CN114958773A - 快速检测阪崎肠杆菌技术 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了快速检测阪崎肠杆菌技术，特别适用于环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)和胶体金免疫层析技术检测食品中阪崎肠杆菌的残留量。本发明筛选出一株分泌抗阪崎肠杆菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，发现将其应用于环介导等温扩增技术和胶体金免疫层析技术，取得了良好的实验效果。技术要求低，具有快速、简便等优点，解决了传统检测方法时间长，结果可靠性差等问题，适合各级实验室及基层单位推广使用。

Description

快速检测阪崎肠杆菌技术
技术领域
本发明涉及快速检测阪崎肠杆菌技术，特别适用于环介导等温基因扩增技术(LAMP技术)和胶体金免疫层析技术检测食品中阪崎肠杆菌的残留量。
背景技术
致病菌在食品安全中出现的问题越来越多，最近北京某大学就出现了一起由致病菌导致的群体中毒事件。致病菌种类较多，本申请人把目光投到了容易引起婴幼儿尤其是新生儿患病的阪崎肠杆菌。
阪崎肠杆菌(又称阪崎氏肠杆菌)是肠杆菌科的一种，1980年由黄色阴沟肠杆菌更名为阪崎肠杆菌。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50％以上。微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配方粉是发现的主要感染渠道。阪崎氏肠杆菌这病原体一般只感染免疫系统较弱的人士，它对公众健康的影响日渐令人关注。阪崎氏肠杆菌是一种属革兰氏阴性、不会形成孢子而呈棒状的细菌，最适宜在摄氏37度至43度之间生长。阪崎氏肠杆菌可令各年龄组别的人受入侵性感染，但新生儿(出生28天或以下)和不足2个月的婴儿，尤其是早产、体重不足2.5公斤和免疫力较弱的婴儿的风险最高。新生儿(尤其是早产婴儿)的胃的酸性较成年人为低，这可能是阪崎氏肠杆菌可在婴儿体内生存的一个主要因素。感染阪崎氏肠杆菌而引致的菌血症或脑膜炎偶有发生，亦曾小规模爆发。虽然婴儿可在任何年龄出现有关疾病，早产婴儿较多在新生儿期后出现菌血症，足月婴儿则较多在新生儿期出现脑膜炎。上述的不同情况，可能与婴儿在不同时间感染到阪崎氏肠杆菌而非与婴儿易受感染的因素有关。
传统的致病微生物检测方法有国标法和纸片法，这些操作复杂且测试周期长的检测方法无法跟上经济发展的步伐，不能满足我国快速发展的食品行业对食品检测方面的需要，因此，建立一种在婴幼儿奶粉中快速、高效灵敏的检测阪崎肠杆菌的方法是必要的。
本申请筛选出一株分泌抗阪崎肠杆菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，发现将其应用于环介导等温扩增技术和胶体金免疫层析技术，取得了良好的实验效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一株分泌抗阪崎肠杆菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，并将其应用于环介导等温扩增技术和胶体金免疫层析技术，用来快速鉴定阪崎肠杆菌。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一株阪崎肠杆菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为F-4-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2017年6月15日，保藏编号为CGMCCNo.14305。
阪崎肠杆菌单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.14305的阪崎肠杆菌单克隆抗体杂交瘤细胞株F-4-1所分泌产生。
本发明所提供的检测阪崎肠杆菌含量的试纸条，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)；所述反应膜上具有包被有阪崎肠杆菌人工抗原的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有阪崎肠杆菌单克隆抗体-胶体金标记物。
所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次粘贴在底板(7) 上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。
所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
本发明的阪崎肠杆菌快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及竞争抑制免疫层析分析技术，将阪崎肠杆菌单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的阪崎肠杆菌在流动过程中，与结合物释放垫上的阪崎肠杆菌单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成药物-抗体-胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的阪崎肠杆菌人工抗原竞争结合阪崎肠杆菌单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中是否含有阪崎肠杆菌残留。
本发明根据阪崎肠杆菌16-23S基因设计了6条引物，利用环介导等温扩增技术，在65℃等温扩增60分钟，根据显色剂显示的颜色来区分阪崎肠杆菌与非阪崎肠杆菌。
用于快速鉴定阪崎肠杆菌与非阪崎肠杆菌的特异性引物，包括：
内引物1：5’-CCGTGTACGCTTGTTCGCTTAACTCTCTCAAACTCGCAGCAC-3’ (SEQ IDNo.1)；
内引物2：5’-CCTGGCAGTCAGAGGCGATGCGCCGGTTATAACGGTTCA-3’ (SEQ ID No.2)；
外引物1：5’-AAATGCGCGGTGTGTCAG-3’(SEQ ID No.3)；
外引物2：5’-GGTTTCCCCATTCGGACAT-3’(SEQ ID No.4)；
环引物1：5’-GACTTCTTCGGGTTGTGAGG-3’(SEQ ID No.5)；
环引物2：5’-GATTAGCACGTCCTTCATCG-3’(SEQ ID No.6)；
一种快速鉴定阪崎肠杆菌与非阪崎肠杆菌的方法，具体包括如下步骤：
(1)模板DNA的提取：提取待检样品的DNA，所述待检样品为添加阪崎肠杆菌的样本。
(2)环介导等温基因扩增反应：在200μL PCR管配制反应体系：外引物终浓度为0.2μM，内引物、环引物终浓度为0.6μM，1×buffer反应缓冲液，3mM MgSO4，0.5mM dNTP，8U BstDNA聚合酶，样本模板2.5μl，超纯水补足25μL，然后加入30μl的密封液，将上述反应管于 65℃反应60min；
(3)结果判断：在上述反应管中加入1μL显色剂1000×SYBR GREENⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为阪崎肠杆菌，橙色则为非阪崎肠杆菌。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
实施例1阪崎肠杆菌快速检测试纸条的制备
该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：
1)制备喷涂有阪崎肠杆菌单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
2)制备具有包被有阪崎肠杆菌人工抗原的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成试纸条。
1、阪崎肠杆菌单克隆抗体-胶体金标记物的制备
(1)胶体金的制备
用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％(质量分数)，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml 1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
(2)阪崎肠杆菌单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.0，按每毫升胶体金溶液中加入10μg的标准向胶体金溶液中加入阪崎肠杆菌单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入 10％BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积分数)，静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。
复溶缓冲液：含酪蛋白0.02％～0.1％(质量分数)、吐温-80 0.05％～0.2％(质量分数)、pH7.2 的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
2、结合物释放垫的制备
将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.5％)、 pH为7.2、0.5mol/L的磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用Isoflow喷膜仪将制备好的阪崎肠杆菌单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01ml阪崎肠杆菌单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中(湿度＜20％) 60min后取出，置于干燥环境(湿度＜20％)中保存备用。
3、反应膜的制备
将阪崎肠杆菌半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。
包被过程：用磷酸缓冲液将阪崎肠杆菌半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用 Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T线)，包被量为0.8μl/cm；用0.01mol/L、 pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C线)，包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。
4、样品吸收垫的制备
将样品吸收垫置于含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、pH7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。
5、试纸条的组装
将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和质控线，检测线(T线)和质控线(C线)均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸条用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4～30℃条件下可保存12个月。
6、检测限试验
取空白幼儿配方奶粉、米粉、营养快线、奶片、钙奶饼干样本，在其中分别添加阪崎肠杆菌至终浓度为0CFU/100g、1CFU/100g、2CFU/100g、4CFU/100g，取试纸条进行检测，每个样本重复测定三次。
用试纸条检测幼儿配方奶粉、米粉、营养快线、奶片、钙奶饼干样本时，当其中阪崎肠杆菌添加浓度为0CFU/100g时，试纸条上显示出肉眼可见的两条红色线条，呈阴性；当其中阪崎肠杆菌添加浓度为1CFU/100g、2CFU/100g、4CFU/100g时，试纸条质控线显色，检测线不显色，呈阳性，表明本试纸条对幼儿配方奶粉、米粉、营养快线、奶片、钙奶饼干中阪崎肠杆菌的检测限为1CFU/100g。
7、假阳性率、假阴性率试验
取已知阪崎肠杆菌含量大于1CFU/100g的幼儿配方奶粉、米粉、营养快线、奶片、钙奶饼干阳性样本各20份和含量小于1CFU/100g的幼儿配方奶粉、米粉、营养快线、奶片、钙奶饼干阴性样本各20份，用三批试纸条进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1-5。
表1检测幼儿配方奶粉样本结果
Figure RE-GDA0003743811630000051
表2检测米粉样本结果
Figure RE-GDA0003743811630000052
表3检测营养快线样本结果
Figure RE-GDA0003743811630000053
表4检测奶片样本结果
Figure RE-GDA0003743811630000054
表5检测钙奶饼干样本结果
Figure RE-GDA0003743811630000055
Figure RE-GDA0003743811630000061
结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性幼儿配方奶粉、米粉、营养快线、奶片、钙奶饼干样本时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100％，假阴性率为0；检测20份阴性幼儿配方奶粉、米粉、营养快线、奶片、钙奶饼干样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。说明本发明的检测阪崎肠杆菌的试纸条可以对幼儿配方奶粉、米粉、营养快线、奶片、钙奶饼干中阪崎肠杆菌残留进行快速检测。
8、特异性试验
用阪崎肠杆菌试纸条检测5CFU/25g金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、福氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、阴沟肠杆菌、赫氏艾希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、大肠埃希氏菌25922、威氏李斯特CICC21672、绵羊李斯特CICC21633、格氏李斯特CICC21670。结果显示，试纸条质控线和检测线均显色，呈阴性。说明本试纸条对5CFU/25g金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、福氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、阴沟肠杆菌、赫氏艾希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、大肠埃希氏菌25922、威氏李斯特CICC21672、绵羊李斯特CICC21633、格氏李斯特CICC21670均无交叉反应。
实施例2环介导等温基因扩增反应体系及指标测定
一、环介导等温基因扩增反应体系
1.环介导等温基因扩增反应体系的准备：
1)6条引物分别为：
内引物1：
5’-TAGCCAACCGATGTTTCTGTATCAA-ACAATACTACAAAGGTGCTTTCG-3’ (SEQ IDNo.1)；
内引物2：5’-AGAAGTCATTAGCGAACAGGCTAC-GCGTAAGATTCTTGCTCAGTAG-3’ (SEQ IDNo.2)；
外引物1：5’-GTGAGAACGGGACCATCA-3’(SEQ ID No.3)；
外引物2：5’-CTTGTTTTTGTAGGGTTTGGA-3’(SEQ ID No.4)。
环引物1：5’-GACTTCTTCGGGTTGTGAGG-3’(SEQ ID No.5)；
环引物2：5’-GATTAGCACGTCCTTCATCG-3’(SEQ ID No.6)；
2)DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl；
3)dNTP：浓度为25mM
4)MgSO4：浓度为50mM
5)Buffer缓冲液：10×buffer
6)显色剂：荧光染料1000×SYBR Green I。
7)DNA提取液
2.用上述反应体系按以下方法对阪崎肠杆菌与非阪崎肠杆菌进行鉴定。本实验所述待检样品为添加阪崎肠杆菌的奶粉样本。
(1)模板DNA提取：
1)将1ml的样本置于1.5ml离心管；
2)12000r/min离心2min，弃上清；
3)加入80ul DNA提取液，煮沸10min；
4)离心取上清液转移至另一支离心管中作为模板DNA。
(2)环介导等温基因扩增反应：在200μl PCR管配制反应体系：外引物终浓度为0.2μM，内引物、环引物终浓度为0.6μM，1×buffer反应缓冲液，3mM MgSO4，0.5mM dNTP，8U BstDNA聚合酶，样本模板2.5μl，超纯水补足25μl，然后加入30μl的密封液，将上述反应管于 65℃反应60min。
(3)结果判定：在上述反应管中加入1μl 1000×SYBR Green I，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为阪崎肠杆菌，橙色则为非阪崎肠杆菌。
本实施例中，PCR管显绿色，表明待检样品所感染的致病菌为阪崎肠杆菌。
二、特异性与灵敏度
1.检测材料及方法
1.1菌株
金黄色葡萄球菌ATCC 6538；
单增李斯特菌CMCC(B)54002；
副溶血性弧菌ATCC 17802；
福氏志贺氏菌CMCC(B)51572；
鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028；
阪崎肠杆菌CMCC 45410；
阴沟肠杆菌CMCC45301；
赫氏艾希氏菌；
肺炎克雷伯氏菌；
大肠埃希氏菌O157：H7 ATCC 43888；
大肠埃希氏菌25922；
威氏李斯特CICC21672；
绵羊李斯特CICC21633；
格氏李斯特CICC21670。
1.2食品样本
幼儿配方奶粉、米粉、营养快线、奶片、钙奶饼干
1.3检测方法
对各个样本的检测严格按照说明书进行操作，同时与国标方法GB 4789.40-2010进行对比。
2.试验结果
2.1特异性
对常见食源性致病菌菌株及同源性高的菌株提取基因组DNA(按说明书制备基因组 DNA)，采用核酸检测试剂盒进行单一和交叉污染检测，每个样品进行2次重复检测，并同时检测试剂盒的阴性和阳性对照。
特异性实验结果(“+”代表阳性；“-“代表阴性)
Figure RE-GDA0003743811630000081
Figure RE-GDA0003743811630000091
注：15-18为交叉污染样品
结果显示，仅含阪崎肠杆菌样品显示阳性结果，其余样品均为阴性，表明试剂盒具有高度特异性。
2.2灵敏度
纯菌灵敏度(CFU/ml)：取计数后菌液进行梯度稀释(100ul菌液+900ul超纯水)，按说明书提取DNA模板。取不同浓度梯度测试，每个梯度两个平行。
实际样本灵敏度(CFU/25g(ml))：取计数后菌液进行梯度稀释(100ul菌液+900ul超纯水)，分别取约为≥10CFU、＜10CFU稀释液进行样本添加，置于均质袋内，按国标方式培养，取200ul培养液上清提取模板检测。
①纯菌灵敏度
冻干批次 灵敏度
1014 4.5*10<sup>2</sup>CFU/ml
1018 4.5*10<sup>2</sup>CFU/ml
1025 3.25*10<sup>2</sup>CFU/ml
结果显示：纯菌灵敏度数量级为102，但大量实验结果证实由于模板提取，稀释误差等原因灵敏度数量级可能为103。因此，纯菌灵敏度约为102-103CFU/ml。
②实际样本灵敏度
样本 试剂盒检测限 国标方法检测限
婴幼儿配方奶粉 ＜10CFU/25g ＜10CFU/25g
奶片 ＜10CFU/25g ＜10CFU/25g
营养快线 ＜10CFU/25g 10CFU/25g
钙奶饼干 ＜10CFU/25g ＜10CFU/25g
米粉 10CFU/25g 10CFU/25g
结果显示：实际样本的灵敏度均可达到≤10CFU/25g，个别样本灵敏度试剂盒方法高于国标方法。
2.3批间、批内差(“+”为阳性、“-”为阴性)
选择婴幼儿配方奶粉为样本，进行不同量的阳性菌添加(无添加、≥10CFU、＜10CFU)，制备成不同浓度的样品，每个样品三个平行，三次重复，测试三批检测试剂，同时设立阴阳对照。
Figure RE-GDA0003743811630000101
根据实验结果，按照公式计算，试剂盒的批内差为0％，批间差为0％，说明试剂盒稳定性较好。
2.4国标符合率
选择婴幼儿配方奶粉、奶片、营养快线、钙奶饼干、米粉为样本，使用不同浓度阳性菌进行样本添加，采用核酸检测试剂盒与国标方法同时进行检测，比较两种方法的检测结果，每个检测样本进行3个重复检测，同时设立试剂盒的阴性对照和阳性对照。
阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒与国标方法检测结果
Figure RE-GDA0003743811630000102
结果显示，不同样本检测结果与国标一致。因此，试剂盒检测方法与国标检测方法的符合率为100％。
3.验证评价
验证实验表明，本公司研发的阪崎肠杆菌核酸检测方法简单、快捷，不需要大型仪器设备；纯菌检测灵敏度约为102-103CFU/mL，实际样本灵敏度均可达到≤10CFU/25g，试剂盒具有较高特异性，产品批内及批间无明显差异，实际样本检测国标符合率为100％。

Claims (3)

1.一种分泌阪崎肠杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为F-4-1，保藏编号为CGMCC No.14305。
2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备检测阪崎肠杆菌的胶体金免疫层析试纸条中的应用。
3.一种阪崎肠杆菌单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116042877A (zh) * 2023-01-29 2023-05-02 徐州医科大学 链交换等温扩增结合纳米荧光微球-免疫层析技术快速精准检测婴儿肺炎克雷伯菌新方法

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