CN104593516A - 一种恒温快速扩增检测单核细胞增生李斯特菌的方法 - Google Patents

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张明如
丁洪流
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Abstract

本发明提供一种实时荧光定量赖解旋酶恒温核酸扩增检测单核细胞增生李斯特菌的方法。设计对单增李斯特菌具有特异性扩增功能的引物对序列，反应模拟体内DNA在恒温下进行复制的自然过程，利用解旋酶在恒温下解开DNA双链，以单核细胞增生李斯特菌基因组DNA为模板，进行特异性恒温核酸扩增，实现靶序列的指数式增长，建立实时荧光赖解旋酶恒温核酸扩增检测方法，通过基因组DNA的恒温扩增曲线及熔解曲线，分析检测结果，从而快速检测单核细胞增生李斯特菌。该方法克服了传统PCR需要依靠仪器反复升降温来获取单链模板的缺点，原理简明，操作简便，可快速、简单、灵敏、特异的检测食品中的单增李斯特菌。

Description

一种恒温快速扩增检测单核细胞增生李斯特菌的方法
所属技术领域
本发明属于食品安全领域，具体涉及一种食品中单核细胞增生李斯特菌的检测方法。
背景技术
单核细胞增生李斯特氏菌，简称“单增李斯特菌”，为一种革兰氏阳性短小无芽胞杆菌。李斯特菌属有2个群共7个种，其中单核细胞增生李斯特菌是能引起人类疾病的一种重要的食源性致病菌。单增李斯特菌在自然界分布广泛，蔬菜、乳制品、海产品、肉类和禽类等食品都已被证实是其传播的载体，该菌的易感人群主要是孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷者，感染后主要会引起李斯特菌病、败血症、脑膜炎和流产等，致死率高达20％～50％。2000年，世界卫生组织已将单增李斯特菌列为重点检控的食源性致病菌之一。因此，建立快速有效的检测单增李斯特菌的方法变得尤为重要。
目前已建立的单增李斯特菌的检测方法主要包括微生物法、酶联免疫吸收分析法(ELISA)、酶联荧光分析法(ELFA)、聚合酶链式反应(PCR)等。相关的PCR方法从分子水平上检测单增李斯特菌，具有较高的特异性和灵敏度，特别是实时荧光定量PCR法，可以实时监测体系的反应过程，避免了实验过程中EB等致癌物质的污染，因此在检测方法中具有一定的优势。但是反应过程需要昂贵且复杂的仪器，检测成本高，很难实现基层化，在应用范围上受到限制。
最近，恒温核酸扩增方法已日渐成熟，赖解旋酶DNA扩增技术(HDA)是由美国NEB公司研究人员Vincent等于2004年发明的一种新型核酸等温扩增技术，该技术模拟体内DNA在恒温下进行复制的自然过程，在恒温条件下利用生物复制系统的关键组分实现DNA的体外扩增。HDA主要是利用解旋酶在恒温下解开DNA双链，同时DNA单链结合蛋白稳定解开的单链为引物提供结合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互补链。新合成的双链在解旋酶的作用下又解成单链，并作为下一轮合成的模板进入循环扩增反应，最终实现靶序列的指数式增长，克服了传统PCR需要依靠仪器反复升降温来获取单链模板的缺点。因此，有必要建立一种基于实时荧光HDA方法快速检测食品中单增李斯特菌单一致病菌的检测方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种实时荧光HDA方法快速检测食品中单增李斯特菌。本发明采用的技术方案为：选取hly基因作为检测靶基因，自行设计特异性引物；建立实时荧光HDA快速检测单增李斯特菌的新方法；对标准单增李斯特菌菌株及其对照菌株进行活化、增菌培养；热裂解法提取各菌株基因组DNA；以各菌株基因组DNA为模板，以建立好的实时荧光HDA为方法，进行恒温核酸扩增，根据扩增曲线验证实时荧光HDA方法的特异性、灵敏度和最低检测限，最后通过实际样品的检测来确定所建立方法的可行性。
具体步骤为：
(1)引物设计
以hly基因作为检测靶基因，根据单增李斯特菌ATCC19115在GenBank中hly基因的登录号JN703919.1，应用BatchPrimer3设计多对引物，筛选并合成实时荧光HDA的引物对。筛选出的合适的引物对为：上游引物：TCAGTGAGGGGAAAATGCAAGAAG；下游引物：CAGCTTTGCCGAAAAATCTGGAAGG。
(2)实时荧光HDA反应体系
实时荧光HDA反应体系的体积比为：dd H2O 50％，10×Annealing buffer 10％，MgSO44％，NaCl 8％，dNTP Solution 7％，上游引物1.5％，下游引物1.5％，DNA 8％，Enzyme Mix 7％，EvaGreen(20×，Biotium)1％，ROX Reference Dye 50×，2％。
(3)实时荧光HDA反应程序：
65℃恒温2min为一个循环，共计40个循环；熔解曲线阶段根据遵循仪器设置，整个反应过程在实时荧光定量核酸扩增仪上完成。
(4)菌株基因组DNA提取
标准菌株分别购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)和中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)。除了单增李斯特菌以外的其他对照菌株分别是：格氏李斯特菌、英诺克李斯特菌、产气肠杆菌、福氏志后菌、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌。用热裂解法分别提取各菌株基因组DNA。
(5)实时荧光HDA扩增
以各菌株基因组DNA为模板，根据建立的实时荧光HDA反应体系，在引物的作用下进行恒温扩增，通过实时荧光定量核酸扩增仪对扩增过程进行实时监测。分别从引物特异性、扩增方法灵敏度和最低检测限三个方面验证HDA扩增方法的可靠性。
本发明与现有技术相比，其显著优点是：
1)实时荧光HDA反应过程简单且可实时监控，只需要一个恒温的环境和荧光检测体系即可，对反应条件的要求不高。
2)采用优化的实时荧光HDA检测法检测单增李斯特菌，可以大大缩短检测时间，以达到快速检测的目的。
3)该方法对于食品中的单增李斯特菌简单、灵敏、特异性高，样品前处理简单。
附图说明
附图1为：赖解旋酶DNA扩增(HDA)检测单增李斯特菌原理图。附图2为：单核细胞增生李斯特菌引物特异性扩增图：(a)实时荧光HDA扩增，(b)实时荧光PCR扩增。附图3为：单增李斯特菌纯培养灵敏度扩增图，(a)实时荧光HDA扩增，(b)实时荧光PCR扩增。其中，(1)～(7)分别表示菌悬液浓度，依次是：1.2×108、1.2×107、1.2×106、1.2×105、1.2×104、1.2×103、1.2×102，单位CFU/mL。附图4为：人工污染鲜肉中单增李斯特菌最低检测限扩增图，(a)实时荧光HDA扩增，(b)实时荧光PCR扩增。其中，(1)～(4)分别表示菌悬液浓度，依次是：1.2×106、1.2×105、1.2×104、1.2×103，单位CFU/mL。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步地描述：
(1)单增李斯特菌活化及增菌培养。在活化单增李斯特菌前配制好胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA-YE)(1L)：胰胨17g，多价胨3g，酵母膏粉6g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂15g，最终pH 7.3±0.2。121℃高压灭菌15min，冷却至46℃左右制成平板，备用。将配套的单增李斯特菌复苏液滴加到冻干菌种中，滴加量0.3mL左右，用无菌滴管反复吹吸，至冻干菌种溶解成菌悬液为止；用接种环将单增李斯特菌菌悬液接种至TSA-YE平板上，平板置于37℃恒温培养箱倒置培养12h；配制脑-心浸出液肉汤(BHI)培养基(1L)：胰蛋白胨10g，氯化纳5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2g，牛心浸出液500mL，最终pH 7.4±0.2。121℃高压灭菌15min，冷却至46℃左右备用；将生长良好的单增李斯特菌菌落接种至BHI培养基种，摇瓶过夜培养，生长良好的菌悬液用于菌种DNA提取。活化及接种过程在超净工作台无菌环境下进行。
(2)菌株基因组DNA提取。热裂解法提取菌株DNA步骤：取1mL菌悬液于EP管中，12000rpm离心1min，弃上清；取500μL灭菌水吹打沉淀，12000rpm离心1min，弃上清；重复上一步骤；取100μL灭菌水吹打沉淀，沸水浴10min，12000rpm离心1min；取上清至另一EP管，-20℃保存备用。提取到的DNA用酶标仪检测其OD值，判断DNA的质量。
(3)实时荧光HDA法检测单增李斯特菌。根据优化后的实时荧光HDA方法配制反应混合液(不含DNA模板)，短暂离心后分装至PCR管中，分别向每个PCR管添加DNA模板，完整的实时荧光HDA反应体系为25μL，高速离心2min后，置于荧光定量恒温扩增仪中进行实时荧光HDA扩增，扩增程序设置为：65℃2min为一个循环，共40个循环；熔解曲线阶段根据遵循仪器设置，根据扩增曲线及熔解曲线，分析检测结果。反应混合液的配制及体系的分装都在超净工作台中进行。
(4)人工污染鲜肉中单增李斯特菌检测。对试验中用到的新鲜牛肉用国标(GB 4789.30—2010)的方法进行检测，证明不含单增李斯特菌。将增菌培养的单增李斯特菌菌悬液进行10倍梯度稀释，对应的人工污染到牛肉中，具体操作：将市售牛肉进行搅拌，加少些生理盐水进行均质，称取30g样品加入到270mL生理盐水中，混合均匀并分成10份，每等份29mL，进行灭菌。把稀释好的单增李斯特菌菌悬液各取1mL对应的污染到牛肉匀浆液中。提取各梯度污染的肉匀浆DNA，以此作为模板进行实时荧光HDA和PCR试验。
(5)结果显示：单增李斯特菌纯培养HDA方法的最低检测限是1.2×102CFU/mL，PCR方法的最低检测限是1.2×103CFU/mL，所以实时荧光HDA的检测灵敏度要微高于实时荧光PCR，且更易达到稳定期。HDA和PCR对人工污染鲜肉中单增李斯特菌检测浓度均为4×103CFU/mL，无显著差异。

Claims (6)

1.一种实时荧光定量赖解旋酶恒温核酸扩增(HDA)检测单核细胞增生李斯特菌的检测方法，其特征在于：设计对单增李斯特菌具有特异性扩增功能的引物对序列，建立实时荧光HDA检测方法，以单核细胞增生李斯特菌基因组DNA为模板，进行特异性恒温核酸扩增；通过基因组DNA的恒温扩增曲线及熔解曲线，分析检测结果，快速检测单核细胞增生李斯特菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的对单核细胞增生李斯特菌有特异性扩增的引物对序列分别是：上游引物：TCAGTGAGGGGAAAATGCAAGAAG；下游引物：CAGCTTTGCCGAAAAATCTGGAAGG。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的实时荧光HDA检测方法中，引物终浓度为0.15μmol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的实时荧光HDA反应体系中，荧光染料为EvaGreen。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单核细胞增生李斯特菌基因组DNA的提取方法可以是试剂盒法、传统DNA抽提法(酚-氯仿法)、)离子螯合剂(Chelex-l00)抽提法、热裂解法；优选热裂解法。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的定量方法为实时荧光检测，测得相对荧光信号强度的对数log(ΔRn)与扩增循环数(Cycle)建立单核细胞增生李斯特菌的对数曲线关系。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593863A (zh) * 2018-11-28 2019-04-09 江南大学 一种链置换型dna聚合酶诱导等温循环扩增反应检测肉类来源的方法
CN111041114A (zh) * 2015-09-02 2020-04-21 上海产业技术研究院 单核细胞增生李斯特菌核酸快速恒温检测方法及应用
CN113462795A (zh) * 2021-05-31 2021-10-01 浙江大学 一种用于快速检测单核细胞增生李斯特菌的联合检测方法及其系统和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102010913A (zh) * 2010-12-03 2011-04-13 浙江省疾病预防控制中心 一种甄别李斯特菌的实时荧光pcr检测试剂盒及检测方法
CN102121051A (zh) * 2010-01-07 2011-07-13 中华人民共和国舟山出入境检验检疫局 水产品中主要病原菌的多重荧光定量pcr检测方法
CN102876813A (zh) * 2012-10-25 2013-01-16 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 一种检测禽流感病毒的实时荧光rt-hda试剂盒及引物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102121051A (zh) * 2010-01-07 2011-07-13 中华人民共和国舟山出入境检验检疫局 水产品中主要病原菌的多重荧光定量pcr检测方法
CN102010913A (zh) * 2010-12-03 2011-04-13 浙江省疾病预防控制中心 一种甄别李斯特菌的实时荧光pcr检测试剂盒及检测方法
CN102876813A (zh) * 2012-10-25 2013-01-16 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 一种检测禽流感病毒的实时荧光rt-hda试剂盒及引物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张明如等: "实时荧光HDA 法快速检测单核细胞增生李斯特菌", 《食品科学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111041114A (zh) * 2015-09-02 2020-04-21 上海产业技术研究院 单核细胞增生李斯特菌核酸快速恒温检测方法及应用
CN111041114B (zh) * 2015-09-02 2023-03-28 上海产业技术研究院 单核细胞增生李斯特菌核酸快速恒温检测方法及应用
CN109593863A (zh) * 2018-11-28 2019-04-09 江南大学 一种链置换型dna聚合酶诱导等温循环扩增反应检测肉类来源的方法
CN113462795A (zh) * 2021-05-31 2021-10-01 浙江大学 一种用于快速检测单核细胞增生李斯特菌的联合检测方法及其系统和应用

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