CN101260423A - 一种检测单核细胞增生李斯特活菌的方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测单核细胞增生李斯特活菌的方法，它涉及一种检测李斯特菌的方法。本发明解决了现有检测单增李斯特活菌的方法容易产生假阳性的问题。本发明检测单核细胞增生李斯特菌的方法按如下步骤进行：从待测物品中提取菌泥后提取RNA进行反转录及实时PCR；即得到可以判断待测物品是否含有单增李斯特活菌的图谱。本发明具有灵敏度高，特异性好，操作简便，周期较短的优点，适应食品工业中致病菌快速检测的需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测李斯特菌的方法。
背景技术
单核细胞增生(增多性)李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)，简称单增李斯特菌，是一种兼性厌氧的革兰氏阳性菌，其pH值生长范围为4.39～9.40，在4℃下也可生长，因此增加了对冷藏食物的危害性。单增李斯特菌广泛存在于土壤、动物和水产品中，主要通过乳及乳制品、蔬菜、水产品、肉制品等食物传播。因其具有独特的生理特性，能引起人类脑膜炎、败血症等疾患，尤以妊娠期妇女、新生儿以及免疫功能低下的病人更易感染，致死率达30％以上。
现有检测单增李斯特菌的方法全过程至少需要4～7天，检出限度不够灵敏，操作复杂，费时费力。而PCR和探针杂交都无法排除死菌和活菌，由于死菌中的DNA降解较慢，也容易产生假阳性。检测技术的假阳性会带来错误的信息和判断，根据假阳性结果所采取的措施可能会带来不必要的损失。荧光染料(EMA)与PCR技术相结合可以对活菌进行检测，其原理是EMA可通过被破坏的细胞膜与DNA相结合，而结合了EMA的基因组DNA在PCR反应中不能进行扩增；反之，EMA不能通过活菌的细胞膜，所以不能与基因组DNA相结合，PCR反应可正常进行。但有研究报告指出EMA可穿透部分细菌活体的细胞膜，并与DNA双链结合，造成活菌基因组DNA损失，所以PCR检测结果不准确。
发明内容
本发明为了解决现有检测单增李斯特活菌的方法容易产生假阳性的问题，而提供一种检测单核细胞增生李斯特活菌的方法。
本发明的检测单核细胞增生李斯特活菌的方法按如下步骤进行：
一、取待测物品25g置于225mL胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤中进行培养培养8小时，再取培养液4mL放于5mL环氧树脂管中，在室温下以14000r/min的速度离心3min，得到菌泥；
二、将得到的菌泥重悬于3mL甲醇、乙醚和氨水的混合液中，再重悬于1mL的裂解液中，然后加入0.2g、直径为0.2mm的玻璃珠，2000转/分涡旋5min。然后以14000r/min的相对离心力离心3min；
三、取离心后悬浮物700μL与同体积pH值为5.5的水饱和酚混合于1.5mL的环氧树脂管中，在68℃的条件下保温5min，然后在室温下以14000r/min的速度离心4min；
四、取600μL的上层水相与同体积氯仿混合于另一个1.5mL的环氧树脂管中，以2000r/min的速度涡旋20s后，再以14000r/min的速度离心4min；
五、再取400μL上层水相与800μL的绝对乙醇和40μL、浓度为3mol/L的醋酸钠混合，以2000r/min的速度涡旋20s后，于-20℃保温10min，再以16000r/min的速度离心5min获得RNA沉淀物；
六、用体积为1mL、质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀物，以16000r/min的速度离心3min后，在室温下干燥至无乙醇残留。
七、将干燥的RNA重悬于20μL DEPC水中，加入DNA酶(DNase I)和RNA酶抑制剂(Ribonuclease Inhibitor)在37℃下保温15min，再放入60℃的水浴10min；
八、RNA抽提之后进行RT-PCR操作，反转录条件为：在95℃保温2min后，在42℃保温15min PCR反应参数为：在95℃的条件下预变性10s，40个循环中，每个循环均在95℃的条件下变性5s，在60℃的条件下延伸34s，其中反转录及实时PCR的正向引物为5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’，反向引物为5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’，荧光探针为FAM-5’-CGATTTCATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3’-TAMRA；通过荧光监测系统可接收到荧光信号，收集荧光信号，各循环数的相对荧光值数据通过软件分析形成图谱，通过图谱判断待检测物品是否含有单增李斯特活菌。
实时PCR反应试剂用量
步骤七中的DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。
步骤二的甲醇、乙醚和氨水的混合液中甲醇∶乙醚∶氨水的体积比为1∶1∶1，其中甲醇的浓度为10.4mol/L，乙醚的浓度为4.5mol/L，氨水的浓度为9.5mol/L。
用本发明的方法检测单增李斯特菌，无假阳性反应，可以区分存活的李斯特菌和死亡的李斯特菌，这是现有检测方法达不到的效果，本发明的检测方法灵敏度最高达到样品增菌12小时检测限为17CFU/mL，检测全过程仅需要16小时。
附图说明
图1为本发明的方法检测单增李斯特活菌阳性的曲线示意图；图2为具体实施方式五的人工污染乳12小时李斯特活菌检测图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式检测单核细胞增生李斯特活菌的方法按如下步骤进行：
一、取待测物品25g置于225mL胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤中进行培养培养8小时，再取培养液4mL放于5mL环氧树脂管中，在室温下以14000r/min的速度离心3min，得到菌泥；
二、将得到的菌泥重悬于3mL甲醇、乙醚和氨水的混合液中，再重悬于1mL的裂解液中，然后加入0.2g、直径为0.2mm的玻璃珠，2000转/分涡旋5min。然后以14000r/min的相对离心力离心3min；
三、取离心后悬浮物700μL与同体积pH值为5.5的水饱和酚混合于1.5mL的环氧树脂管中，在68℃的条件下保温5min，然后在室温下以14000r/min的速度离心4min；
四、取600μL的上层水相与同体积氯仿混合于另一个1.5mL的环氧树脂管中，以2000r/min的速度涡旋20s后，再以14000r/min的速度离心4min；
五、再取400μL上层水相与800μL的绝对乙醇和40μL、浓度为3mol/L的醋酸钠混合，以2000r/min的速度涡旋20s后，于-20℃保温10min，再以16000r/min的速度离心5min获得RNA沉淀物；
六、用体积为1mL、质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀物，以16000r/min的速度离心3min后，在室温下干燥至无乙醇残留。
七、将干燥的RNA重悬于20μL DEPC水中，加入DNA酶(DNase I)和RNA酶抑制剂(Ribonuclease Inhibitor)在37℃下保温15min，再放入60℃的水浴10min；
八、RNA抽提之后进行RT-PCR操作，反转录条件为：在95℃保温2min后，在42℃保温15min；PCR反应参数为：在95℃的条件下预变性10s，40个循环中，每个循环均在95℃的条件下变性5s，在60℃的条件下延伸34s，其中反转录及实时PCR的正向引物为5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’，反向引物为5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’，荧光探针为FAM-5’-CGATTTCATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3’-TAMRA；通过荧光监测系统可接收到荧光信号，收集荧光信号，各循环数的相对荧光值数据通过软件分析形成图谱，通过图谱判断待检测物品是否含有单增李斯特活菌。
实时PCR反应试剂用量
本实施方式步骤三的水饱和酚为在68℃的条件下苯酚溶解在水中的饱和溶液。
本实施方式步骤二的裂解液是将醋酸钠2.7g、SDS(十二烷基硫酸钠)5g、EDTA(乙二胺四乙酸)0.34g溶解到1000mL的去离子水中，调节pH至5.5后进行常规的过滤除菌制成的。
本实施方式的检测结果曲线如图1所示，检测李斯特菌为阳性时如图1中上扬的曲线，检测李斯特菌为阴性时如图1中的平直曲线，对比效果明显。
将单增李斯特菌标准菌株过夜培养液按10倍递增稀释至浓度为3～3×104CFU/mL，并在37℃下分别增菌1、3、5、7小时后进行检测。经过1小时增菌后，其中接种浓度为3×102CFU/mL、3×103CFU/mL、3×104CFU/mL的单增李斯特菌标准菌株培养液用本实施方式的方法均可检出；而经过3小时增菌之后，接种浓度为3×10CFU/mL的标准菌株培养液也可检出；五个梯度浓度经5小时和7小时的增菌后，用本实施方式的方法检测均可全部检出。即经1hr增菌的最低检出限为3×102CFU/mL，经3小时增菌的最低检出限为3×10CFU/mL，而经5小时和7小时增菌后检出限均为3CFU/mL。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤七的DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二的甲醇、乙醚和氨水的混合液中甲醇∶乙醚∶氨水的体积比为1∶1∶1。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三的不同点为：甲醇的浓度为10.4mol/L，乙醚的浓度为4.5mol/L，氨水的浓度为9.5mol/L。其它步骤及参数与具体实施方式三相同。
具体实施方式五：本实施方式检测单核细胞增生李斯特活菌的方法按如下步骤进行：
一、取待测物品25g置于225mL胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤中进行培养培养8小时，再取培养液4mL放于5mL环氧树脂管中，在室温下以14000r/min的速度离心3min，得到菌泥；
二、将得到的菌泥重悬于3mL甲醇、乙醚和氨水的混合液中，再重悬于1mL的裂解液中，然后加入0.2g、直径为0.2mm的玻璃珠，2000转/分涡旋5min。然后以14000r/min的相对离心力离心3min；
三、取离心后悬浮物700μL与同体积pH值为5.5的水饱和酚混合于1.5mL的环氧树脂管中，在68℃的条件下保温5min，然后在室温下以14000r/min的速度离心4min；
四、取600μL的上层水相与同体积氯仿混合于另一个1.5mL的环氧树脂管中，以2000r/min的速度涡旋20s后，再以14000r/min的速度离心4min；
五、再取400μL上层水相与800μL的绝对乙醇和40μL、浓度为3mol/L的醋酸钠混合，以2000r/min的速度涡旋20s后，于-20℃保温10min，再以16000r/min的速度离心5min获得RNA沉淀物；
六、用体积为1mL、质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀物，以16000r/min的速度离心3min后，在室温下干燥至无乙醇残留。
七、将干燥的RNA重悬于20μL DEPC水中，加入DNA酶(DNase I)和RNA酶抑制剂(Ribonuclease Inhibitor)在37℃下保温15min，再放入60℃的水浴10min；
八、RNA抽提之后进行RT-PCR操作，反转录条件为：在95℃保温2min后，在42℃保温15min；PCR反应参数为：在95℃的条件下预变性10s，40个循环中，每个循环均在95℃的条件下变性5s，在60℃的条件下延伸34s，其中反转录及实时PCR的正向引物为5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’，反向引物为5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’，荧光探针为FAM-5’-CGATTTCATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3’-TAMRA；通过荧光监测系统可接收到荧光信号，收集荧光信号，各循环数的相对荧光值数据通过软件分析形成图谱，通过图谱判断人工污染乳是否含有单增李斯特活菌。
实时PCR反应试剂用量
本实施方式步骤三的水饱和酚为在68℃的条件下苯酚溶解在水中的饱和溶液。
本实施方式检测人工污染乳的结果如图2所示，图中上扬曲线为检测李斯特菌的阳性信号曲线，比较平直的曲线为阴性对照曲线，图2说明本实施方式的检测方法灵敏度高，检验结果明显。
序列表
<110>东北农业大学
<120>一种检测单核细胞增生李斯特活菌的方法
<160>3
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测单增李斯特菌的正向引物
<400>1
tgcaagtcc aagacgcca 19
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测单增李斯特菌的反向引物
<400>2
cactgcatct ccgtggtata ctaa 24
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于检测单增李斯特菌的荧光探针的基因序列
<400>3
cgatttcatc cgcgtgtttc ttttcg 26
Claims (4)
1、一种检测单核细胞增生李斯特活菌的方法，其特征在于检测单核细胞增生李斯特活菌的方法按如下步骤进行：
一、取待测物品25g置于225mL胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤中进行培养培养8小时，再取培养液4mL放于5mL环氧树脂管中，在室温下以14000r/min的速度离心3min，得到菌泥；
二、将得到的菌泥重悬于3mL甲醇、乙醚和氨水的混合液中，再重悬于1mL的裂解液中，然后加入0.2g、直径为0.2mm的玻璃珠，2000转/分涡旋5min。然后以14000r/min的相对离心力离心3min；
三、取离心后悬浮物700μL与同体积pH值为5.5的水饱和酚混合于1.5mL的环氧树脂管中，在68℃的条件下保温5min，然后在室温下以14000r/min的速度离心4min；
四、取600μL的上层水相与同体积氯仿混合于另一个1.5mL的环氧树脂管中，以2000r/min的速度涡旋20s后，再以14000r/min的速度离心4min；
五、再取400μL上层水相与800μL的绝对乙醇和40μL、浓度为3mol/L的醋酸钠混合，以2000r/min的速度涡旋20s后，于-20℃保温10min，再以16000r/min的速度离心5min获得RNA沉淀物；
六、用体积为1mL、质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀物，以16000r/min的速度离心3min后，在室温下干燥至无乙醇残留。
七、将干燥的RNA重悬于20μL DEPC水中，加入DNA酶和RNA酶抑制剂在37℃下保温15min，再放入60℃的水浴10min；
八、RNA抽提之后进行RT-PCR操作，反转录条件为：在95℃保温2min后，在42℃保温15min；PCR反应参数为：在95℃的条件下预变性10s，40个循环中，每个循环均在95℃的条件下变性5s，在60℃的条件下延伸34s，其中反转录及实时PCR的上游引物为5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’，下游引物为5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’，荧光探针为FAM-5’-CGATTTCATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3’-TAMRA；通过荧光监测系统可接收到荧光信号，收集荧光信号，各循环数的相对荧光值数据通过软件分析形成图谱，通过图谱判断待检测物品是否含有单增李斯特活菌。
实时PCR反应试剂用量
2、根据权利要求1所述的一种检测单核细胞增生李斯特活菌的方法，其特征在于步骤七的DEPC水是用DEPC处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。
3、根据权利要求1所述的一种检测单核细胞增生李斯特活菌的方法，其特征在于步骤二的甲醇、乙醚和氨水的混合液中甲醇∶乙醚∶氨水的体积比为1∶1∶1。
4、根据权利要求3所述的一种检测单核细胞增生李斯特活菌的方法，其特征在于甲醇的浓度为10.4mol/L，乙醚的浓度为4.5mol/L，氨水的浓度为9.5mol/L。
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