CN102358909B - 李斯特菌属的肽核酸原位荧光鉴定方法和pna探针 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于鉴定李斯特菌属（Listeriagenus）PNA探针的设计，及应用PNA-FISH法鉴定李斯特菌的方法。李斯特菌属的肽核酸原位荧光鉴定用PNA探针，该PNA探针的DNA序列如SEQIDNO：1所示。本发明并将探针N端标记荧光素，与荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）技术结合用于检测。建立了液相模式的荧光原位杂交检测方法，并优化了杂交条件。PNA-FISH法具有快速特点，一般整个鉴定过程耗时不超过4个小时；PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性低，且PNA-FISH法可省去繁琐DNA提取的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及用于鉴定李斯特菌属（Listeria genus）PNA探针的设计，及应用PNA-FISH法鉴定李斯特菌的方法。
背景技术
李斯特菌属包括单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，单增李斯特菌）、伊氏李斯特菌（Listeria ivanovii）、无害李斯特菌（L. innocua），格氏李斯特菌（L. grayi）、塞氏李斯特菌（L. seeligeri）、威氏李斯特菌（L. welsshimeri）、以及2009年新近发现的L. marthii和L. rocourtiae。其中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌对动物具有致病性，且单增李斯特菌为人畜共患食源性致病菌。孕妇、小孩、老年人及免疫力低下人群易感，常表现为脑膜脑炎、脑炎、骨髓炎、心肌炎、脓血症、流产等，发病率虽然不高，但死亡率较高，成年人的致死率为20%～60%，对婴儿及免疫力低下的人群致死率高达54%～90%。该菌在自然界中广泛分布，环境适应性很强，pH4.4～9.2、3～45℃以及高达10%NaCl的环境中均可以生长，通过多种途径进入食品加工和生产过程污染食品，对消费者健康构成潜在威胁。
肽核酸是1991年由丹麦科学家Nielsen等人设计的一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA模拟物，其骨架结构单元为（2-氨乙基）甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接与主骨架的氨基N上，可以序列特异地与DNA、RNA结合。其骨架为电中性，与DNA-DNA或RNA-DNA互补链相比，PNA-DNA和PNA-RNA互补不存在静电排斥作用，因此具有很高的DNA或RNA亲和性，在无错配的情况下其结合具有高稳定性，且杂交速度快，具有良好的细胞穿透性，是核酸探针的良好选择。同时PNA探针结合原位荧光杂交技术（FISH），与传统生化鉴定比较，PNA-FISH法可节约大量时间，若不计增菌时间，一般耗时不超过4个小时。与PCR等方法比较，PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性较低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步骤。
发明内容
本发明的第一个目的是设计了李斯特菌属的肽核酸原位荧光鉴定用PNA探针，该PNA探针具有李斯特菌属特异性。本发明的第二个目的是提供了一种李斯特菌属的肽核酸原位荧光鉴定方法，该方法结合FISH检测技术，实现对李斯特菌属的快速鉴定。
为了实现上述第一个目的，本发明采用以下技术方案：
李斯特菌属的肽核酸原位荧光鉴定用PNA探针，该PNA探针的DNA 序列如SEQ ID NO：1所示。
为了实现上述第二个目的，本发明采用以下技术方案：
李斯特菌属的肽核酸原位荧光鉴定方法，该方法包括以下的步骤：
1）离心收集对数生长期的细菌，用50%酒精/磷酸缓冲液固定缓冲液重悬，细菌浓度控制在OD600=0.5-1.0,室温固定1小时后置于-20℃保存；
2）取100μl 固定好的菌体2000g离心5min，弃上清,室温下加入50μl含300pmole/mlPNA探针的杂交缓冲液，PNA探针的DNA 序列如SEQ ID NO：1所示，重悬；
3）样品于薄壁PCR管中，55℃ 水浴1-1.5小时, 加入200μl洗涤缓冲液，洗涤缓冲液预热至55℃，55℃水浴20min, 2000g离心5min，弃洗涤缓冲液，重复洗涤一次, 取25～30μl洗涤缓冲液重悬，取2～5μl菌液涂片，风干后荧光显微镜观察荧光亮度及细菌的形态。
作为优选，上述的磷酸缓冲液包括7mM Na2HPO4、7mM NaH2PO4和130mM NaCl。
作为优选，上述的杂交缓冲液pH9.0，该杂交缓冲液包括20 mM Tris、100 mM NaCl和0.5% SDS。
作为优选，上述的洗涤缓冲液pH9.0，该洗涤缓冲液包括10 mM Tris，1 mM EDTA。
本发明由于采用了上述的技术方案，PNA探针具有与DNA和RNA特异性结合的高稳定性、杂交快速性、及其良好的细胞穿透性，使本发明的检测方法具有快速，准确、灵敏的特性。同时结合原位荧光杂交技术使检测具有分子生物学和形态学的双重保证，更加提高了鉴定的准确率。本发明建立了液相模式的荧光原位杂交检测方法，并优化了杂交条件。PNA-FISH法具有快速特点，一般整个鉴定过程耗时不超过4个小时；PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性低，且PNA-FISH法可省去繁琐DNA提取的步骤。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。
一、PNA探针的设计
在NCBI 的网站上(http://www.ncbi.hlm.nih.gov/BLAST/)选取了27个分别来自8个种的李斯特菌的16S rRNA的基因，用MegAlign 软件(version 5.0; DNASTAR, Madison, WI)的ClustalV算法进行排序。在排序后的保守区域设计了李斯特菌属特异性探针Lis-16S-1。探针DNA 序列如SEQ ID NO：1所示。
二、探针敏感度和灵敏度的理论验证
为了验证探针的敏感度和特异性，用BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）和ProbeCheck（http://131.130.66.200/cgi-bin/probecheck/）对探针进行了验证。BLAST 搜索发现，所设计的探针具有较高的特异性。但也有一些显示为“非培养细菌（uncultured bacteria）”的非目标细菌与探针Lis-16S-1有重合区域。但以上非目标细菌，与李斯特菌关系都较疏远，也并非食品中常见的致病菌。因此一般并不会与我们的目标细菌混淆。
ProbeCheck的验证结果显示：Lis-16S-1能检测到ProbeCheck中小亚基（16S/18S）数据库中所有的204个李斯特菌，但同时也能检测到30个非目标菌，其中包括22个非培养细菌（表2）。随后将PNA探针与大亚基(23S/28S)数据库匹配检测，发现探针Lis-16S-1不与23S rRNA存在错配。
经过BLAST和ProbeCheck验证，所设计的探针理论上具有很高的灵敏度和特异性。
表1 PNA 探针
| 探针 | 序列 (5’-3’)荧光标记 | 探针位置碱基序列 ; GenBank号 |
| BacUina | CTGCCTCCCGTAGGA-FAM | － |
| Lis-16S-1 | ACTGTTGTTAGAGAAG-FAM | 440-455; FJ434468 |
a BacUin为阳性对照探针；引用自Perry-O'Keefe, H., Stender, H., Broomer, A., Oliveira, K., Coull, J., Hyldig-Nielsen, J.J., 2001. Filter-based PNA in situ hybridization for rapid detection, identification and enumeration of specific micro-organisms. J Appl Microbiol 90(2): 180-189.
探针合成和标记由韩国Panagene完成。
表2 ProbeCheck检测PNA探针的敏感度和特异性
| 探针名 | 可检测到的目标菌数/数据库中所有的目标菌数 | 检测到的非目标菌菌数b | 特异性c(%) | 敏感度d(%) |
| Lis-16S-1 | a Listeria 204/204 | 30 | 99.99 | 100 |
a检测到了ProbeCheck小亚基(16S/18S)数据库中的所有204个李斯特菌；
bProbeCheck的16S/18S数据库中共有菌株数460,783；非李斯特菌的菌株数460,579；
c特异性=没有检测到的非目标菌菌株数/数据库中所有的非目标菌菌株数；
d敏感度=检测到的目标菌菌株数/数据库中所有的目标菌菌株数。
三、液相PNA荧光原位杂交
离心（2000g，5min）收集对数生长期的细菌，用磷酸缓冲液（PBS，7mM Na2HPO4 ，7mM NaH2PO4，130mM NaCl）洗涤一次，用1:1(酒精:PBS)固定缓冲液重悬，菌液浓度控制在OD600=0.5-1.0,室温固定1小时后置于-20℃可保存6个月。取100μl 固定好的菌体2000g离心5min，弃上清, 加入50μl含300pmole/mlPNA的杂交缓冲液（pH9.0，20 mM Tris，100 mM NaCl，0.5% SDS）重悬。样品于薄壁PCR管中，55℃ 水浴1-1.5小时, 加入200μl预热至55℃的洗涤缓冲液（pH9.0，10 mM Tris，1 mM EDTA），55℃水浴20min, 2000g离心5min，弃洗涤缓冲液，重复洗涤一次, 取25～30μl洗涤缓冲液重悬，取2～5μl菌液涂片，风干后显微镜观察细菌形态及荧光亮度。
试验例1 PNA-FISH敏感度验证
对19个李斯特菌属的菌株进行PNA-FISH验证，这些菌株包括9株单增李斯特菌、2株伊氏李斯特菌、2株李无害李斯特菌、2株格氏李斯特菌、2株塞氏李斯特菌、2株威氏李斯特菌。试验方法如上所述。每次试验（包括以下试验例2和3）都同步进行阳性对照和阴性对照试验，阳性对照试验，用探针BacUin替代其他探针，而阴性对照试验中，用空白替代其他探针。
结果显示，所有的菌株都能和阳性对照探针BacUin及李斯特菌通用探针Lis-16S-1结合（表3）。上述结果和预设结果一致，探针Lis-16S-1能检测到自己的目标菌株，有较高的敏感度。
表 3 PNA探针敏感度试验
*同L.murrayi.
-- 无血清型描述.
试验例2 PNA-FISH特异性验证
选取了8个与李斯特菌属相近细菌株，分别为蜡状芽孢杆菌、枯草杆菌、田野环丝菌、粪肠球菌、乳酸杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌2、河弧菌。试验方法如上所述。结果显示只有阳性对照探针BacUin与所有细菌都能结合，目标探针Lis-16S-1则都不能与这些非目标菌株结合（表4）。与预期结果一致，探针Lis-16S-1显示了很好的特异性。
表4 PNA探针特异性验证
| 物种 | 菌株 | BacUin | Lis-16S-1 |
| Bacillus cereus | -- | + | － |
| Bacillus subtilis | -- | + | － |
| Brochothrix campestris | -- | + | － |
| Enterococcus faecalis | -- | + | － |
| Lactobacillus | ATCC4356 | + | － |
| Staphylococcus aureus | Y1P28 | + | － |
| Streptococcus suis2 | 5995 | + | － |
| Vibrio flurialis | ATCC33810 | + | － |
-- 无菌株号描述
试验例3 食品和环境来源李斯特菌分离株PNA-FISH法和API法鉴定比对
同时采用PNA-FISH法和API法（法国梅里埃公司的API LISTERIA strep，10300），对780个来自浙江省内食品加工企业和零售商店的食品样品和环境样品进行李斯特菌检测。经过样品收集、增菌、分离等步骤后，用PNA-FISH法参照前述的方法进行鉴定，同时使用API法参照试剂盒说明书进行鉴定比对。
结果显示（表5），虽然探针Lis-16S-1只能鉴定到李斯特菌属水平，但和API的鉴定结果比较发现，Lis-16S-1所检测到的阳性样品和API法检测到的所有阳性样品（含各种李斯特菌种）均能一一对应。表明探针Lis-16S-1和PNA-FISH方法本身能被有效的用于不同来源李斯特菌属的鉴定。
表 5 PAN-FISH法和API法在实际样品中的检测结果比较
序列表
<110>浙江省检验检疫科学技术研究院；浙江大学医学院附属妇产科医院
<120>李斯特菌属的肽核酸原位荧光鉴定方法和PNA探针
<160>1
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ACTGTTGTTA GAGAAG 16
Claims (5)
1.李斯特菌属（Listeria genus）的肽核酸原位荧光鉴定用PNA探针，其特征在于：该PNA探针的DNA 序列如SEQ ID NO：1所示。
2.李斯特菌属的肽核酸原位荧光鉴定方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1）离心收集对数生长期的细菌，用50%酒精/磷酸缓冲液固定缓冲液重悬，细菌浓度控制在OD600=0.5-1.0,室温固定1小时后置于-20℃保存；
2）取100μl 固定好的菌体2000g离心5min，弃上清,室温下加入50μl含300pmole/mlPNA探针的杂交缓冲液，PNA探针的DNA 序列如SEQ ID NO：1所示，重悬；
3）样品于薄壁PCR管中，55℃ 水浴1-1.5小时, 加入200μl洗涤缓冲液，洗涤缓冲液预热至55℃，55℃水浴20min, 2000g离心5min，弃洗涤缓冲液，重复洗涤一次, 取25～30μl洗涤缓冲液重悬，取2～5μl菌液涂片，风干后荧光显微镜观察荧光亮度及细菌的形态；
上述的方法不应用于疾病的诊断。
3.根据权利要求2所述的李斯特菌属的肽核酸原位荧光鉴定方法，其特征在于：磷酸缓冲液包括7mM Na2HPO4、7mM NaH2PO4和130mM NaCl。
4.根据权利要求2所述的李斯特菌属的肽核酸原位荧光鉴定方法，其特征在于：杂交缓冲液pH9.0，该杂交缓冲液包括20 mM Tris、100 mM NaCl和0.5% SDS。
5.根据权利要求2所述的李斯特菌属的肽核酸原位荧光鉴定方法，其特征在于：洗涤缓冲液pH9.0，该洗涤缓冲液包括10 mM Tris，1 mM EDTA。
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