CN102010913A - 一种甄别李斯特菌的实时荧光pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种甄别李斯特菌的实时荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物、Eva Green荧光染料、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物：5′-CGTGCATCGCCCATGTGC-3′下游引物：5′-ATCTACGAGCGTAGTCAC-3′。本发明的有益效果主要体现在：能够高灵敏度、高特异性、简便的对六种李斯特菌进行甄别；可实现对六种李斯特菌的快速、准确、特异检测和分析，也可加入标准品进行定量检测。

Description

一种甄别李斯特菌的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种甄别李斯特菌的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

(二)背景技术

李斯特菌在微生物分类中归革兰氏阳性无芽孢杆菌中的位置不定属，该属内共有6种菌——单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、伊凡诺夫李斯特菌(Listeria ivanovii)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)、斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)、威尔逊李斯特菌(Listeria welshimeri)。以前的报道中指出李斯特菌属中仅单核细胞增生李斯特菌对人有致病性。单核细胞增生李斯特菌广泛存在于土壤、水、植物、人和动物的粪便中，中毒症状严重，除了常见的呕吐、腹泻等胃肠道表现外，还可以侵蚀人体中枢神经系统(主要表现脑膜炎、败血症、流产等疾病)，对机体造成极大地伤害，并且死亡率极高，容易引起李斯特菌病的大暴发。畜禽产品、蛋、乳制品、蔬菜及各种肉类食品是单增李斯特菌主要的污染源。该致病菌还被列为90年代威胁食品安全的四大致病菌(单增李斯特菌，致病性大肠杆菌，肉毒梭菌，亲水气单胞菌)之一。由于单增李斯特菌在4℃的环境中仍能正常生长繁殖，经常污染冷冻食品，因此也是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。但是随着研究的不但深入，发现该属内除了单核细胞增生李斯特菌对人致病以外，其他的细菌也对人体致病，其余的5种致病菌均可导致李斯特菌病，同时产生其他临床症状。

目前常规鉴定的鉴定方法中，只有对单增李斯特菌有标准的鉴定方法，而且均是以常规培养方法为主，根据生化特性、致病力及协同溶血试验等进行鉴定，鉴定周期需要5～10天，而属内其他致病菌均无标准鉴定方法。

(三)发明内容

本发明目的是根据ssrA基因设计引物，提供一种甄别六种李斯特菌的荧光检测试剂盒及其检测方法，可实现对六种李斯特菌快速、准确、特异甄别，使用本发明所述的引物及对应反应体系可以对每种李斯特菌的ssrA基因进行准确分析。

本发明采用的技术方案是：

一种甄别李斯特菌的实时荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物、Eva Green荧光染料、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-CGTGCATCGCCCATGTGC-3′

下游引物：5′-ATCTACGAGCGTAGTCAC-3′。

本发明关键在于特异性引物的设计和检测的方法，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择，该试剂盒可用作李斯特菌的定性检测，也可加入标准品进行定量检测。

高分辨率熔解曲线技术(High Resolution Melting，HR  )技术是近几年发展起来的高精度分析方法，利用荧光定量PCR技术生成溶解曲线，通过读取其峰值可以将单个碱基差别的序列进行特异性的鉴定。本发明选取李斯特菌属特异性基因，可通过荧光定量PCR和HRM技术对属内的六种致病菌进行准确区分。

进一步，为达到定量检测的效果，所述试剂盒内还可包括6种李斯特菌的基因标准品，所述标准品序列如下：

单核细胞增生李斯特菌标准品：cgtgcatcgcc catgtgctac ggtaagggtc tcactctaag tgggctacac tagttaatctccgtctgggg ttaaatagaa gagcttaatc agactagctg aatggaagcc tgttaccggg ccgatgttta tgcgaaatgctaatacggtg actacgctcg tagat；

伊凡诺夫李斯特菌标准品：cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ttaagtgggc tacactaaataatctccgtc tggggttagt tagaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcgaaatgctaata cggtgactac gctcgtagat；

无害李斯特菌标准品：cgtgcatcgcc catgtgctac ggtaagggtc tcactctaag tgggctacac tagttaatctccgtctgagg ttaaatagaa gagcttaatc agactagctg aatggaagcc tgttaccggg ctgatgttta tgcgaaatgctaatacggtg actacgctcg tagat；

格氏李斯特菌标准品：cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ctaagtgggc tacactagttaatctccgtc tgaggttaaa tagaagagct taatgagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcgaaatgctaata cggtgactac gctcgtagat；

斯氏李斯特菌标准品：cgtgca tcgcccatgt gctacggaaa gggtctcact ttaagtgggc tacactaaat aatctccgtctggggttagt tagaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatactaatacggtgactac gctcgtagat；

威尔逊李斯特菌标准品：cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ctaagtgggc tacactggct aatctccgtctgaggttagt tggaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggccgat gtttatgcga aatgctaata cggtgactac gctcgtagat。

本发明还涉及一种甄别李斯特菌的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括：

(1)提取待测样品DNA；

(2)取特异性扩增引物、PCR缓冲液、Eva Green荧光染料、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，分别加入阴性对照品或待测样品DNA配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；

所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-CGTGCATCGCCCATGTGC-3′

下游引物：5′-ATCTACGAGCGTAGTCAC-3′

所述阴性对照品可按本领域常规方法选择，通常可选择副溶血性弧菌、志贺菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌或空肠弯曲菌等。

(3)选择荧光检测模式FAM荧光对应波长，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为李斯特菌阳性。

为确定阳性菌株具体为哪一种李斯特菌，所述方法可进一步将样品DNA的PCR扩增产物从60℃逐步升温到90℃，绘制溶解曲线(溶解曲线以温度(℃)为横坐标，以相应温度下荧光强度的负导数(以10为底)值为纵坐标)，根据样品DNA溶解曲线Tm值(指荧光突然急剧下降时的温度)判断待测样品含有哪种李斯特菌：Tm值在84.59±0.02范围内，判断为单核细胞增生李斯特菌；Tm值在83.67±0.02范围内，判断为伊凡诺夫李斯特菌；Tm值在83.55±0.02范围内，判断为无害李斯特菌；Tm值在86.10±0.02范围内，判断为格氏李斯特菌；Tm值在85.55±0.02范围内，判断为斯氏李斯特菌；Tm值为85.05±0.03范围内，判断为威尔逊李斯特菌。

熔解曲线：对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。利用该特点，由于不同PCR产物其Tm值的不同，因此使其荧光信号发生迅速下降的温度也不同，可通过此对PCR的特异性进行鉴定。

为达到定量检测的效果，所述方法可同时以梯度浓度的标准品DNA溶液在与样品DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为横坐标、标准品Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照相应菌株标准品的标准曲线，获得样品DNA的拷贝浓度。

所述PCR反应条件可按参照本领域常规荧光定量PCR方法，具体的，本发明中PCR反应条件如下：95℃变性2分钟，95℃15秒、60℃45秒，进行40个循环扩增。

PCR反应液通常按如下组成配制(终浓度)：1×PCR buffer、0.3～0.5μM的引物、1×Eva Green、1～5U的DNA聚合酶、0.2～0.4mM的dNTPs，通常取2μL的模板，反应总体积通常为20～50μL。

本发明建立了利用染料荧光定量PCR结合高分辨率熔解曲线技术甄别六种李斯特菌的方法，并经检测实际样本，表明该方法切实可行。由于本方法采用了PCR扩增和高分辨率熔解曲线技术，使得六种李斯特菌甄别的灵敏度大大提高，而且由于高分辨率熔解曲线技术的应用，使得对含有极少数不同碱基差异的基因序列能够准确鉴定，提高了检测的准确性。

本发明采用了目前较先进的定量PCR结合高分辨率熔解曲线技术，通过一次PCR反应可以将六种李斯特菌进行准确甄别。基因序列中碱基的差异可以反应在Tm值的不同上，Tm值的不同可以通过高分辨率熔解曲线技术进行鉴定。以前使用较多的染料法使用的均是不饱和染料，同时一起的熔解曲线分辨率只能达到1.0℃，不能满足单个碱基差异的区分。目前，我们使用的染料为Eva Green属于饱和染料，可以真实的反应PCR片段的Tm值，而且目前所使用的荧光定量PCR仪器熔解曲线的精确度为0.01℃，因此可以对单个碱基的变化进行甄别。使得对于多种同属内的致病菌通过一次PCR反应进行鉴定，节省了实验的时间。

本发明的有益效果主要体现在：能够高灵敏度、高特异性、简便的对六种李斯特菌进行甄别；可实现对六种李斯特菌的快速、准确、特异检测和分析，也可加入标准品进行定量检测。

(四)附图说明

图1为威尔逊李斯特菌的实时荧光定量PCR标准品检测：选取威尔逊李斯特菌作为检测的靶细菌，从左至右分别为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹CFU/mL标准品。

图2为威尔逊李斯特菌的实时荧光定量PCR标准曲线。标准曲线为Y＝-1.935×1gX+38.76；Y：对应的CT值；X：威尔逊李斯特菌的CFU。图3为7例威尔逊李斯特菌阳性实际样本荧光定量PCR检测结果，CT值分别为13.12、13.28、13.62、15.03、15.24、15.19和15.93，细菌数为1.67×10¹¹CFU/mL、1.56×10¹¹CFU/mL、1.38×10¹¹CFU/mL、7.3×10¹⁰CFU/mL、6.72×10¹⁰CFU/mL、6.74×10¹¹CFU/mL和4.8×10¹⁰CFU/mL。

图4为李斯特菌属6种细菌对应的溶解曲线及Tm值，1、无害李斯特菌：83.56；2、伊凡诺夫李斯特菌：83.68；3、单核细胞增生李斯特菌：84.58；4、威尔逊李斯特菌：85.07；5、斯氏李斯特菌：85.56；6、格氏李斯特菌：86.12。(以温度(℃)为横坐标，以相应温度下荧光强度的负导数值为纵坐标)

图5为7例实际样本检测的熔解曲线结果，7例样本对应的Tm值分别为85.05、85.07、85.02、85.04、85.06、85.07、85.03。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：特异性引物和标准品的获得

1、材料：

细菌基因组DNA提取试剂购自大连宝生物工程有限公司；PCR反应体系和Taq DNA聚合酶购自宝生物(大连)有限公司，pGEM-T-Easy克隆系统、Eva Green染料购自上海辉睿生物技术有限公司，377型测序仪、Bio-Rad icycler PCR仪，480型定量PCR仪为瑞士Roche公司产品。

2、引物合成：

以单核细胞增生李斯特菌ssrA基因序列(注册号为AF440341)为模板，使用Primer 5.0软件分析引物，从中选择最佳组合。检测用PCR引物序列如下：

上游引物：5′-CGTGCATCGCCCATGTGC-3′

下游引物：5′-ATCTACGAGCGTAGTCAC-3′

均由大连宝生物工程有限公司合成。

3、检测标准品制备：

选取每种李斯特菌的标准菌株(单核细胞增生李斯特菌ATCC 54001、伊凡诺夫李斯特菌ATCC 19119、无害李斯特菌ATCC 33090、格氏李斯特菌ATCC 25401、斯氏李斯特菌ATCC 35967、威尔逊李斯特菌ATCC35897)以DNA提取试剂提取基因组DNA，取1.0μl(50ng/μL)做PCR反应模板，用前述上下游引物在Bio-Rad icycler PCR仪上进行PCR扩增：

PCR反应液组成如下：

2×PCR buffer          10.0μL

上游引物(10μM)        1μL

下游引物(10μM)        1μL

DNA聚合酶(5U/μL)      0.2μL

dNTPs(各250mM)         1.60μL

(dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量比1∶1∶1∶1)

模板DNA(50ng/μL)      1μL

水补足至20μL。

PCR条件为：94℃5分钟变性，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒进行35个循环扩增，最后于72℃延伸5分钟后置4℃。

PCR产物经电泳检测后即用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，并将阳性克隆经测序验证。回收166bp片段，即为标准品，测定浓度并换算成(拷贝数/体积)。

4、结果：

经测序，上述设计标准品完全与预期相符，回收的标准品片段序列如下：

单核细胞增生李斯特菌：cgtcatcgcc catgtgctac ggtaagggtc tcactctaag tgggctacac tagttaatct ccgtctggggttaaatagaa gagcttaatc agactagctg aatggaagcc tgttaccggg ccgatgttta tgcgaaatgc taatacggtgactacgctcg tagat。

伊凡诺夫李斯特菌：cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ttaagtgggc tacactaaat aatctccgtctggggttagt tagaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatgctaatacggtgactac gctcgtagat。

无害李斯特菌：cgtgcatcgcc catgtgctac ggtaagggtc tcactctaag tgggctacac tagttaatct ccgtctgaggttaaatagaa gagcttaatc agactagctg aatggaagcc tgttaccggg ctgatgttta tgcgaaatgc taatacggtgactacgctcg tagat。

格氏李斯特菌：cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ctaagtgggc tacactagtt aatctccgtctgaggttaaa tagaagagct taatgagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatgctaatacggtgactac gctcgtagat。

斯氏李斯特菌：cgtgca tcgcccatgt gctacggaaa gggtctcact ttaagtgggc tacactaaat aatctccgtctggggttagt tagaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgttaccgggctgat gtttatgcga aatactaatacggtgactac gctcgtagat。

威尔逊李斯特菌：cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ctaagtgggc tacactggct aatctccgtctgaggttagt tggaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggccgat gtttatgcga aatgctaatacggtgactac gctcgtagat。

实施例2：荧光定量PCR结合高分辨率熔解曲线法检测李斯特菌

1、样本检测：

7例实际标本，采用基因组DNA提取试剂提取基因组DNA，分别取1.0μL做模板，用检测用上下游引物在Roche公司480型定量PCR仪上进行PCR扩增。

PCR反应液组成如下：

1×PCR buffer    2μL

1×Eva Green     2μL

上游引物(10μM)      1μL

下游引物(10μM)      1μL

DNA聚合酶(5U/μL)    0.2μL

dNTPs(各250mM)       1.60μL

(dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量比1∶1∶1∶1)

模板DNA(50ng/μL)    1μL

水补足至20μL。

PCR反应条件为：95℃预变性2分钟，95℃15秒、60℃45秒进行40个循环扩增，60℃逐步升温到90℃，形成熔解曲线。

以副溶血性弧菌(ATCC 17802)为阴性对照于相同条件下进行PCR检测，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性，否则判断为阴性结果。

同时在相同条件下以不同浓度标准品进行检测，并绘制标准曲线。

与每种细菌对应的Tm值确定检测的样本中含有的靶细菌类型。

待测样本的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测样本中李斯特菌的数量。

按照上述方法，对志贺菌(ATCC 12022)、沙门菌(ATCC 50035)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25933)、空肠弯曲菌(ATCC 33560)等进行检测，结果均呈阴性，说明本发明方法特异性好。

按照上述方法，对单核细胞增生李斯特菌ATCC 54001、伊凡诺夫李斯特菌ATCC 19119、无害李斯特菌ATCC 33090、格氏李斯特菌ATCC 25401、斯氏李斯特菌ATCC 35967、威尔逊李斯特菌ATCC 35897进行检测，获得熔解曲线见图4。

2、样品检测结果

威尔逊李斯特菌(ATCC 35897)的标准品检测结果参见图1，标准曲线参见图2。

7例样本检出含有威尔逊李斯特菌的不同菌数，检测结果参见图3：7例样本荧光定量PCR检测结果，CT值分别为13.12、13.28、13.62、15.03、15.24、15.19和15.93，细菌数为1.67×10¹¹CFU/mL、1.56×10¹¹CFU/mL、1.38×10¹¹CFU/mL、7.3×10¹⁰CFU/mL、6.72×10¹⁰CFU/mL、6.74×10¹¹CFU/mL和4.8×10¹⁰CFU/mL。

根据样本的Tm值，确定7例样本均含有威尔逊李斯特菌，7例样本对应的Tm值分别为85.05、85.07、85.02、85.04、85.06、85.07、85.03。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                        SEQUENCELISTING

 

<110> 浙江省疾病预防控制中心

 

<120> 一种甄别李斯特菌的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法

 

<130> 

 

<160> 8    

 

<170> PatentInversion3.4

 

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Unknown

 

<220>

<223> 人工序列

 

<400> 1

cgtgcatcgcccatgtgc                                                  18

 

 

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Unknown

 

<220>

<223> 人工序列

 

<400> 2

atctacgagcgtagtcac                                                  18

 

 

<210> 3

<211> 166

<212> DNA

<213> Listeriamonocytogenes

 

<400> 3

cgtgcatcgcccatgtgctacggtaagggtctcactctaagtgggctacactagttaatc    60

 

tccgtctggggttaaatagaagagcttaatcagactagctgaatggaagcctgttaccgg   120

 

gccgatgtttatgcgaaatgctaatacggtgactacgctcgtagat                  166

 

 

<210> 4

<211> 166

<212> DNA

<213> Listeriaivanovii

 

<400> 4

cgtgcatcgcccatgtgctacggtaagggtctcactttaagtgggctacactaaataatc    60

 

tccgtctggggttagttagaagagcttaatcagactagctgaatggaagcctgttaccgg   120

 

gctgatgtttatgcgaaatgctaatacggtgactacgctcgtagat                  166

 

 

<210> 5

<211> 166

<212> DNA

<213> Listeriasp.

 

<400> 5

cgtgcatcgcccatgtgctacggtaagggtctcactctaagtgggctacactagttaatc    60

 

tccgtctgaggttaaatagaagagcttaatcagactagctgaatggaagcctgttaccgg   120

 

gctgatgtttatgcgaaatgctaatacggtgactacgctcgtagat                  166

 

 

<210> 6

<211> 166

<212> DNA

<213> Listeriagrayi

 

<400> 6

cgtgcatcgcccatgtgctacggtaagggtctcactctaagtgggctacactagttaatc    60

 

tccgtctgaggttaaatagaagagcttaatgagactagctgaatggaagcctgttaccgg   120

 

gctgatgtttatgcgaaatgctaatacggtgactacgctcgtagat                  166

 

 

<210> 7

<211> 166

<212> DNA

<213> Listeriasp.

 

<400> 7

cgtgcatcgcccatgtgctacggaaagggtctcactttaagtgggctacactaaataatc    60

 

tccgtctggggttagttagaagagcttaatcagactagctgaatggaagcctgttaccgg   120

 

gctgatgtttatgcgaaatactaatacggtgactacgctcgtagat                  166

 

 

<210> 8

<211> 166

<212> DNA

<213> Listeriawelshimeri

 

<400> 8

cgtgcatcgcccatgtgctacggtaagggtctcactctaagtgggctacactggctaatc    60

 

tccgtctgaggttagttggaagagcttaatcagactagctgaatggaagcctgttaccgg   120

 

gccgatgtttatgcgaaatgctaatacggtgactacgctcgtagat                  166

Claims (6)

1.一种甄别李斯特菌的实时荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物、Eva Green荧光染料、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-CGTGCATCGCCCATGTGC-3′

下游引物：5′-ATCTACGAGCGTAGTCAC-3′。

2.如权利要求1所述的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒内还包括6种李斯特菌的基因标准品，所述标准品序列如下：

单核细胞增生李斯特菌标准品：cgtgcatcgcc catgtgctac ggtaagggtc tcactctaag tgggctacac tagttaatctccgtctgggg ttaaatagaa gagcttaatc agactagctg aatggaagcc tgttaccggg ccgatgttta tgcgaaatgctaatacggtg actacgctcg tagat；

伊凡诺夫李斯特菌标准品：cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ttaagtgggc tacactaaat aatctccgtctggggttagt tagaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatgctaatacggtgactac gctcgtagat；

无害李斯特菌标准品：cgtgcatcgcc catgtgctac ggtaagggtc tcactctaag tgggctacac tagttaatct ccgtctgaggttaaatagaa gagcttaatc agactagctg aatggaagcc tgttaccggg ctgatgttta tgcgaaatgc taatacggtgactacgctcg tagat；

格氏李斯特菌标准品：cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ctaagtgggc tacactagtt aatctccgtctgaggttaaa tagaagagct taatgagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcgaaatgctaata cggtgactac gctcgtagat；

斯氏李斯特菌标准品：cgtgca tcgcccatgt gctacggaaa gggtctcact ttaagtgggc tacactaaat aatctccgtctggggttagt tagaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatactaatacggtgactac gctcgtagat；

威尔逊李斯特菌标准品：cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ctaagtgggc tacactggct aatctccgtctgaggttagt tggaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggccgat gtttatgcga aatgctaatacggtgactac gctcgtagat。

3.一种甄别李斯特菌的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括：

(1)提取待测样品DNA；

(2)取特异性扩增引物、PCR缓冲液、Eva Green荧光染料、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，分别加入阴性对照品或待测样品DNA配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；

所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-CGTGCATCGCCCATGTGC-3′

下游引物：5′-ATCTACGAGCGTAGTCAC-3′

(3)选择荧光检测模式FAM荧光对应波长，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为李斯特菌阳性。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法进一步将样品DNA的PCR扩增产物从60℃逐步升温到90℃，绘制溶解曲线，根据样品DNA溶解曲线Tm值判断待测样品含有哪种李斯特菌：Tm值在84.59±0.02范围内，判断为单核细胞增生李斯特菌；Tm值在83.67±0.02范围内，判断为伊凡诺夫李斯特菌；Tm值在83.55±0.02范围内，判断为无害李斯特菌；Tm值在86.10±0.02范围内，判断为格氏李斯特菌；Tm值在85.55±0.02范围内，判断为斯氏李斯特菌；Tm值为85.05±0.03范围内，判断为威尔逊李斯特菌。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法同时以梯度浓度的标准品DNA溶液在与样品DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为横坐标、标准品Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照相应菌株标准品的标准曲线，获得样品DNA的拷贝浓度；所述标准品序列如下：

单核细胞增生李斯特菌标准品：cgtgcatcgcc catgtgctac ggtaagggtc tcactctaag tgggctacac tagttaatctccgtctgggg ttaaatagaa gagcttaatc agactagctg aatggaagcc tgttaccggg ccgatgttta tgcgaaatgctaatacggtg actacgctcg tagat；

伊凡诺夫李斯特菌标准品：cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ttaagtgggc tacactaaat aatctccgtctggggttagt tagaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatgctaatacggtgactac gctcgtagat；

无害李斯特菌标准品：cgtgcatcgcc catgtgctac ggtaagggtc tcactctaag tgggctacac tagttaatct ccgtctgaggttaaatagaa gagcttaatc agactagctg aatggaagcc tgttaccggg ctgatgttta tgcgaaatgc taatacggtgactacgctcg tagat；

格氏李斯特菌标准品：cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ctaagtgggc tacactagtt aatctccgtctgaggttaaa tagaagagct taatgagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatgctaatacggtgactac gctcgtagat；

斯氏李斯特菌标准品：cgtgca tcgcccatgt gctacggaaa gggtctcact ttaagtgggc tacactaaat aatctccgtctggggttagt tagaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggctgat gtttatgcga aatactaatacggtgactac gctcgtagat；

威尔逊李斯特菌标准品：cgtgca tcgcccatgt gctacggtaa gggtctcact ctaagtgggc tacactggct aatctccgtctgaggttagt tggaagagct taatcagact agctgaatgg aagcctgtta ccgggccgat gtttatgcga aatgctaatacggtgactac gctcgtagat。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述PCR反应条件如下：

95℃变性2分钟，95℃15秒、60℃45秒，进行40个循环扩增。

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