h 25.47 21.07 19.31
根据表1的结果可以得到图1的沙门氏菌培养时间和定量PCR的Ct值的相关曲线。图1中的3条直线从上至下是3个由低至高不同浓度(3cfu/25mL、33cfu/25mL和333cfu/25mL)的致病菌污染样品的培养时间和定量PCR的Ct值之间的关系；其中3个公式是上述由上至下3条曲线的直线方程和相关系数。从图1可以看出，细菌污染程度高的样品在一定的培养时间内定量PCR的Ct值相应有小，Ct值随培养时间的延长而减小。从相关曲线可以得出到达特定Ct值所需的培养时间，最终可以根据致病菌培养到达特定Ct值的时间和食品样品中含有的致病菌的初始浓度，从而制定食品中致病菌最初浓度的标准曲线，如图2所示。
实施例2
分别取25mL金黄色葡萄球菌浓度为10cfu和100cuf/25mL的冰激凌样品放入分别盛有225mL的非特异培养基中，每升非特异培养基的组成为：5g蛋白胨，5g牛肉浸粉，5g氯化钠；进行均质2min，用1mol/mL无菌NaOH溶液调pH至6.8。无菌操作条件下将上述处理好样品转至500mL锥形瓶中，同时取1mL留样A(即为培养0h时的留样)，并将锥形瓶置于36℃下培养24h，并在培养过程中分别在6h、8h、10h、16h、18h、20h、24h时各留样1mL为B、C、D、E、F、G和H，不同浓度以及不同测试时间下所获得的Ct值结果如表2所示。
将上述样品均以10000r/min离心5min后移去上清液，对所得沉淀中的DNA采用DNA提取试剂盒进行DNA提取(BTA公司生产的试剂盒)，具体提取方法参见该DNA提取试剂盒的使用说明。将提取出的DNA各取1μL进行实时定量PCR分析，该PCR分析中采用沙门氏菌的特异性引物，现有的常用扩增引物即可。反应完成后进行数据处理，可根据Ct值计算细菌的存在和增长情况，其中数据处理过程为本领域技术人员熟知的处理方法。
表2
培养时间(h) A组冰激凌(10cfu/225mL) B组冰激凌(100cfu/225mL)
6 无 无
8 无 无
10 34.75 31.27
16 26.86 22.64
18 25.17 20.85
20 25.59 21.05
24 24.67 20.29
实施例3
定量检测食品中致病菌的方法，具体步骤为：
(1)将经计数后稀释的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌0157各100μL加入250mL的非特异性培养基中，所述非特异培养基每升的成份为5g蛋白胨，5g牛肉浸粉，5g氯化钠；进行37℃培养。通过分离培养基培养、计数，在培养18h后，检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌0157的浓度，细菌之间相互之间没有抑制作用。
(2)分别针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌，基因特异性引物序列，扩增片段；将3对引物等量混合，使混合物中每条引物的浓度均为0.5umol/L，进行PCR扩增，确定其反应条件为94℃预变性10min，40个循环的94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，以及72℃延伸7min。
(3)将金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌0157于各自分离培养基上计数后进行10倍梯度稀释，分别提取各稀释度细菌的基因组DNA，按最适条件进行多重PCR反应以确定该方法对各致病菌的检测限。
(4)用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌0157的不同标准菌株或自分离菌株随机组合，经18h快速同时增菌后进行优化条件下的多重PCR检测，并对检测结果与实际污染情况比对，进行统计分析。食品人为污染的致病菌的检出率均为100％，均无一例假阴性和假阳性结果，并且检出限均达到1CFU/uL。
实施例4
(1)将经计数后稀释的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌0157各100μL加入25mL牛奶中，并将此人工污染的牛奶加入225mL的非特异性培养基中，该非特异性培养基的组成为：每升培养基的成份为5g蛋白胨，5g牛肉浸粉，5g氯化钠；37℃培养，通过分离培养基培养、计数，在培养18h后，金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌0157的浓度相互之间没有抑制作用。
(2)分别针对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌基因特异性引物序列，扩增片段；将3对引物等量混合，使混合物中每条引物的浓度均为10umol/L，进行PCR扩增，确定其反应条件为94℃预变性10min，40个循环的94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，以及72℃延伸7min。
(3)将在牛奶中经PCR扩增的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌0157于各自分离培养基上计数后进行10倍梯度稀释，分别提取各稀释度细菌的基因组DNA，按最适条件进行多重PCR反应以确定该方法对各致病菌的检测限。
(4)用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌0157的不同标准菌株或自分离菌株随机组合，人为污染市售的41份巴氏杀菌乳、52份酸奶和38份含乳饮料样本，经18h快速同时增菌后进行优化条件下的多重PCR检测，并对检测结果与实际污染情况比对，进行统计分析。
采用自样检测的方式，对上述致病菌污染的食品进行批量检测，其中，对于巴氏杀菌乳、酸奶和含乳饮料样本中，人为污染的致病菌的检出率分别为100％、100％和100％，均无一例假阴性和假阳性结果，并且检出限均达到1CFU/uL。
实施例5
(1)将经计数后稀释的单增李斯特菌、铜绿假单胞菌和粪便链球菌各100μL加入250mL的非特异性培养基中，该非特异培养基每升的成份为10g蛋白胨，3g牛肉浸粉，5g氯化钠；37℃培养，通过分离培养基培养、计数，在培养18h后，单增李斯特菌、铜绿假单胞菌和粪便链球菌的浓度相互之间没有抑制作用。
(2)分别针对单增李斯特菌、铜绿假单胞菌和粪便链球菌，利用其基因特异性引物序列，扩增片段；将3对引物等量混合，使混合物中每条引物的浓度均为10umol/L，进行PCR扩增，确定其反应条件为94℃预变性10min，40个循环的94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，以及72℃延伸7min。
(3)将在牛奶中经PCR扩增的单增李斯特菌、铜绿假单胞菌和粪便链球菌于各自分离培养基上计数后进行10倍梯度稀释，分别提取各稀释度细菌的基因组DNA，按最适条件进行多重PCR反应以确定该方法对各致病菌的检测限。
(4)用单增李斯特菌、铜绿假单胞菌和粪便链球菌的不同标准菌株或自分离菌株随机组合，人为污染市售的41份巴氏杀菌乳、52份酸奶和38份含乳饮料样本，经18h快速同时增菌后进行优化条件下的多重PCR检测，并对检测结果与实际污染情况比对，进行统计分析。
采用自样检测的方式，食品人为污染的致病菌的检出率均为100％，其中均未出现假阳性结果，并且检出限为3CFU/uL。
实施例6
(1)将经计数后稀释的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌和粪便链球菌各100μL加入25mL牛奶中，并将此人工污染的牛奶加入225mL的非特异性培养基中进行非特异培养，该非特异培养每升培养基的成份为20g蛋白胨，4g牛肉浸粉，5g氯化钠；37℃培养，通过分离培养基培养、计数，在培养18h后，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌和粪便链球菌的浓度分别为相互之间没有抑制作用。
(2)分别针对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌和粪便链球菌，利用Blast和Primer Express(ABI)软件考察其基因特异性并确定引物序列，扩增片段；将3对引物等量混合，使混合物中每条引物的浓度均为10umol/L，进行PCR扩增，确定其反应条件为94℃预变性10min，40个循环的94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，以及72℃延伸7min。
(3)将在牛奶中经PCR扩增的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌和粪便链球菌于各自分离培养基上计数后进行10倍梯度稀释，分别提取各稀释度细菌的基因组DNA，按最适条件进行多重PCR反应以确定该方法对各致病菌的检测限。
(4)用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌和粪便链球菌的不同标准菌株或自分离菌株随机组合，人为污染市售的41份巴氏杀菌乳、52份酸奶和38份含乳饮料样本，经18h快速同时增菌后进行优化条件下的多重PCR检测，并对检测结果与实际污染情况比对，进行统计分析。
采用自样检测的方式，食品人为污染的致病菌的检出率分别为100％、100％和100％，并且检出限为4CFU/uL。
实施例7
(1)将经计数后稀释的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌和粪便链球菌0157各100μL加入250mL的培养基中进行非特异培养，该非特异培养每升培养基的成份为12g蛋白胨，5g牛肉浸粉，20g氯化钠；37℃培养，通过分离培养基培养、计数，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌和粪便链球菌0157的浓度相互之间没有抑制作用。
(2)分别针对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌和粪便链球菌，利用其基因特异性引物序列，扩增片段；将3对引物等量混合，使混合物中每条引物的浓度均为10umol/L，进行PCR扩增，确定其反应条件为94℃预变性10min，40个循环的94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，以及72℃延伸7min。
(3)将在牛奶中经PCR扩增的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌和粪便链球菌于各自分离培养基上计数后进行10倍梯度稀释，分别提取各稀释度细菌的基因组DNA，按最适条件进行多重PCR反应以确定该方法对各致病菌的检测限。
(4)用沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌和粪便链球菌的不同标准菌株或自分离菌株随机组合，经18h快速同时增菌后进行优化条件下的多重PCR检测，并对检测结果与实际污染情况比对，进行统计分析。
采用自样检测的方式，食品人为污染的致病菌的检出率分别为100％、100％和100％，其中均未出现假阴性和假阳性结果，并且检出限为1CFU/uL。
对比例1
与实施例4的不同在于其非特异性培养基的组成为GN培养基和质量分数7.5％的NaCl肉汤的体积比为1:2，其它与实施例4相同。
采用自样检测的方式，对所述致病菌污染的食品进行批量检测，其中，对于巴氏杀菌乳、酸奶和含乳饮料样本中，人为污染的致病菌的检出率分别为98％、95％和95％，其中巴式杀菌乳和酸奶均出现6％假阳性结果，并且检出限为15CFU/uL。
以下实施例是采用不同培养基进行非特异性培养时对各致病菌的扩增情况。
实施例8
称取25g含沙门氏菌的样品放入盛有225mL的非特异培养基中，每升非特异培养基的组成为：5g蛋白胨，5g牛肉浸粉，5g氯化钠，进行均质2min，用1mol/mL无菌NaOH溶液调pH至6.8。
经37℃振摇培养，通过分离培养基培养、计数，沙门氏菌的浓度为108/mL。
实施例9
称取25g含沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌0157的样品放入盛有225mL的非特异培养基中，每升非特异培养基的组成为：10g蛋白胨，3g牛肉浸粉，8g氯化钠，进行均质2min，用1mol/mL无菌NaOH溶液调pH至6.8。
经37℃振摇培养，通过分离培养基培养、计数，沙门氏菌的浓度为108/mL，金黄色葡萄球菌的浓度为108/mL，大肠杆菌0157的浓度为107/mL。
实施例10
称取25g含单增李斯特菌、铜绿假单胞菌和粪便链球菌的样品放入盛有225mL的非特异培养基中，每升非特异培养基的组成为：5g蛋白胨，5g牛肉浸粉，5g氯化钠，进行均质2min，用1mol/mL无菌NaOH溶液调pH至6.8。
经37℃振摇培养，通过分离培养基培养、计数，单增李斯特菌的浓度为107/mL，铜绿假单胞菌的浓度为108/mL，粪便链球菌的浓度为107/mL。
实施例11
称取25g含金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌和粪便链球菌的样品放入盛有225mL的非特异培养基中，每升非特异培养基的组成为：12g蛋白胨，2g牛肉浸粉，5g氯化钠，进行均质2min，用1mol/mL无菌NaOH溶液调pH至6.8。
经37℃振摇培养，通过分离培养基培养、计数，金黄色葡萄球菌的浓度为108/mL、大肠杆菌0157的浓度为107/mL、单增李斯特菌的浓度为107/mL和粪便链球菌的浓度为107/mL。
对比例2
将实施例8中的非特异性培养基替换为缓冲蛋白冻水，其它条件与实施例8相同。
经37℃振摇培养，通过分离培养基培养、计数，沙门氏菌的浓度为107/mL。
对比例3
将实施例9中的非特异性培养基替换为缓冲蛋白冻水，其它条件与实施例9相同。
经37℃振摇培养，通过分离培养基培养、计数，沙门氏菌的浓度为107/mL，金黄色葡萄球菌的浓度为106/mL，大肠杆菌0157的浓度为106/mL。
对比例4
将实施例10中的非特异性培养基替换为缓冲蛋白冻水，其它条件与实施例10相同。
经37℃振摇培养，通过分离培养基培养、计数，单增李斯特菌的浓度为106/mL，铜绿假单胞菌的浓度为106/mL，粪便链球菌的浓度为105/mL。
对比例5
将实施例11中的非特异性培养基替换为缓冲蛋白冻水，其它条件与实施例11相同。
经37℃振摇培养，通过分离培养基培养、计数，金黄色葡萄球菌的浓度为106/mL、大肠杆菌0157的浓度为106/mL、单增李斯特菌的浓度为105/mL和粪便链球菌的浓度为106/mL。
通过以上实施例可以看出，与其它非特异性培养基尤其是与缓冲蛋白胨水(BPW)相比，本发明的非特异性培养基可以有效实现多种致病菌的同时扩增，并且可以有效避免菌与菌之间的生长相互干扰，使各致病菌的扩增达到最大效率，而且可以实现对食品中致病菌的精确检测；另外，本发明对于Ct值的精确选取，不仅使检测结果分析更加方便和直观，而且，通过本发明所设定的Ct标准，可以有效避免检测结果中假阳性和假阴性结果的出现，保证了检测结果的高准确性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种食品中致病菌定量检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)扩增步骤：将疑似含有目标致病菌的样品通过非特异性培养进行致病菌的扩增；
(2)实时定量取样步骤：在步骤(1)所述扩增过程中取样两次，第一次取样是在培养阶段的零时刻进行，第二次取样是在培养阶段的第8-24h时进行；并将取样所得样品中的致病菌迅速灭活或冻存；
(3)特异性实时定量PCR鉴定步骤：对步骤(2)中实时定量取样所得样品进行直接特异性实时定量PCR或DNA提取后，对提取出的DNA进行特异性实时定量PCR鉴定分析；和
(4)根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值进行数据处理并分析结果的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非特异性培养通过非特异性培养基实现；
优选地，所述非特异性培养基为巯基乙酸盐培养基、LB液体培养基或月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤中的任意一种；
进一步优选地，所述非特异性培养基的组成为：蛋白胨、牛肉浸粉和氯化钠；所述蛋白胨浓度优选为5-20g/L，所述牛肉浸粉浓度优选为2-5g/L，所述氯化钠浓度优选为5-20g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，步骤(1)所述目标致病菌为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌或粪便链球菌中的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述第二次取样是在培养阶段的第15-20h时进行；
优选地，所述第二次取样是在培养阶段的第18h时进行。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述Ct值的测定采用荧光染料法或探针法进行；其中，所述Ct值有两个，分别为培养阶段的零时刻所对应的Ct1值和培养阶段的第8-24h所对应的Ct2值；
优选地，所述Ct值用来分析样品中某种活性目标致病菌的初始浓度及扩增过程的状态；和/或，所述Ct值用来分析样品中某种目标致病菌初始浓度中死亡致病菌和活性致病菌的比例；
优选地，当所述Ct2值>35时为阴性，表示未检出所述致病菌；当所述Ct2值<32时为阳性，表示检出所述致病菌；
当所述Ct2值<32并且所述Ct2值和Ct1值之差△Ct大于4个Ct值时，表示检出所述致病菌为活性菌；
当所述Ct2值在32-35之间，或所述Ct2值和Ct1值之差△Ct大于1并且小于3个Ct值时，则需要重复所述步骤(1)的扩增。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，选用不同的特异性引物和特异荧光标记探针能够同时定量检测多种致病菌。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述食品为乳制品、肉制品、豆制品或罐头食品中的任意一种。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)扩增步骤：将疑似含有目标致病菌的样品通过非特异性培养进行致病菌的扩增；
(2)实时定量取样步骤：在步骤(1)所述扩增过程中取样两次，第一次取样是在培养阶段的零时刻进行，第二次取样是在培养阶段的第8-24h时进行；并将取样所得样品中的致病菌迅速灭活或冻存；
(3)特异性实时定量PCR鉴定步骤：对步骤(2)中实时定量取样所得样品进行直接特异性实时定量PCR或DNA提取后，对提取出的DNA进行特异性实时定量PCR鉴定分析；和
(4)根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值进行数据处理并分析结果的步骤；所述Ct值用来分析样品中某种活性目标致病菌的初始浓度及扩增过程的状态；和/或，所述Ct值用来分析样品中某种目标致病菌初始浓度中死亡致病菌和活性致病菌的比例；其中，所述Ct值有两个，分别为培养阶段的零时刻所对应的Ct1值和培养阶段的第8-24h所对应的Ct2值；
优选地，当所述Ct2值>35时为阴性，表示未检出所述致病菌；当所述Ct2值<32时为阳性，表示检出所述致病菌；
当所述Ct2值<32并且所述Ct2值和Ct1值之差△Ct大于4个Ct值时，表示检出所述致病菌为活性菌；
当所述Ct2值在32-35之间，或所述Ct2值和Ct1值之差△Ct大于1并且小于3个Ct值时，则需要重复所述步骤(1)的扩增；
其中，优选地，以所述△Ct大于4个Ct值时，表示检出所述致病菌。
9.一种用于根据权利要求1-8任一项所述方法的试剂盒，其特征在于，其包括：非特异性培养基；目标致病菌的DNA提取试剂；能够与目标致病菌DNA相结合的特异性引物对；能够与目标致病菌DNA扩增产物相结合的特异性荧光标记探针；和实时定量PCR鉴定试验用试剂；
其中，所述非特异性培养基为巯基乙酸盐培养基、LB液体培养基或月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤中的任意一种，所述非特异性培养基的组成优选为：蛋白胨、牛肉浸粉和氯化钠；其中所述蛋白胨浓度为5-20g/L，所述牛肉浸粉浓度为2-5g/L，所述氯化钠浓度为5-20g/L；所述目标致病菌优选为沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌或粪便链球菌中的任意一种或至少两种的组合。
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